专利名称：一种来源于黄瓜的联乙烯还原酶及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种来源于黄瓜的蛋白作为联乙烯还原酶的应用，特别涉及由序列表中序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质在转化联乙烯叶绿素酸酯a为单乙烯叶绿素酸酯a 中的应用。
背景技术：
叶绿素是植物进行光合作用的重要色素，它的作用是捕获光能并将光能转移到反应中心，故对植物的生长及其产量有很重要的作用。根据乙烯侧链数目的不同，叶绿素可分为3，8_联乙烯叶绿素(DV Chls)和3-乙烯叶绿素(单乙烯叶绿素，MV Chls)。在正常情况下，几乎所有的植物和细菌用于光合作用的叶绿素都是MV chls,目前只发现一类海洋生物艮f]“the marine prochlorophyte Prochlorococcus marinus，，利用的是 DVChls (Chisholm SW, Frankel SL, Goericke R， Olson RJ, Palenik B， Waterbury JB, West-Johnsrud L， Zettler ER(1992)Prochlorococcus marinus nov. gen. nov.sp. :A marine prokaryote containing divinylchlorophyll a and b. Arch. Microbiol 157:297-300·)。
叶绿素生物合成的多样性主要在于它有单乙烯叶绿素(MV Chls)和联乙烯叶绿素(DV Chls)两条平行合成的途径，DV Chls及其中间产物通过联乙烯基还原酶(DVR， 又叫C-8乙烯基还原酶)催化转化成MV Chls及其中间产物(Rebeiz CA，Kolossov VL, Briskin D，Gawienowski M(2003)Chloroplast biogenesis :chlorophyll biosynthetic heterogeneity, multiple biosynthetic routes， and biological spin—oVs， in H. S. Nalwa(Ed.), Handbook of Photochemistry and Photobiology, vol.4, American ScientiWciLos Angeles :183-248.)。迄今为止，已在5种底物水平上检测到联乙烯还原酶活性，分别是联乙烯Mg-原卟啉IX(DV Mg-proto)、联乙烯Mg-原卟啉IX单甲酯(DV MPE). 联乙烯原叶绿素酸酯a(DV Pchlide a)、联乙烯叶绿素酸酯a(DV Chlide a)和联乙烯叶绿素 a(DV Chl a) (Kolossov VL, Bohnert HJ, Rebeiz CA(2006)Chloroplast biogenesis 92 :In situ screening for divinyl chlorophyll (ide)a reductase mutants by spectroXuorometry. Analytical Biochemistry 348:192—197)。禾g，Mlt^f、參录硫细菌Chlorobium t印idum和蓝细菌Synechocystis sp. PCC6803中分别克隆了相应的联乙烯还原酶基因 DVR、bciA 和 slrl923 (Wang PR，Gao JX，Wan CM，Zhang FT，Xu ZJ，Huang XQ,Sun XQiDeng XJ(2010)Divinyl chlorophyll (ide)a can be converted to monovinyl chlorophyll(ide)a by a divinyl reductase in rice. Plant Physiol 153,994-1003 ； Nagata N，Tanaka R，Satoh S，Tanaka A(2005) Identification of a Vinyl Reductase Gene for Chlorophyll Synthesis in Arabidopsis thaliana and Implications for the Evolution of Prochlorococcus Species.Plant Cell 17，233-240 ；Chew AGM, Bryant DA(2007)Characterization of a Plant-like Protochlorophy11ide a Divinyl Reductase in Green Sulfur Bacteria. J. Biol. Chem 28 :2967-2975 ；Islam MR，Aikawa S，Midorikawa T，Kashino Y，Satoh K，Koike H(2008)sir1923 of Synechocystissp.PCC6803 Is Essential for Conversion of 3,8-Divinyl (proto)chlorophyll(ide) to 3-Monovinyl (proto) chlorophyll (ide). Plant Physiology 148:1068-1081)。