专利名称：快速检测粪便中沙门菌、志贺菌和大肠杆菌的方法
技术领域：
本发明属于生化检测领域，具体涉及一种快速检测粪便中沙门菌、志贺菌和大肠杆菌的方法。
背景技术：
沙门菌(Salmonella)是在公共卫生学上具有重要意义的常见人畜共患肠道病原菌，可引起食物中毒、胃肠炎、菌血症、肠热症等疾病，因此世界卫生组织(WHO)将沙门菌列入具有严重危害和中等危害的食物传播性病原菌；志贺菌(Shigella)是引起人类细菌性痢疾的病原菌，分别为痢疾志贺菌、福氏志贺菌、鲍氏志贺菌和宋内志贺菌，可引起食源性暴发，临床表现通常为带血腹泻，主要流行于发展中国家，全世界每年发病数超过2亿；大肠杆菌0157:H7 Escherichia coli 0157:H7)是能引起人出血性腹泻和肠炎的大肠杆菌， 易继发溶血性尿毒综合症和血栓性血小板减少性紫癜并发症，人群普遍易感，自美国1982 年首次爆发流行以来，全球各地均有发生，1997年世界卫生组织将大肠杆菌0157 :H7病列为新的食源性疾病。这三种肠道病原菌在感染者的粪便中大量存在，也可能出现于健康携带者粪便中，易污染食品和水源，引起该类疾病的流行，因此，快速检测粪便及其它样品中这三种肠道病原菌，对预防和控制疾病发生和流行至关重要。但常规检测这些致病菌需分离培养、生化和血清学鉴定等多个步骤，操作复杂，周期长(3 7天)，不利于卫生检疫、食品安全的检测监管，迫切需要开发快速、灵敏和特异的快速检测技术，建立快速、敏感和多目标的病原菌检测工具。国内外针对快速检测技术的研究，主要包括以下几个方面①检测细菌某些专有的酶或产生的毒素的技术，②以检测细菌生化反应为基础的细菌自动鉴定系统，③检测细菌所特有的抗原的技术，通过抗原-抗体特异性反应来检测相应的病原菌，例如ELISA、胶体金技术等，④检测细菌的核酸如核酸杂交、PCR(聚合酶链反应)、基因芯片、脉冲场电泳分型技术等。虽然这些技术或系统与常规检验方法相比，能够在较短时间内鉴定病原菌，但仍存在局限性①这些技术和系统大多需要细菌的纯培养物进行鉴定，而得到细菌纯培养物， 一般要经过非选择性和/或选择性增菌培养、平板分离、纯培养这几个步骤，需要1 4天时间，仍然不能充分满足病原菌快速检测的需要。②某些技术或系统成本高，如全自动微生物分析系统、脉冲场电泳仪、细菌检测芯片系统等，虽然能够较快速和多目标检测，但仪器设备和运行费用昂贵，不利于推广，尽管已有研究致力于降低仪器设备和运行费用，如纳米可视芯片的开发，但实验时间和反应的信噪比有待进一步改善。③缺乏能分离富集多种目的菌的样品前处理技术。为此，要建立快速、敏感和多目标的病原菌检测平台，必须解决样品中病原菌的分离和富集以及同时检测多目标微生物这两个问题。虽然已有多重PCR检测果汁类样品中沙门菌、志贺菌和大肠杆菌0157:H7的报道，但与粪便样品比较，果汁类样品成分简单，其检测体系难于适用于粪便样品。因此，本领域急需解决粪便样品中沙门菌、志贺菌和大肠杆菌0157:H7难于快速
4检测这一难题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是本领域目前难于快速检测解决粪便样品中沙门菌、志贺菌或大肠杆菌0157: H7。本发明解决上述技术问题的技术方案是提供一种用于检测离体细菌中的上述细菌的多重PCR引物组及快速检测方法。本发明提供的检测离体粪便中沙门菌和志贺菌的多重PCR引物组，包含以下引物对针对沙门菌invA基因的引物对上游引物5' -TATCGCCACGTTCGGGCAA-3‘下游引物5' -TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3‘；以及针对志贺菌ipaH基因的引物对上游引物5' -GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTC-3'下游引物5'-GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC-3‘。