包含低温大米蛋白浓缩物的食品产品的制作方法

专利名称：包含低温大米蛋白浓缩物的食品产品的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含大米蛋白浓缩物的食品制品和制备该食品制品的方法。
背景技术：
大米是最主要的食品成分之一，代表着全世界一半以上的人口的主粮。例如，大米在特色食品配方中用作淀粉源，在生产谷氨酸一钠、酒精和啤酒的工艺中用作碳源。另外，大米被用作乳品(参见第4，744，992号美国专利)和婴儿食品配方的组分。大米由75-80%淀粉、8-9%蛋白质、9-12%水分和2. 4-5%其他组分构成。高分子量贮藏蛋白即谷蛋白占大米蛋白的80-90%。其余10-20%的蛋白质是白蛋白、球蛋白和谷醇溶蛋白。大米的蛋白质组分具有几种特别理想的特性。例如，与其他植物蛋白质相比，大米蛋白变应原性低并富含必需氨基酸。例如，在所有食品蛋白质当中，大米蛋白的甲硫氨酸水平最高(>4.0%)。但是，对大米蛋白在食品和饮料配方中的功能性质和生理作用的研究却不够。已报道大米蛋白具有有益的生理作用，包括降低胆固醇的作用，不过大米蛋白发挥这些作用的机制没有完全阐明。参见例如Yang等人，(2007)Biosc1. Biotechnol. Biochem.
(《生物科学生物技术生物化学杂志》)，第71卷第694-703页。在这个方面，大米蛋白与大豆蛋白和从大豆蛋白水解物获得的高分子量级分具有相似的性质。参见例如Carroll等人，(1991) J. Am. Dietetic Assoc.(《美国营养学杂志》)，第 91 卷第 820-827 页；Anderson 等人，(1995)New Engl. J. Med.( 《新英格兰医学杂志》)，第333卷第276-282页。大米淀粉水解物和/或高蛋白大米粉的生产工艺通常包括将大米粉的浆液与热稳定性α-淀粉酶在高于75°C的温度下蒸煮。可采用高碱性提取OpHlO. O)来分离不溶性蛋白质。参见Shaw等人，(1992)Biosc1. Biotechnol. Biochem.(《生物科学生物技术生物化学杂志》)，第56卷第1071-1073页；第4，990，344号美国专利。但是，使用高温工艺(HT工艺)会使大米蛋白变性。参见Ju等人，(2001) J. Food Science (《食品科学杂志》)，第66卷第229-232页。此外，由于大米蛋白浓缩物具有吸湿性，将HT工艺制备的大米蛋白浓缩物掺入到食品制品中的努力遭遇挫折。HT工艺生产的浓缩物会吸附大量的水分，导致包含大米浓缩物的食品具有易碎的质构。制备可加工的面团(dough)可能需要加入大量的水，这会缩短货架期。WO 2005/082155A2公开了用低温工艺(LT工艺)生产高纯度大米蛋白浓缩物的方法。在LT工艺中，使大米底物与两种淀粉加工酶接触，其中至少一种酶是颗粒淀粉水解酶(GSHE)。颗粒大米淀粉在低于变性温度的温度下和在大米蛋白的等电点pH之下或附近发生水解。如W02005/082155所示，与常规的HT工艺相比，LT工艺有利地生产出可溶性蛋白质百分数更高的大米蛋白浓缩物。

发明内容
本发明提供通过LT工艺制备的大米蛋白浓缩物。与通过HT工艺制备的大米浓缩物相比，该大米浓缩物具有有利的特性。例如，LT工艺能生产具有改进的质构和内聚性的大米蛋白浓缩物。这些有利性质得出制备含有大米蛋白浓缩物的食品制品的改进工艺。例如，与从相似数量的大豆蛋白制备的湿面团相比，该大米蛋白浓缩物可以以含有小于约45%水分的湿面团的形式添加到食品产品。这个性质有利地给食品产品提供改进的货架期和更可口的质构。此外，LT工艺生产的大米蛋白浓缩物具有有利的生理作用它能降低胆固醇，提高乳酸脱氢酶(LDH)活性和降低血尿素氮(BUN)。含有该大米蛋白浓缩物的食品制品(例如快餐棒)因此可用作膳食补充物。在一个方面，提供包含通过低温工艺生产的大米蛋白浓缩物的食品产品。该低温工艺包括(a)用(i)具有颗粒淀粉水解(GSH)活性的酶和(ii)第二淀粉水解酶在72°C或低于72°C的温度下和在3. O至6. 5的pH下水解大米底物中的大部分淀粉一段时间，该时间足以获得增溶的淀粉级分和含有不溶性大米蛋白的残余物级分；和