已有实验证明用NADPH作为还原剂，重组的绿硫细菌(Chlorobium t印idum)BciA蛋白质将 DV Pchlide a 还原成 MV Pchlide a (Chew AGM, Bryant DA (2007) Characterization of a Plant-like Protochlorophy11ide a Divinyl Reductase in Green Sulfur Bacteria. J. Biol. Chem 28 :2967-2975)；重组的拟南芥 DVR 蛋白质将 DVChlide a 还原成 MV Chlide a，但不能将DV Pchlide a、DV Chlide b、DV Chl a和DV Chlb等4种DV物质转化为相应的 MV 物质(Nagata N, Tanaka R, Tanaka A(2007) The Major Route for Chlorophyll Synthesis Includes[3,8-divinyl]-chlorophyllide a Reduction in Arabidopsis thaiiana. Plant Cell Physiol 48:1803-1808)。我们通过酶学实验证实重组的水稻 DVR蛋白质不仅能将DV Chlide a还原成MV Chlide a，而且能还原DV Chl a为MV Chl a (Wang PR, Gao JX, Wan CM, Zhang FT, Xu ZJ, Huang XQ, Sun XQ, Deng XJ (2010)Divinyl chlorophyll(ide)a can be converted to monovinyl chlorophyll(ide)a by a divinyl reductase in rice. Plant Physiol 153，994-1003)。目前不清楚的是，这些联乙烯中间物质是由一个具有广泛特异性的联乙烯基还原酶催化，还是由多个联乙烯基还原酶(每个酶都有特异底物)催化生成相应的单乙烯物质。发明内容
本发明的目的是提供一种来源于黄瓜(Cucumis sativus L.)的蛋白质的新用途。 该蛋白质由序列表中序列2所示氨基酸序列组成。
本发明所提供的新用途具体为由序列表中序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质在作为联乙烯还原酶中的应用。
在上述应用中，所述联乙烯还原酶能将联乙烯叶绿素酸酯a转化为单乙烯叶绿素酸酯a ；所述蛋白质的编码序列为序列表中序列1。
由序列表中序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质在转化联乙烯叶绿素酸酯a为单乙烯叶绿素酸酯a中的应用也属于本发明的保护范围。
在上述应用中，所述蛋白质的编码序列为序列表中序列1。
实验证明，由序列表中序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质具有联乙烯还原酶活性，能够将联乙烯叶绿素酸酯a转化为单乙烯叶绿素酸酯a。
图1为CsDVR酶学反应产物的HPLC检测光谱图。其中，A和B的左侧图分别是反应IOmin的产物在440nm和410nm检测到的HPLC色谱图，右侧图均是每个峰的吸收光谱。 A代表底物为联乙烯叶绿素酸酯a(DV Chlide a)的酶学反应产物的HPLC检测光谱图。B 代表底物为联乙烯叶绿素a(DV Chl a)的酶学反应产物的HPLC检测光谱图。具体的，Al 和A2分别是联乙烯叶绿素酸酯a (DV Chlide a)和单乙烯叶绿素酸酯a (MV Chlide a)。Bl 和B2分别是联乙烯叶绿素a (DV Chl a)和单乙烯叶绿素a (MV Chl a)。A3和B3分别是DV Chlide a与BL21/pET-30a(+)空载体反应后的色素(阴性对照)，以及DV Chla与BL21/ pET-30a(+)空载体反应后的色素(阴性对照)；A4是联乙烯叶绿素酸酯a(DV Chlide a)与BL21/pET-30a(+)-CsDVR大肠杆菌裂解液反应后的色素，B4是联乙烯叶绿素a(DV Chl a) 与BL21/pET-30a(+)-CsDVR大肠杆菌裂解液反应后的色素。AO(空白对照)是用茼蒿叶片制备的丙酮粉中残留的MV-Chl a经温育后产生的MV-Chlide a ；Al和A3中的弱峰(峰2) 即是从丙酮粉中残留的MV-Chl a转化而来的MV-Chlide a。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、黄瓜联乙烯还原酶基因的克隆及其编码蛋白的功能验证
一、黄瓜联乙烯还原酶基因的克隆
以黄瓜序列 Csa000053 的 DNA 序列(http //cucumber, genomics, org. cn)设计以下引物
CsDVR-F :5，-GAGGATCCATGTCCATTTGCTCCACCGTT-3‘(下划线处为 BamH I 酶切位占)
CsDVR-R 5’ -ACCGAGCTCAAAAAACGCTCTGTTCACC-3’ (下划线处为 c I 酶切位点)
以黄瓜(Cucumis sativus L.)品种“皇优八号”(从农贸市场种子摊商购买)叶片提取的基因组DNA为模板，用引物CsDVR-F和CsDVR-R进行PCR扩增，得到1260bp的片段， 将该片段连接在pMD-18-T (TaKaRa)载体上，构建成pMD_CsDVR，然后转化到大肠杆菌JM109 菌株中，筛选阳性克隆后测序。测序结果表明扩增得到的片段具有序列表中序列1所示的序列，将其命名为CsDVR。序列1所示序列即为CsDVR基因的编码序列，它编码得到序列表中序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质，将该蛋白质命名为CsDVR。
二、黄瓜联乙烯还原酶基因编码蛋白的获得及其功能验证
1、重组表达载体pET_30a (+) -CsDVR的构建
