一种快速区分柑橘品种的引物和方法

专利名称：一种快速区分柑橘品种的引物和方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学分子标记领域，具体地说涉及一种快速区分柑橘品种的引物和方法。
背景技术：
柑橘属于芸香科果树，包括橘、柑、柚、橙、柠檬等，在世界上主要分布在北纬35° 以南的区域。柑橘属植物一直是我国以及世界主栽的果树树种之一。柑橘属品种资源十分丰富。因此，建立柑橘属品种快速可靠的鉴定技术体系对于苗木早期鉴定、品种权利保护、 生产中品种的区分以及研究柑橘属种质资源的亲缘关系和遗传多样性等具有重要的实际意义。到目前为止，传统单一的形态学品种鉴定方法由于受环境的影响难以有效区分或鉴别众多的品种；另一方面，许多柑橘属育种亲本越来越集中在少数优良品种或品系上，使得所选育的新品种在更多的性状上更加相似，而难以区分。如何有效的鉴定科研和生产中品种，就成为一个常常遇到，而又非常重要的问题。迄今尚没有利用DNA标记进行品种鉴定的快速与高效的措施，也无法形成进行品种鉴定时的依据与参考。因此，品种鉴定就缺乏目的性，非直观，同时随机性太强，工作效率低。为此，开发快速进行品种鉴定的新措施具有重要眉、ο
分子标记是随着分子克隆和重组DNA技术的发展而产生的一类遗传标记。近年来，分子标记技术已被广泛用于蔬菜作物的种质鉴定和指纹分析。由于DNA分析技术不受环境、发育阶段、取样部位的影响，检出的多态位点是无限的，结果具有高度的可靠性，且鉴别力强，重复性高。在常用的RAPD、RFLP, SSR、AFLP等分子标记技术中，RAPD(Rand0m Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)发展历史长，是应用最早的DNA标记技术之一，它以快捷、简便、不易受外界环境影响以及不需要预知基因组序列的特点与优势， 已被广泛应用于品种的分类研究、种质资源的遗传基础研究、基因连锁标记、遗传图谱的构建等方面。
现有RAPD在蔬菜作物的种质鉴定中，多采用计算机软件绘制数字化指纹图谱，并结合统计学软件进行聚类分析，但聚类分析的结果往往无法用于品种鉴别。中国专利“基于基因组RAPD分析的豇豆品种分子鉴定方法”(专利号ZL200510018593. 5)公开了基于RAPD 区分并判断豇豆不同品种的方法，经过筛选得到23个引物，采用0-1指纹技术并构建出聚类树。该专利采用引物较多，在品质鉴定时操作量非常大，不具备时效性，通过聚类树不好判断区分品种的引物，而且不够直观。发明内容
发明目的本发明的目的是提供一种快速区分柑橘品种的引物和方法，用于快速区分、鉴定柑橘品种。
技术方案为了实现上述目的，本发明的一种快速区分柑橘品种的引物包括
Y17 :5， -AGGGGTCTTGG-3，，
Y23 5，-GGACCCAACCG-3，，
Y28 5 ’ -GTGTGCCCCAT-3’，
Y40 5，-AGCGTCCTCCT-3，，
Y41 :5，-AGCGTCCTCCG-3，，
Y47 5，-ACGACCGACAG-3，，
Y54 5，-TGGTGGCGTTC-3，，
Y55 5' -ACCCCCGACTT-3’，
Y59 5，-ACCCCCGACTG-3，，
Y60 5，-ACCCCCGACTC-3，，
1S2 :5， -GGGTAACGCCA-3，，
1S3 :5， -GGGTAACGCCT-3，，
1S4 :5，-GGGTAACGCCT-3，，
5S2 5，-CCGCTACCGAA-3，，
5S5 5 ’ -CCGCTACCGAG-3’，
A5 :5， -GTCCACACGGT-3，；
由于RAPD扩增自身的特点，对随机引物的设计显得尤为重要。一般RAPD的引物为9 10个碱基，理论上，引物越短，模板序列两端与引物互补的位点数量越多，扩增的PCR 多态性丰富；但是，引物较短，也会引起模板互补配对稳定性低的问题。本发明采用11碱基的引物，可提高RAPD反应的稳定性。