(b)将该增溶的淀粉级分与该残余物级分分离以获得大米蛋白浓缩物。该食品产品含有湿面团形式的大米蛋白浓缩物。该食品产品可以是饮料、食品补充物或食品补充物的成分、功能食品或功能食品的成分、动物饲料添加剂或动物饲料添加剂的成分、或者适合人消费的食品添加剂。在另一个方面，提供制备上述食品产品的方法。该方法可包括(a)用(i)具有颗粒淀粉水解(GSH)活性的酶和(ii)第二淀粉水解酶在72°C或低于72°C的温度下和在3. O至6. 5的pH下水解大米底物中的大部分淀粉一段时间，该时间足以获得增溶的淀粉级分和含有不溶性大米蛋白的残余物级分；和(b)将该增溶的淀粉级分与该残余物级分分离以获得大米蛋白浓缩物。在一个实施方案中，具有GSH活性的酶是葡糖淀粉酶，其可衍自腐质霉属(Humicola)、根霉属(Rhizopus)或曲霉属(Aspergillus)的菌株。作为另一种选择，GSHE可以是α-淀粉酶。第二淀粉水解酶也可以是GSHE，例如衍自细菌来源的α-淀粉酶。但是，第二淀粉水解酶还可以是不属GSHE的酶，如β_淀粉酶或普鲁兰酶。在一些实施方案中，GSHE从在木霉属(Trichoderma)菌株或曲霉属(Aspergillus)菌株中异源表达获得。在上述方法中，可将大米底物调成干固体含量在10至55%之间的浆液。在一些实施方案中，上述工艺的温度可在70°C至55°C之间。所述方法还可包括将在(b)部分中获得的大米蛋白浓缩物用具有GSH活性的酶和淀粉水解酶在3. O至6. 5的pH下和在70°C至55°C的温度下进行酶促水解，以获得包括增溶的淀粉和不溶性大米蛋白的级分；和(d)将级分进行分离以获得高纯度大米蛋白浓缩物。上述方法还可包括纯化和/或干燥该大米蛋白浓缩物。该大米蛋白浓缩物的蛋白质含量可为至少20%,该高纯度大米蛋白浓缩物的蛋白质含量可为至少60%。附图简述本说明书附有附图，附图构成说明书的一部分并举例说明各个实施方案。

图1比较了用来制备湿面团的大米和大豆蛋白浓缩物的水合作用。
具体实施例方式在低温下制备的大米蛋白浓缩物表现出改进的功能性和有利的生理好处，包括降低的胆固醇、提高的乳酸脱氢酶活性和降低的血尿素氮。大米蛋白浓缩物的使用改进了含有该浓缩物的食品制品的配制中的加工步骤。该食品产品有利地显示出延长的货架期和改进的可口质构。I定义和缩写除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。根据本具体实施方式
，适用下面的缩写和定义。1.1.定义术语“大米”指归类为水稻(Oryza saliva)的植物。术语“大米底物”包括大米(精米或糙米)的所有形式或部分，如全谷、碎谷、大米碎粒和大米粉。术语“淀粉”指分子式为(C6HltlO5)n (其中η可为任何数目)的复杂植物多糖碳水化合物。术语“颗粒淀粉”指未蒸煮的(生的)淀粉，其未进行糊化。术语“糊化”指淀粉分子增溶而形成粘稠悬浮液。术语“大米蛋白浓缩物”指具有大于约10%(w/w)的大米蛋白浓缩物的大米蛋白级分。“约”当修饰参数时，指通常与测量该参数相关的实验误差的程度。术语“高纯度大米蛋白浓缩物”指具有至少约60%的大米蛋白含量的蛋白质级分。这个术语所涵盖的大米蛋白含量具体包括例如至少63%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、72%、75%或80%或更高。术语“蛋白质”和“多肽”可互用。术语“变性温度”指蛋白质`失去其二级和三级结构的温度。术语“等电点”指蛋白质或蛋白质混合物携带零净电荷时的溶液pH。术语“葡萄糖当量”(DE)是以干重计作为D-葡萄糖计算的总还原糖的量度。非水解的颗粒淀粉的DE几乎为零，而D-葡萄糖的DE为100。术语“总糖含量”指淀粉组合物中存在的总糖含量。术语“干固形物含量”(ds)指按干重计浆液的总固形物(%)。术语“浆液”指包含不溶物的含水混合物。“百利糖度”指众所周知的用于测量给定温度下溶液的糖含量的比重计标度。百利糖度标度测量每100克糖水溶液中存在的蔗糖克数(总溶解固体含量)。百利糖度测量常常通过比重计或折射计进行。术语“淀粉的水解”指加入水分子切割糖苷键。