进一步的，上述多重PCR引物组还包括针对大肠杆菌0157:H7的rfbE基因的的引物对上游引物5' -CACGAAAACGTGAAATTGCTGATATT-3‘；下游引物5'-TCGATGAGTTTATCTGCAAGGTGATTC-3‘。本发明快速检测离体粪便中沙门菌及志贺菌的方法包括以下步骤a、粪便样本接种SS肉汤，37°C下进行增菌培养8 M小时，分离获取其中的细菌并提取其DNA模板；b、将步骤a中获得的DNA模板使用权利要求2中所述的多重PCR扩增引物组进行多重PCR扩增得到扩增产物；C、检测扩增产物，判断样品中是否含有沙门菌或志贺菌。本发明提供的快速检测离体粪便中沙门菌、志贺菌及大肠杆菌0157:H7的方法包括以下步骤a、粪便样本分别接种SS肉汤和mEC肉汤，37°C下进行增菌培养8 M小时，分离获取其中的细菌并提取其DNA模板；b、将步骤a中获得的DNA模板使用权利要求2中所述的多重PCR扩增引物组进行多重PCR扩增得到扩增产物；C、检测扩增产物，判断样品中是否含有沙门菌、志贺菌或大肠杆菌0157:H7。其中，上述方法中所述分离获取细菌是采用铁氧体裸磁珠吸附。进一步的，上述方法中所述分离获取细菌的方法是取Iml粪便增菌培养物， 15000r/min离心2min，弃上清液，生理盐水洗涤2次，加入浓度为100 μ g/μ 1铁氧体裸磁珠50μ 1轻柔颠倒混勻，置摇床轻柔振摇15min，磁分离后弃上清液即得细菌。其中，上述方法中提取细菌DNA模板的方法为将吸附细菌的铁氧体裸磁珠加入 300 μ 1 TE缓冲液及30 μ 1助悬剂，漩涡混勻器充分混勻后沸水浴15min，磁分离取上清液即得。
其中，上述方法中所述多重PCR扩增反应的反应体系为缓冲液1.5X，MgCl2 2. Ommol/L, dNTPs 0. 6 μ mol/L，沙门菌、志贺菌或大肠杆菌0157:H7的引物终浓度分别为 1. 2ymol/L、0. 75ymol/L 或 1. 6ymol/L，Taq DNA 聚合酶 0. 075U/μ 1，样品模板按 50 μ 1 的体积计5 μ 1 ；其中，上述方法中所述多重PCR扩增反应的扩增反应条件为经95°C预变性5min 后，95°C变性50s、64°C退火60s、72°C延伸45s、进行；35个循环后，再72°C延伸7min即得。沙门菌、志贺菌以及大肠杆菌0157:H7的传统检测方法主要依赖细菌培养、生化鉴定等，准确度虽高但耗时耗力，难以满足检验检疫的实际需要，亟待研究新型的检测方法，本研究从富集和快速检测入手，基于裸磁珠的分离和浓缩效应，结合PCR高特异性、高灵敏度、简便、快速等特点，建立“裸磁珠-多重PCR”检测方法，能在12h内完成体检粪便样品中的沙门，志贺菌和大肠杆菌0157 H7。与传统方法相比，“裸磁珠-多重PCR”检测时间短，比国家标准检测方法快数倍。 本发明方法具有快速、准确、廉价等特点，能在12小时内完成对粪便中沙门菌、志贺菌和大肠杆菌0157:H7的检测，由于12小时体系需加班完成工作，为适应工作需要，可将肛拭培养时间由8小时培养延长为过夜培养。试验证明，本发明引物组及检测方法，特异性高，灵敏度强，含菌量在103CFU/g志贺菌，104CFU/g以上的沙门菌或大肠杆菌0157:H7，无需进行增菌培养，而含菌量在102CFU/g以下的，也只需增菌他，全程12h内即可获得结果。此外，应用本方法可同时检测3种菌，很大程度地减少试剂用量和试验工作量，节省检测成本。具有很好的应用前景。