将经步骤一测序鉴定正确的pMD-CsDVR载体用BamHI和Me I双酶切，连接到经同样酶切过的表达载体pET-30a(+) (Novagen，产品目录号69909- 上，构成重组表达载体 pET-30a(+)-CsDVRo
2、诱导表达
将步骤1的重组表达载体pET_30a(+)-CsDVR转化到大肠杆菌菌株BL21 (同时设置pET-30a(+)空载体转化到大肠杆菌菌株BL21的对照)，在37°C，LB/kan培养基上过夜培养，挑选单克隆于371，1^/1 111培养液中振荡培养，提取质粒0嫩(01^64试剂盒)，用8膽!1 I 和Mc I双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测CsDVR基因是否插入载体pET-30a(+)中，将检测含有CsDVR基因的重组表达载体的克隆送上海英骏公司测序，将筛选正确插入pET-30a(+)的 CsDVR基因的重组表达载体的克隆命名为BL21/pET-30a(+)-CsDVR。转入pET_30a(+)空载体的大肠杆菌菌株BL21命名为BL21/pET-30a(+)。然后参照(NagataN，Tanaka R, Satoh S, TanakaA(2005)Identification of a vinyl reductase gene for chlorophyll synthesis in Arabidopsis thaliana and implications for the evolution of Prochlorococcus Species. Plant Cell 17:233-240)的方法将 BL21/pET_30a(+)-CsDVR 进行诱导表达，具体方法如下分别挑选BL21/pET-30a (+) -CsDVR和含有空载体pET-30a (+)的BL21 (空载体对照CK)单克隆于20°C，LB/kan培养液中振荡培养一夜，分别取Iml菌液于IOOmlLB/kan培养液，30°C振荡培养30min后加入异丙基硫代- β -半乳糖苷(IPTG)，终浓度为 0. 5mM,于30°C诱导培养7h，4°C IOOOOrpm离心IOmin,沉淀用含有6. 7 μ g · πιΓ1溶菌酶禾口 3. 3 μ g · IIir1DNaseI的50mM的Tris-HCl的溶液悬浮，溶解产物放入_20°C冰箱保存。
用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表达的蛋白质。结果显示，在约46kD处，BL21/ pET-30a (+) -CsDVR有明显的蛋白质条带，而空载体对照CK没有，说明CsDVR基因在BL21中表达了蛋白质CsDVR，并且蛋白质的分子量与预期结果相一致。
3、酶促反应验证蛋白功能
此步骤所用底物涉及如下两种联乙烯叶绿素a(DV Chl a)和联乙烯叶绿素酸酯 a(DV Chlide a)。
这两种底物通过如下方法获得联乙烯叶绿素a(DV Chl a)从水稻824ys突变体 (黄晓群，王平荣，赵海新，邓晓建.一个新的水稻叶绿素缺失突变基因的遗传分析与分子标记定位.中国水稻科学，2007，21 ) :355-359 ；Wang PR, Gao JX, Wan CM, Zhang FT, Xu ZJ, Huang XQ,Sun XQ, Deng XJ(2010)Divinyl chlorophyll(ide)a can be converted to monovinyl chlorophyll(ide)a by a divinyl reductase in rice. Plant Physiol 153, 994-1003)叶绿素中分离，用100%丙酮从824ys突变体新鲜叶片组织中浸提叶绿素，提取液10000r/min (Eppendorf 5804R)离心15min，上清液在氮气下吹干，重溶于100%丙酮。然后用(18柱0. 6mm i. d. X 150mm long ；5 μ m, Agilent,U. S. Α)进行 HPLC 分离，洗脱条件是流动相甲醇乙腈丙酮=1 3 1，40°〇，流速1.0111171^11，上样量5“1^柱中洗脱的色素用660nm波长监测，在相应保留时间收集DV Chl a，具体参见Wang等在Wang PR, Gao JX, Wan CM, Zhang FT, Xu ZJ, Huang XQ，Sun XQ, Deng XJ(2010)Divinyl chlorophyll(ide)a can be converted to monovinyl chlorophyll(ide)a by a divinyl reductase in rice. Plant Physiol 153，994-1003 中记载的方法。
联乙烯叶绿素酸酯a(DV Chlide a)是用上述分离的联乙烯叶绿素a(DV Chl a) 与从茼蒿叶片制备的丙酮粉中的叶绿素酶反应所得。
其中，丙酮粉(叶绿素酶)的制备方法如下按照Ito等(Ito H，Takaichi S， Tsuji H, Tanaka A. Properties of synthesis of chlorophyll a from chlorophyll b in cucumber etioplasts. J Biol Chem, 1994,269 :22034-22038)的方法，用茼蒿 (Garland chrysanthemum)(品种为“清香茼蒿”，从农贸市场种子摊商购买)叶片制备丙酮粉，具体为取15g新鲜茼蒿叶片，加入300mL冷冻的丙酮，放入组织捣碎机中快速捣碎， 40C lOOOOr/min离心lOmin，弃上清液；然后用丙酮冲洗沉淀，直到叶绿素完全洗净为止；最后将沉淀置于减压真空离心机中吹干制得丙酮粉。