词语“大部分的淀粉”意指至少80%的淀粉。术语“聚合度”(DP)指给定的糖(saccharine)中无水卩比喃葡萄糖的数目(η)。例如，单糖如葡萄糖和果糖为DPI。二糖如麦芽糖和蔗糖为DP2的例子。“DP3+”表示聚合度大于3的聚合物。术语“颗粒淀粉水解酶”和“具有颗粒淀粉水解(GSH)活性的酶”(统称GSHE)在本文中用来指具有水解颗粒形式的淀粉的能力的葡糖淀粉酶或α-淀粉酶。更普通的术语“淀粉水解酶”指GSHE或另一种水解淀粉的酶。非葡糖淀粉酶或α-淀粉酶的淀粉水解酶包括但不限于普鲁兰酶、β-淀粉酶、纤维素酶、果胶酶和葡聚糖酶。术语“重组GSHE”、“重组表达的GSHE”和“重组产生的GSHE”指在宿主细胞中从异源多核苷酸产生的成熟GSHE蛋白序列。符号“r”可用来表示重组蛋白。例如，在里氏木霉(Trichoderma reesei)中表达的灰腐质霉高温变种(Humicola grisea var. thermo idea)GSHE表示为“rH-GSHE”。术语“天然GSHE”和“nGSHE”意指衍自宿主生物的GSHE，其中编码GSHE的多核苷酸为该宿主生物的内源多核苷酸。术语“淀粉酶”指能催化淀粉的水解的酶。术语“α-淀粉酶(EC3.2.1.1)”指能催化α-1，4-糖苷键的水解的酶。这些酶还曾被描述为实现含有1，4-D_葡萄糖单元的多糖中的1，4-D_糖苷键的外切水解或内切水解的那些酶。用于描述这些酶的另一术语是糖原酶。示例性的酶包括α-1，4-葡聚糖4-葡聚糖水化酶葡聚糖水解酶(α -1, 4-glucan4-glucanohydrase glucanohydrolase)。术语“葡糖淀粉酶”指淀粉葡糖苷酶类别的酶(EC. 3. 2. 1.3，葡糖淀粉酶，α -1, 4-D-葡聚糖葡萄糖水解酶)。这些酶是外切酶，从直链淀粉和支链淀粉分子的非还原末端释放葡糖基残基。这类酶还水解α-1，6和α-1，3键，尽管水解的速度远慢于α _1，4键。术语“糖基化”指蛋白质通过碳水化合物部分的加入而发生的转录后修饰，其中碳水化合物进行N连接或O连接而产生糖蛋白。糖蛋白的N连接的碳水化合物部分通过糖苷键连接到天冬酰胺残基的P-酰胺氮。O连接的碳水化合物经丝氨酸或苏氨酸残基的羟基基团通过糖苷键连接到蛋白质。“信号序列”意指结合到蛋白质的N末端部分的氨基酸序列，其能促进成熟形式的该蛋白质分泌到细胞外。成熟形式的胞外蛋白质缺乏该信号序列，其在分泌过程中被切割。“基因”指参与产生多肽的DNA区段，包括编码区之前和之后的区域，以及各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。术语“核酸”意指单链 或双链的DNA、RNA以及它们的化学修饰物。术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互用。由于遗传密码的简并性，某种特定氨基酸可用超过一种密码子来编码，因此本发明涵盖编码某种特定氨基酸序列的多个多核苷酸。“载体”是指设计用来将核酸引入一种或多种细胞类型中的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、表达盒等等。“表达载体”意指这样的DNA构建体，其包含DNA序列和该DNA序列有效连接的能够实现该DNA在合适宿主中表达的合适控制序列。这种控制序列可包括转录启动子、任选的控制转录的操纵子序列、编码合适的mRNA上核糖体结合位点的序列、增强子以及控制转录和翻译的终止的序列。术语“有效连接”指毗邻关系，其中各元件处于能让它们在功能上相关的布置关系。例如，如果某启动子控制某编码序列的转录，则它与该序列有效连接。术语“选择性标记”指这样的基因，其能够在宿主中表达，使得易于选择那些含有所引入的核酸或载体的宿主。选择性标记的例子包括但不限于抗微生物剂(例如潮霉素、博来霉素或氯霉素)或者赋予宿主细胞代谢益处(如营养益处)的基因。术语“衍自”涵盖术语“来源于”、“获自或可获自”和“分离自”。“宿主菌株”或“宿主细胞”意指对于包含编码本发明GSHE的多核苷酸的表达载体或DNA适合的宿主。