图1、本发明多重PCR体系2检测沙门菌、志贺菌、大肠杆菌0157:H7。1 2.检测大肠杆菌0157:H7;3 4.检测沙门菌；5 6.检测志贺菌；7 8.检测三种目的菌； 9. Marker I。图2、本发明多重PCR体系检测肛拭粪便样本。1.空白对照；2. Marker I ；3 4.健康受试者肛拭扩增结果；5 6.含沙门菌的健康受试者肛拭扩增结果。图3、本发明多重PCR体系检测肛拭粪便样本结果。1 3.含大肠杆菌0157:H7肛拭，每管加样量依次为5 X IOOcfu, 5 X IOlcfu, 5 X 102cfu ；4 6.含沙门菌肛拭，每管加样量依次为8. 5X IOOcfu, 8. 5X IOlcfu, 8. 5X102cfu ；7 9.含志贺菌肛拭，每管加样量依次 % 2. 7 X IOOcfu, 2. 7 X IOlcfu, 2. 7X102cfu ； 10. Marker I ；11.阴性对照(健康人肛拭)。图4、本发明两重PCR方法检测肛拭。1 10为含沙门菌肛拭，每管加样量依次为 9.1XIOOcfu,9.1XIOOcfu,9.1XIOlcfu,9.1XIOlcfu,9.1X102cfu,9. 1X102cfu, 9. 1 X 103cfu, 9. 1 X 103cfu, 9. 1 X 104cfu, 9. 1 X 104cfu ； 11. Marker I ; 12 21 为含志贺菌肛拭，每管加样量依次为 4. 3X IOOcfu,4. 3X IOOcfu,4. 3X IOlcfu,4. 3X IOlcfu， 4. 3X 102cfu,4. 3X 102cfu,4. 3X 103cfu,4. 3X 103cfu,4. 3X 104cfu,4. 3X 104cfu ； 22. Marker I。
具体实施例方式下面结合附图通过实施例对本发明方法作进一步的描述。
实施例一铁氧体裸磁珠的制备及样品前处理条件的优化本发明中采用了化学沉淀法来制备铁氧体裸磁珠，并通过优化和控制反应条件， 使磁性颗粒分布较为均勻，大小约为10nm，达到纳米水平。分别称取FeCl2 · 4H20和FeCl3 · 6H20,溶于去离子水，过滤后混勻；少量多次缓慢雾状喷入25%氨水，生成的磁珠颗粒小，且磁珠细腻，悬浮时间长，稳定。制得的裸磁珠在氨水环境下存放，使用时用灭菌去离子水适当洗涤。通过对吸附条件的摸索，确定了裸磁珠对目的菌吸附的最佳条件为室温(25°C ) 下震荡吸附15min，裸磁珠用量为50μ l(100yg/y 1)。并在此基础上，还首次探索了针对裸磁珠对粪便中的沙门菌、志贺菌、0157:H7这三种目的菌吸附的前处理条件。即通过在离心力15600Xg下离心洗涤1次，离心时间为2min，较大程度上降低了粪便残渣对裸磁珠吸附率的影响。实施例二多重PCR体系检测体系的建立和优化本发明首先通过查找国内外相关报道，筛选目的基因和相应的引物，并通过不同的组合和优化，探讨其针对粪便样品的适用性。选择对比的基因包括大肠杆菌0157:H7的 uidA、rfbE保守基因和stx、eaeA、hly等毒力因子基因，沙门菌的invA基因，以及志贺菌的 ipaH、B、C、D等毒力因子基因。最后从中选出大肠杆菌0157:H7的uidA、rfbE基因，沙门菌的invA基因，志贺菌的ipaH基因，利用靶基因保守序列，筛选和设计5对引物，对其进行组合搭配构成不同的三重检测体系，探讨其检测粪便中目的菌的灵敏度和特异性，以期最终筛选出适用于粪便样品的引物组合。1试验材料1. 1主要试剂见表1-1表1-1主要试剂
权利要求
1.检测离体粪便中沙门菌和志贺菌的多重PCR引物组，其特征在于包含以下引物对针对沙门菌invA基因的引物对上游引物 5 ‘ -TATCGCCACGTTCGGGCAA-3 ‘下游引物 5 ‘ -TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3 ‘；以及针对志贺菌ipaH基因的引物对上游引物 5 ‘ -GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTC-3 ‘下游引物5 ‘ -GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC-3 ‘。