另外，引物的退火温度也非常重要，因此本发明在设计若干随机引物后要对引物进行严格的筛选。所述引物是通过设计的随机引物经3次梯度PCR筛选出条带清晰、PCR产物重复出现的引物。引物要选择扩增性强、稳定性高、多态性好的随机引物，满足用于分析基因组多态性的引物要求。
⑶；
(5)；
(3)利用引物Y40对A组的DNA进行RAPD扩增，若在550bp出现特征性谱带且 650bp无特征性谱带则归为Al组，进入步骤(31)；若在550bp和650bp都无特征性谱带则归为A2组，进入步骤(3 ；若在1400bp无特征性谱带，柑橘品种‘解橙’被区分出来；若在 650bp出现特征性谱带，柑橘品种‘不知火’被区分出来；
(31)利用引物5S2对Al组的DNA进行RAPD扩增，若在600bp无特征性谱带，柑橘品种‘脐白橙’被区分出来；若在600bp出现特征性谱带，柑橘品种‘甜香橙’被区分出来；
(32)利用引物Y41对A2组的DNA进行RAPD扩增，若在1400bp出现特征性谱带则归为A2-1组，进入步骤(321)；若在1400bp无特征性谱带，柑橘品种‘伴野’被区分出来；对于利用上述引物快速鉴定区分柑橘品种的方法，包括如下步骤 (1)提取需要进行鉴定区分的柑橘DNA，稀释备用； ⑵利用引物1S3对柑橘DNA进行RAPD扩增，若在480bp、600bp出现特征性谱带且550bp无特征性谱带则归为A组，进入步骤若在480bp、550bp、600bp都出现特征性谱带则归为B组，进入步骤(4)； 若在480bp、550bp出现特征性谱带且600bp无特征性谱带则归为C组，进入步骤
(321)利用引物A5对A2-1组的DNA进行RAPD扩增，若在IOOObp无特征性谱带， 柑橘品种‘立间’被区分出来；若在IOOObp出现特征性谱带，柑橘品种‘香橙’被区分出来；
(4)利用引物Y40对B组的DNA进行RAPD扩增，若在550bp和600bp都出现特征性谱带且950bp无特征性谱带则归为Bl组，进入步骤；若在550bp和600bp都无特征性谱带则归为B2组，进入步骤0 ；若在600bp和950bp出现特征性谱带且550bp无特征性谱带则归为B3组，进入步骤；若在550bp、600bp、950bp都出现特征性谱带则归为B4 组，进入步骤G4)；若在600bp出现特征性谱带且550bp、950bp无特征性谱带，柑橘品种 ‘早红’被区分出来；若在600bp、1100bp出现特征性谱带，柑橘品种‘上野’被区分出来；若在550bp出现特征性谱带且600bp、950bp无特征性谱带，柑橘品种‘代代，被区分出来；
(41)利用引物Y59对Bl组的DNA进行RAPD扩增，若在1800bp出现特征性谱带则归为Bl-I组，进入步骤Gll)；若在ISOObp无特征性谱带，柑橘品种‘桥本’被区分出来；
(411)利用引物Y17对Bl-I组的DNA进行RAPD扩增，若在IOOObp出现特征性谱带，柑橘品种‘日杂’被区分出来；若在IOOObp无特征性谱带，柑橘品种‘立间’被区分出来；
(42)利用引物Y55对B2组的DNA进行RAPD扩增，若在300bp、;350bp、1200bp都出现特征性谱带，柑橘品种‘粗皮’被区分出来；若在450bp、750bp都出现特征性谱带，柑橘品种‘南柑’被区分出来；若在450bp出现特征性谱带且750bp无特征性谱带，柑橘品种湳丰蜜桔’被区分出来；若在300bp出现特征性谱带，在350bp、1200bp未同时出现特征性谱带的话，归为B2-1组，进入步骤(421)；若在450bp、1200bp都无特征性谱带则归为B2-2组， 进入步骤022)；
(421)利用引物Y^对B2-1组的DNA进行RAPD扩增，若在^OObp出现特征性谱带则归为B2-11组，进入步骤0211)；若在^OObp无特征性谱带则归为B2-12组，进入步骤(4212)；