例如，“宿主细胞”可意指从丝状真菌菌株(如木霉属的种(Trichoderma sp.))的细胞产生的细胞和原生质体两者。术语“丝状真菌”指真菌亚门(Eumycotina)的所有丝状形式，包括但不限于里氏木霉(T. reesei)(之前分类为长梗木霉(T.1ongibrachiatum),目前也称红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))、绿色木霉(T. viride)、康氏木霉(T. koningli)、哈茨木霉(T. harzianum)、青霉菌属的种(Penicillium sp.)、腐质霉属的种(Humicola sp)(包括特异腐质霉(Humicolainsolens)和灰腐质霉(Humicola grisea))、金孢子菌属的种(Chrysosporium sp.)(包括C. lucknowense)、粘帚霉属的种(Gliocladium sp.)、曲霉属的种(Aspergillus sp.)(包括米曲霉(A. oryzee)、构巢曲霉(A. nidulans)、黑曲霉(A. niger)和泡盛曲霉(A. awamori))、镰刀菌属的种(Fusarium sp·)、链孢霉属的种(Neurospora sp·)、肉座菌属的种(Hypocreasp.)和裸孢壳属的种(Emericella sp.)。术语“接触”指将各种酶设置成与分别的大米底物充分紧密接近。本领域技术人员会认识到，将酶的溶液与分别的大米底物混合可实现接触。术语“温育”指将大米底物与水解酶在给定的条件下混合达确定的一段时间。术语“酶促转化”指对大米底物进行修饰以产生可溶性的水解颗粒大米淀粉，优选产生葡萄糖。术语“浆液”指含有不溶性颗粒淀粉的含水混合物。有时，术语“浆液”与“悬浮液”可互用。术语“培养”指在液体或固体培养基中在合适的条件下生长微生物细胞群体。在一个实施方案中，培养指通常在容器或反应器中将颗粒淀粉底物通过发酵而生物转化成葡萄糖糖浆或其他需要的终产物。术语“回收的”、“离析的”和“分离的”指从至少一种与其天然结合的组分移除开来的蛋白质、细胞、核酸或氨基酸。这些术语还指将包含可溶性淀粉水解物的混合物与包含基本上不溶性大米蛋白的残余物分离开来。指涉细胞的术语“转化的”、“稳定转化的”或“转基因的”是指该细胞有非天然(异源)核酸序列整合到其基因组中或作为附加型质粒存在，该附加型质粒经过多个传代都得到保留。术语“表达”是指基于基因的核酸序列而产生多肽的过程。该过程包括转录和翻译两者。在将核酸序列插入细胞中的语境下的术语“引入”，意指“转染”、“转化”或“转导”。该术语包括将核酸序列掺入真核或原核细胞中，在其中核酸序列可被掺入细胞的基因组(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中、转变成自主复制子或被瞬时表达(例如，转染的mRNA)。术语“比活性”意指一种酶单位，定义为在特定条件下每单位时间被酶制剂转化为产物的底物的摩尔数。除非另有指明，否则比活性可以以单位/毫克蛋白来表示。本文所用的“酶活性”指酶对其底物的作用。术语“颗粒淀粉水解酶单位”定义为在测定条件下(例如pH4. 5下50°C，或者pH5. O下25°C )每分钟从颗粒淀粉底物产生Img的葡萄糖所需的酶量。术语“食品补充物”指补给人的膳食中缺失或不被足量消费的营养物的食品。术语“功能食品”指包含能提供额外营养价值的添加剂的食品。术语“动物饲料”指特别设计给非人动物消费的食品。术语“食品添加剂”指添加到食品以改进其货架期的组分。单数名词包括复数指代，除非上下文清楚表明并非如此。本文所用的术语“包含”及其同源词以其“包括在内”的含义使用；也就是说，与术语“包括”及其相应的同源词等同。12 缩写除非另有指明 ，否则适用以下缩写AAU α -淀粉酶单位；