2.根据权利要求1所述的多重PCR引物组，其特征在于还包括针对大肠杆菌0157:H7 的rfbE基因的的引物对上游引物 5 ‘ -CACGAAAACGTGAAATTGCTGATATT-3 ‘；下游引物5 ‘ -TCGATGAGTTTATCTGCAAGGTGATTC-3 ‘。
3.快速检测离体粪便中沙门菌及志贺菌的方法，其特征在于包括以下步骤a、粪便样本接种SS肉汤，37°C下进行增菌培养8 M小时，分离获取其中的细菌并提取其DNA模板；b、将步骤a中获得的DNA模板使用权利要求1中所述的多重PCR扩增引物组进行多重 PCR扩增得到扩增产物；c、检测扩增产物，判断样品中是否含有沙门菌或志贺菌。
4.快速检测离体粪便中沙门菌、志贺菌及大肠杆菌0157:H7的方法，其特征在于包括以下步骤a、粪便样本分别接种SS肉汤和mEC肉汤，37°C下进行增菌培养8 M小时，分离获取其中的细菌并提取其DNA模板；b、将步骤a中获得的DNA模板使用权利要求2中所述的多重PCR扩增引物组进行多重 PCR扩增得到扩增产物；c、检测扩增产物，判断样品中是否含有沙门菌、志贺菌或大肠杆菌0157:H7。
5.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述分离获取细菌是采用铁氧体裸磁珠吸附。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述分离获取细菌的方法是取Iml粪便增菌培养物，15000r/min离心2min，弃上清液，生理盐水洗涤2次，加入浓度为100 μ g/μ 1 铁氧体裸磁珠50μ 1轻柔颠倒混勻，置摇床轻柔振摇15min，磁分离后弃上清液即得细菌。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述提取细菌DNA模板的方法为将吸附细菌的铁氧体裸磁珠加入300 μ 1 TE缓冲液及30 μ 1助悬剂，漩涡混勻器充分混勻后沸水浴15 min，磁分离取上清液即得。
8.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述多重PCR扩增反应的反应体系 缓冲液1. 5X，MgCl22. (toimol/L，dNTPs 0. 6 μ mol/L，沙门菌、志贺菌或大肠杆菌0157:H7的引物终浓度分别为 1. 2 μ mol/L,0. 75 μ mol/L 或 1· 6 μ mol/L, Taq DNA 聚合酶 0. 075U/ μ 1， 样品模板按50 μ 1的体积计5 μ 1。
9.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述多重PCR扩增反应的反应条件为经95°C预变性5min后，95°C变性50s、64°C退火60s、72°C延伸45s、进行35个循环后，再72°C延伸7min即得。
全文摘要
本发明要解决的技术问题是本领域目前难于快速检测解决粪便样品中沙门菌、志贺菌或大肠杆菌O157:H7。本发明解决上述技术问题的技术方案是提供一种用于检测离体细菌中的上述细菌的多重PCR引物组及快速检测方法。本发明提供的检测离体粪便中沙门菌和志贺菌的多重PCR引物组，包含针对沙门菌invA基因的引物对以及针对志贺菌ipaH基因的引物对，另外还提供了使用上述引物组进行多重PCR扩增的方法。与传统方法相比，本发明方法具有快速、准确、廉价等特点，能在12小时内完成对粪便中沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157:H7的检测，具有很好的应用前景。
文档编号C12R1/42GK102424839SQ201110429558
公开日2012年4月25日 申请日期2011年12月20日 优先权日2011年12月20日
发明者杨雨, 樊学军, 田绿波, 石莹, 陈肖潇 申请人:杨雨, 樊学军, 田绿波, 石莹, 陈肖潇