(4211)利用引物5S5对B2-11组的DNA进行RAPD扩增，若在850bp出现特征性谱带，且在750bp或1200bp无特征性谱带，品种‘HB柚’被区分出来；若在850bp、1200bp都出现特征性谱带，品种‘原野’被区分出来；若在750bp、850bp都出现特征性谱带，品种‘久能’被区分出来；若在850bp、1200bp都无特征性谱带，品种‘大葯’被区分出来；若在850bp、 ISOObp都出现特征性谱带，再利用引物1S2进行RAPD扩增，若在1300bp出现特征性谱带则为‘料红’；若在1300bp无特征性谱带则为‘上下红’；
(4212)利用引物1S2对B2-12组的DNA进行RAPD扩增，若在1300bp出现特征性谱带，品种‘栊柑1号’被区分出来；若在900bp出现特征性谱带，品种‘青见’被区分出来； 若在1300bp和900bp都无特征性谱带，品种‘市人’被区分出来；
(422)利用引物1S4对B2-2组的DNA进行RAPD扩增，若在750bp出现特征性谱带，品种‘本早6号’被区分出来；若在750bp无特征性谱带，品种‘橙柑3号’被区分出来；
(43)利用引物Y59对B3组的DNA进行RAPD扩增，若在1800bp有特征性谱带则归为B3-1组，进入步骤(431)；若在ISOObp无特征性谱带则归为B3-2组，进入步骤(432)；
(431)利用引物Y17对B3-1组的DNA进行RAPD扩增，若在1000bp、450bp都有特征性谱带，品种‘扁红柠檬’被区分出来；若在250bp、600bp都没有特征性谱带，品种‘黄皮’ 被区分出来；若在600bp有特征性谱带，品种‘甘夏’被区分出来；若在1800bp、450bp都没有特征性谱带，品种‘砂糖桔’被区分出来；若在450bp有特征性谱带且IOOObp无特征性谱带则归为一类，再用引物Y47进行扩增，如果在ISOObp有特征性谱带则为品种‘英利曼I’， 如果在ISOObp无特征性谱带则为品种‘立间’；
(432)利用引物Y60对B3-2组的DNA进行RAPD扩增，若在750bp有特征性谱带， 品种‘晚白柚’被区分出来；若在SOObp有特征性谱带，品种‘橙柑3号’被区分出来；若在 750bp、850bp都没有特征性谱带，品种‘西山大桔’被区分出来；
(44)利用引物Y59对B4组的DNA进行RAPD扩增，若在1200bp、1800bp都有特征性谱带则归为B4-1组，进入步骤041)；若在ISOObp出现特征性谱带且1200bp无特征性谱带则归为B4-2组，进入步骤042)；若在1200bp和ISOObp都无特征性谱带，品种‘福桔’ 被区分出来；
(441)利用引物Y17对B4-1组的DNA进行RAPD扩增，若在200bp和IOOObp都出现特征性谱带，再利用引物YM进行扩增，若在ieoobp出现特征性谱带则为品种‘甜橙柚’， 若在1600bp无特征性谱带则为品种‘国庆4号’；若在200bp出现特征性谱带且在IOOObp 无特征性谱带，再利用引物Y23进行扩增，若在350bp出现特征性谱带则为品种‘米津’，若在650bp出现特征性谱带则为品种‘青鸟’，若在350bp、650bp都无特征性谱带则为品种‘三保’；若在IOOObp出现特征性谱带且200bp无特征性谱带，品种‘兴津3号’被区分出来；若在IOOObp无特征性谱带，品种‘北口’被区分出来；
(442)利用弓丨物Y23对B4-2组的DNA进行RAPD扩增，若在250bp出现特征性谱带，品种‘国庆5号’被区分出来；若在250bp无特征性谱带，品种‘温柑3号’被区分出来；(5)利用引物Y40对C组的DNA进行RAPD扩增，若在650bp出现特征性谱带，品种被区分出来；若在650bp无特征性谱带，品种‘胡柚’被区分出来。 该方法的RAPD扩增为30 μ 1的PCR反应体系，包括10XPCR Buffer 3 μ 1， 2. 5mmol/LdNTPs 2· 4 μ 1，25mmol/LMgCl2l. 8 μ 1，1. ZSUiTaq 酶，随机引物 lOpmol/μΙ 1. 2μ 1，模板DNA40 50ng ；反应于95°C预变性3min ；94°C变性30s,复性lmin，72°C延伸 2min，42 个循环；72°C延伸 IOmin0