ATCC 美国模式培养物保藏所；BUN血尿素氮；DE葡萄糖当量；DNS3，5 二硝基水杨酸；DP聚合度；ds干固形物含量；EC酶学委员会；EDCC含有胆 固醇的实验膳食；GLDH谷氨酸脱氢酶；GSH颗粒淀粉水解；GSHE颗粒淀粉水解酶；⑶葡糖淀粉酶单位；HDL-C 高密度脂蛋白胆固醇；HFCS高果糖玉米糖浆；H-GA腐质霉葡糖淀粉酶；HT工艺工艺高温工艺；LDH乳酸脱氢酶；LBLuria Bertani 肉汤；LT工艺低温工艺；MOPS吗啉丙磺酸；NADH还原型烟碱腺嘌呤二核苷酸；NCBI美国国家生物技术信息中心；NRRL北部地区研究实验室美国农业研究囷种保减中心；PEG聚乙二醇；PNP-G7 对硝基苯麦芽庚糖苷；RT-PCR 反转录酶聚合酶链反应；SD沙氏葡萄糖肉汤；TC总胆固醇；TG甘油三酯；YM酵母麦芽浸膏肉汤；以及Wt重量。2.生产大米蛋白浓缩物的低温工艺(LT工艺)可用WO 2005/082155 A2中描述的LT工艺生产大米蛋白浓缩物。该方法包括将大米底物在低于大米蛋白变性温度的温度下和在该蛋白在该大米底物中的等电点PH之下或附近进行酶促水解。获得两个级分(I)淀粉水解物的增溶淀粉级分和(2)含有不溶性大米蛋白的残余物级分。可将增溶淀粉级分与残余物级分分离开来，并可从残余物级分获得大米蛋白浓缩物。在一个实施方案中，在不进一步操作残余物级分的情况下获得大米蛋白浓缩物。在另一个实施方案中，可将残余物级分进一步加工以提闻大米蛋白在该级分中的重量百分比。在一些实施方案中，大米蛋白浓缩物是高纯度大米蛋白浓缩物。
21大米底物本发明工艺中应用的大米底物可获自任何已知的来源。例如,大米底物可以是大米粉或者精米底物。大米底物可含有例如约6-10%的总蛋白质含量(NX5. 95 #代表由凯氏定氮法测定的总氮百分数，而5. 95是大米的换算系数);约70-82%碳水化合物；约9-12%水分；约O. 4-1. 5%粗脂肪；约O. 6-0. 8%灰分和约O. 2-0. 6%纤维。谷粒中存在的大米蛋白在水中具有有限的溶解度。这些蛋白质主要是不溶性(碱溶性)谷蛋白(约80-90%);盐溶性球蛋白(7-15%);水溶性白蛋白(9-10%);和醇溶性谷醇溶蛋白(约2-5%) ο参见Houston等人，(1970)CerealChem(《谷类化学》),第47卷第5页；Perdon 等人，(1978)Phytochem (《植物化学》)，第 17 卷第 351 页；Landers 等人，(1994)CerealChem (《谷类化学》)，第71卷第409-11页。在一些实施方案中，可将大米底物粉碎至所需的颗粒大小后再分散在水中，或者可在加工过程中进行湿磨。可在加工之前加水以形成浆液。浆液中的大米底物可包含约10至约55%ds、约20至约50%ds、约25至约45%ds、约20至约40%ds、约20至约35%ds或者约30 至 35%ds。2. 2.颗粒淀粉水解酶(GSHE)本文公开的方法中使用的淀粉水解酶中的至少一种是颗粒淀粉水解酶(GSHE)。GSHE具有葡糖淀粉酶活性或α -淀粉酶活性。参见Tosi等人，(1993)，Can. J. Microbiol.(《加拿大微生物学杂志》)，第39卷第846-55页；Kanlayakrit等人，(1987) J. Ferment.Technol.(《发酵技术杂志》)，第65卷第379-85页。GSHE可天然存在或者可重组产生。重组产生的GSHE可以是经遗传修饰的。已从真菌细胞(如腐质霉属的种(Humicola sp.)、曲霉属的种(Aspergillus sp.)、毛霉属的种(Mucor sp.)和根霉属的种(Rhizopus sp.))回收了天然存在的GSHE。例如,在Ashikari等人，(1986) ,Agric. Biol. Chem.(《农业生物化学》)，第50卷第957-64页和第4`，863，864号美国专利中描述了来自米根霉(Rhizopusoryzae)的 GSHE。在 Allison 等人，(1992)，Curr. Genet.(《当代遗传学》)，第 21 卷第 225-29页和 EP 171 218 中描述了灰腐质霉(Humicola grisea) GSHE。在 Hayashida 等人，(1989),Agric. Biol. Chem.(《农业生物化学》),第53卷第923-29页中描述了泡盛曲霉kawachi变种(Aspergillus awamori var. kawachi)GSHE。在 Shibuya 等人，(1990), Agric. Biol. Chem.