DV Chlide a 的制备方法如下按照 Holden(Holden M. The breakdown of chlorophyll by chlorophyllase. Biochem J，1961，78 :359-364)和 Ito等(Ito H,Ohtsuka Τ, Tanaka A. Conversion of chlorophyll b to chlorophyll a via 7-hydroxymethyl chlorophyll. J Biol Chem，1996，271 :1475-1479)的方法，用 200 μ g 联乙烯叶绿素 a(DV Chl a)(上述经HPLC分离所得到的DV-Chl a)溶解于4mL溶液(25mM Tris-HCl, pH 7.5 和40%丙酮)中，与200mg丙酮粉在观！、黑暗条件下温育池，温育后按照Ito等(Ito H, Tanaka Y, Tsuji H, Tanaka A. Conversion of chlorophyll b to chlorophyll a by isolated cucumber etioplasts. Arch Biochem Biophys, 1993,306 :148-151)DV Chlide a。
用作对照的单乙烯叶绿素a(MV Chl a)参照上述联乙烯叶绿素a(DV Chl a)的制备方法，从水稻野生型品种8MB(黄晓群，王平荣，赵海新，邓晓建.一个新的水稻叶绿素缺失突变基因的遗传分析与分子标记定位.中国水稻科学，2007，2K4) =355-359 ； Wang PR, Gao JX, Wan CM, Zhang FT, Xu ZJ, Huang XQ, Sun XQ, Deng XJ (2010) Divinyl chlorophyll(ide)a can be converted to monovinyl chlorophyll(ide)a by a divinyl reductase in rice. Plant Physiol 153，994—1003)中提取。
用作对照的单乙烯叶绿素酸酯a(MV Chlide a)参照上述联乙烯叶绿素酸酯 a(DVChlide a)制备方法，用单乙烯叶绿素a(MV Chl a)作底物进行酶反应制备。
将BL21/pET_30a(+)-CsDVR表达的蛋白(CsDVR)和空载体对照CK分别与上述两种底物在反应缓冲液(40mM柠檬酸，80mM K2HPO4,0. 5mM NADPH，20%丙酮，pH 7. 0)中30°C 反应lOmin，然后用丙酮终止反应，转入乙醚中，经氮气吹干，再溶于丙酮，最后用HPLC检测(同时设置作为底物DV Chl a对照的MV Chl a，以及作为底物DV Chlide a对照的MV Chlide a)。按照 Zapata 等(Zapata Μ,Rodriguez F and Garrido JL (2000) Separation of chlorophylls and carotenoids from marine phytoplankton :A new HPLC method using a reversed phase C8 column and pyridine containing mobile phases. Mar. Ecol. Prog. Ser. 195 :29-45)的方法进行HPLC分析，洗脱采用梯度流动相(表1)，25°C，流速1. OmL/ min，上样量 5yL，酶反应 DV Chl a 和 DV Chlide a 的产物用 C8 柱 6mm i. d. X 150mm long ；3.5 μ m, Agilent)检测，柱中洗脱的色素分别用410nm和440nm波长监测。
表IHPLC分析所采用的梯度流动相
权利要求
1.由序列表中序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质在作为联乙烯还原酶中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述联乙烯还原酶能将联乙烯叶绿素酸酯a转化为单乙烯叶绿素酸酯a。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述蛋白质的编码序列为序列表中序列1。
4.由序列表中序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质在转化联乙烯叶绿素酸酯a为单乙烯叶绿素酸酯a中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述蛋白质的编码序列为序列表中序列1。
全文摘要
本发明公开了一种来源于黄瓜的蛋白作为联乙烯还原酶的应用。本发明所提供的应用具体为由序列表中序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质作为联乙烯还原酶的应用，具体表现在能将联乙烯叶绿素酸酯a转化为单乙烯叶绿素酸酯a；序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质的编码序列为序列表中序列1。实验证明，本发明所提供的序列表中序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质具有联乙烯还原酶活性，可以将联乙烯叶绿素酸酯a转化为单乙烯叶绿素酸酯a。
文档编号C12N9/02GK102517263SQ20111042959
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月20日 优先权日2011年12月20日
发明者万春美, 孙昌辉, 徐正君, 朱建清, 王平荣, 王萍渝, 肖云华, 邓晓建, 马晓智, 高晓玲 申请人:四川农业大学