所述RAPD扩增反应中各引物的退火温度如下表所示
‘小文旦’
引物退火温度/°c引物退火温度/°cY1741.7Y5942.8Y2342.8Y6042.8Y2842.81S243.7Y4042.81S344.8Y4141.71S444.8Y4741.75S244.8Y5443.75S544.8Y5542.8A542.8
须知，这里的退火温度指复性时的退火温度。
本发明通过16个引物就可对48个柑橘品种进行区分和鉴定，为了清晰、完整地表示鉴定采用的引物和鉴别出的品种，同时为了方便他人对柑橘品种进行区分、鉴定，本发明还建立了“树型鉴别图”。所述树型鉴别图是基于PCR扩增后的谱带形态统计出的结果，树型鉴别图以引物作为节点，节点后是该引物对不同品种的区分结果，包括区分出的类别或者直接区分出来的品种，在节点后的分支还标记了不同结果相互区分的依据，即谱带之间的区别。例如:650bp (+)表示在650bp有特征性谱带；1200bp (-)表示在1200bp无特征性谱带。为了方便树型鉴别图的使用，将48个品种的柑橘用编号标记如表1所示，“树型鉴别图”请参考“说明书附图”中的

图1。
表148个柑橘品种名称及对应编号
权利要求
1.一种快速区分柑橘品种的引物，其特征在于包括 Y17 :5’ -AGGGGTCTTGG-3，，Y23 :5’ -GGACCCAACCG-3，， Y28 :5’ -GTGTGCCCCAT-3，， Y40 :5’ -AGCGTCCTCCT-3，， Y41 :5’ -AGCGTCCTCCG-3，， Y47 :5’ -ACGACCGACAG-3，， Y54 :5’ -TGGTGGCGTTC-3，， Y55 :5’ -ACCCCCGACTT-3，， Y59 :5’ -ACCCCCGACTG-3，， Y60 :5’ -ACCCCCGACTC-3，，152:5’ -GGGTAACGCCA-3，，153:5’ -GGGTAACGCCT-3，，154:5’ -GGGTAACGCCT-3，， 5S2 :5’ -CCGCTACCGAA-3，， 5S5 :5’ -CCGCTACCGAG-3，， A5 5' -GTCCACACGGT-3'；
2.根据权利要求1所述的一种快速区分柑橘品种的引物，其特征在于，所述引物是通过针对柑橘基因组设计的随机引物经3次梯度PCR筛选出条带清晰、PCR产物重复出现的引物。
3.一种利用权利要求1所述引物快速鉴定区分柑橘品种的方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)提取需要进行鉴定区分的柑橘DNA，稀释备用；(2)利用引物1S3对柑橘DNA进行RAPD扩增，若在480bp、600bp出现特征性谱带且550bp无特征性谱带则归为A组，进入步骤(3)； 若在480bp、550bp、600bp都出现特征性谱带则归为B组，进入步骤(4)； 若在480bp、550bp出现特征性谱带且600bp无特征性谱带则归为C组，进入步骤(5)；(3)利用引物Y40对A组的DNA进行RAPD扩增，若在550bp出现特征性谱带且650bp无特征性谱带则归为Al组，进入步骤(31)； 若在550bp和650bp都无特征性谱带则归为A2组，进入步骤(32)； 若在1400bp无特征性谱带，柑橘品种‘解橙’被区分出来； 若在650bp出现特征性谱带，柑橘品种‘不知火’被区分出来；(31)利用引物5S2对Al组的DNA进行RAPD扩增，若在600bp无特征性谱带，柑橘品种‘脐白橙’被区分出来； 若在600bp出现特征性谱带，柑橘品种‘甜香橙’被区分出来；(32)利用引物Y41对A2组的DNA进行RAPD扩增，若在1400bp出现特征性谱带则归为A2-1组，进入步骤(321)； 若在1400bp无特征性谱带，柑橘品种‘伴野’被区分出来； (321)利用引物A5对A2-1组的DNA进行RAPD扩增，若在IOOObp无特征性谱带，柑橘品种‘立间’被区分出来； 若在IOOObp出现特征性谱带，柑橘品种‘香橙’被区分出来； (4)利用引物Y40对B组的DNA进行RAPD扩增，若在550bp和600bp都出现特征性谱带且950bp无特征性谱带则归为Bl组，进入步骤 (41)；若在550bp和600bp都无特征性谱带则归为B2组，进入步骤02)； 若在600bp和950bp出现特征性谱带且550bp无特征性谱带则归为B3组，进入步骤 (43)；若在550bp、600bp、950bp都出现特征性谱带则归为B4组，进入步骤04)； 若在600bp出现特征性谱带且550bp、950bp无特征性谱带，柑橘品种‘早红，被区分出来；若在600bp、1100bp出现特征性谱带，柑橘品种‘上野’被区分出来；若在550bp出现特征性谱带且600bp、950bp无特征性谱带，柑橘品种‘代代，被区分出来；(41)利用引物Y59对Bl组的DNA进行RAPD扩增，若在ISOObp出现特征性谱带则归为Bl-I组，进入步骤011)； 若在ISOObp无特征性谱带，柑橘品种‘桥本’被区分出来； (411)利用引物Y17对Bl-I组的DNA进行RAPD扩增， 若在IOOObp出现特征性谱带，柑橘品种‘日杂’被区分出来； 若在IOOObp无特征性谱带，柑橘品种‘立间’被区分出来；(42)利用引物Y55对B2组的DNA进行RAPD扩增，若在300bp、350bp、1200bp都出现特征性谱带，柑橘品种‘粗皮，被区分出来；若在450bp、750bp都出现特征性谱带，柑橘品种‘南柑’被区分出来；若在450bp出现特征性谱带且750bp无特征性谱带，柑橘品种‘南丰蜜桔’被区分出来；若在300bp出现特征性谱带，在350bp、1200bp未同时出现特征性谱带的话，归为B2-1 组，进入步骤G21)；若在450bp、1200bp都无特征性谱带则归为B2-2组，进入步骤022)； (421)利用引物Y28对B2-1组的DNA进行RAPD扩增， 若在^OObp出现特征性谱带则归为B2-11组，进入步骤0211)； 若在^OObp无特征性谱带则归为B2-12组，进入步骤0212)； (4211)利用引物5S5对B2-11组的DNA进行RAPD扩增，若在850bp出现特征性谱带，且在750bp或1200bp无特征性谱带，品种‘HB柚，被区分出来；若在850bp、1200bp都出现特征性谱带，品种‘原野’被区分出来； 若在750bp、850bp都出现特征性谱带，品种‘久能’被区分出来； 若在850bp、1200bp都无特征性谱带，品种‘大葯’被区分出来； 若在850bp、1800bp都出现特征性谱带，再利用引物1S2进行RAPD扩增，若在1300bp 出现特征性谱带则为‘料红’；若在1300bp无特征性谱带则为‘上下红’；(4212)利用引物1S2对B2-12组的DNA进行RAPD扩增， 若在1300bp出现特征性谱带，品种‘栊柑1号’被区分出来； 若在900bp出现特征性谱带，品种‘青见’被区分出来； 若在1300bp和900bp都无特征性谱带，品种‘市人’被区分出来； (422)利用引物1S4对B2-2组的DNA进行RAPD扩增， 若在750bp出现特征性谱带，品种‘本早6号’被区分出来； 若在750bp无特征性谱带，品种‘橙柑3号’被区分出来；(43)利用引物Y59对B3组的DNA进行RAPD扩增，若在ISOObp有特征性谱带则归为B3-1组，进入步骤031)； 若在ISOObp无特征性谱带则归为B3-2组，进入步骤032)；(431)利用引物Y17对B3-1组的DNA进行RAPD扩增，若在1000bp、450bp都有特征性谱带，品种‘扁红柠檬’被区分出来； 若在250bp、600bp都没有特征性谱带，品种‘黄皮’被区分出来； 若在600bp有特征性谱带，品种‘甘夏’被区分出来； 若在1800bp、450bp都没有特征性谱带，品种‘砂糖桔’被区分出来； 若在450bp有特征性谱带且IOOObp无特征性谱带则归为一类，再用引物Y47进行扩增，如果在ISOObp有特征性谱带则为品种‘英利曼I’，如果在ISOObp无特征性谱带则为品种‘立间’；(432)利用引物Y60对B3-2组的DNA进行RAPD扩增， 若在750bp有特征性谱带，品种‘晚白柚’被区分出来； 若在SOObp有特征性谱带，品种‘橙柑3号’被区分出来；若在750bp、850bp都没有特征性谱带，品种‘西山大桔’被区分出来；(44)利用引物Y59对B4组的DNA进行RAPD扩增，若在1200bp、1800bp都有特征性谱带则归为B4-1组，进入步骤041)；若在ISOObp出现特征性谱带且1200bp无特征性谱带则归为B4-2组，进入步骤042)；若在1200bp和ISOObp都无特征性谱带，品种‘福桔’被区分出来；(441)利用引物Y17对B4-1组的DNA进行RAPD扩增，若在200bp和IOOObp都出现特征性谱带，再利用引物YM进行扩增，若在1600bp出现特征性谱带则为品种‘甜橙柚’，若在I600bp无特征性谱带则为品种‘国庆4号’；若在200bp出现特征性谱带且在IOOObp无特征性谱带，再利用引物Y23进行扩增，若在350bp出现特征性谱带则为品种‘米津’，若在650bp出现特征性谱带则为品种‘青鸟’， 若在350bp、650bp都无特征性谱带则为品种‘三保，；若在IOOObp出现特征性谱带且200bp无特征性谱带，品种‘兴津3号’被区分出来； 若在IOOObp无特征性谱带，品种‘北口’被区分出来；(442)利用引物Y23对B4-2组的DNA进行RAPD扩增， 若在250bp出现特征性谱带，品种‘国庆5号’被区分出来； 若在250bp无特征性谱带，品种‘温柑3号’被区分出来；(5)利用引物Y40对C组的DNA进行RAPD扩增，若在650bp出现特征性谱带，品种‘小文旦’被区分出来；若在650bp无特征性谱带，品种‘胡柚’被区分出来。
4.根据权利要求3所述的一种快速鉴定区分柑橘品种的方法，其特征在于该方法的 RAPD扩增为 30μ 1 的PCR 反应体系，包括 10XPCR Buffer 3 μ 1,2. 5mmol/L dNTPs2. 4 μ 1, 25mmo VLMgCl2 1· 8 μ 1，1. 25UTaq 酶，随机引物 lOpmol/μ 1 1. 2 μ 1，模板 DNA40 50ng ； 反应于95°C预变性3min ；94°C变性30s,复性lmin，72°C延伸2min，42个循环；72°C延伸 IOmin0
5.根据权利要求4所述的一种快速鉴定区分柑橘品种的方法，其特征在于所述RAPD 扩增反应中各引物的退火温度如下表所示
全文摘要
本发明公开了一种快速区分柑橘品种的引物和方法，属于分子生物学分子标记领域，本发明针对柑橘的基因序列设计RAPD随机引物，经筛选后得到16个随机引物；提取若干柑橘品种的DNA，稀释备用；逐个利用随机引物扩增未知柑橘品种的DNA，将得到的具有唯一特异性谱带的品种区分出来，建立树型鉴别图。本发明通过几次PCR就能够将48个柑橘品种在分子水平上区分开，并在一定程度上体现了利用11碱基的引物进行RAPD分子标记在植物品种鉴定上具有实用性，所得的树型鉴别图比聚类树更具直观性，即根据品种鉴定图就可以找出能区分任意两个品种的引物，该方法可以实现柑橘苗木的早期鉴定，在其他物种上也具有广泛的通用性。
文档编号C12N15/11GK102492774SQ20111040772
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月9日 优先权日2011年12月9日
发明者孙欣, 宋长年, 张晓莹, 李晓颖, 王化坤, 王西成 申请人:南京农业大学