(《农业生物化学》)，第54卷第1905-14页中描述了 Aspergillus shirousami GSHE。还可从真菌回收GSHE，所述真菌包括ATCC 16453、北部地区研究实验室(NRRL) 15219、NRRL 15220、NRRL 15221、NRRL 15222、NRRL15223、NRRL 15224 和 NRRL15225以及它们的经遗传改变的菌株。参见EP 171 218。在一个实施方案中，GSHE可衍自灰腐质霉(Humicola grisea)的菌株,特别是灰腐质霉高温变种(Humicola grisea)var.thermo idea的菌株(H-GSHE)。参见第4，618，579号美国专利。在另一个实施方案中，GSHE可衍自泡盛曲霉(Aspergillus awamori)的菌株,特别是泡盛曲霉kawachi变种(A. awamorivar. kawachi)的菌株(A-GSHE)。参见 Hayashida 等人，(1989) ,Agric. Biol. Chem.(《农业生物化学》)，第53卷第923-29页。在又一个实施方案中，GSHE酶可衍自根霉属，如得氏根霉(R. niveus)的Koji菌株(以商品名“CU C0NC”出售)或者以商品名GLUCZYME出售的来自根霉属的酶。221 α -淀粉酶
在一些实施方案中，使用α-淀粉酶。α-淀粉酶是具有酶学委员会(EC)编号EC 3.2.1.1的酶。在一些实施方案中，α-淀粉酶是热稳定的细菌α-淀粉酶。合适的α-淀粉酶包括天然存在的淀粉酶以及重组产生的和突变的α-淀粉酶。α-淀粉酶可衍自芽孢杆菌属的种，如枯草芽孢杆菌(B. subtilis)、脂肪嗜热芽孢杆菌(B. stearothermophiIus)、迟缓芽抱杆菌(B.1entus)、地衣芽抱杆菌(B.1icheniformis)、凝结芽孢杆菌(B. coagulans)和解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)(参见例如第5，763，385 号、第 5，824，532 号、第 5，958，739 号、第 6，008，026 号和第 6，361，809 号美国
专利。产生有用的淀粉酶的芽孢杆菌菌株包括具有美国模式培养物保藏所编号(ATCCs)39709、ATCCl 1945、ATCC 6598、ATCC 6634、ATCC 8480、ATCC 9945A 的菌株。有用的市售α -淀粉酶包括 SPEZYME AA、SPEZYME FRED、GZYME G997 (杰能科公司(Genencor)，其为丹尼斯克公司(Danisco Α/S)的分公司)、TERMAMYL 120-L、TERMAMYL LC、TERMAMYL SC 和SUPRA (诺维信公司(Novozymes))。2. 2. 2. α -淀粉酶活件α -淀粉酶单位(AAU)指按照第5，958，739号美国专利(其通过引用并入本文)中公开的方法测量的α-淀粉酶活性。一个单位的AAU指在指定条件下每分钟水解IOmg的淀粉所需的酶量。α-淀粉酶活性的测定法使用对硝基苯麦芽庚糖苷(PNP-G7)作为底物，其非还原末端糖被化学封闭。PNP-G7可被内切淀粉酶例如α-淀粉酶切割。切割后，α-葡糖苷酶和葡糖淀粉酶消化该底物以释放游离的PNP分子，从而显示黄颜色，可通过可见光分光光度法在410nm处测量。PNP释放速率与α-淀粉酶活性成比例。比照标准对照品计算给定样品的AAU。2. 2. 3.葡糖淀粉酶葡糖淀粉酶(EC3. 2 .1. 3)从淀粉的非还原端相继去除葡萄糖单元。该酶可同时水解淀粉的直链和支链糖苷键，即可同时水解直链淀粉和支链淀粉。葡糖淀粉酶可衍自细菌、植物和真菌。选自曲霉属、根霉属、腐质霉属和毛霉属的真菌的葡糖淀粉酶已从包括以下的真菌菌株衍生得到黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori) >得氏根霉(Rhizopus niveus)、米根霉(Rhizopus oryzae)、米黑毛霉(Mucor miehe)、灰腐质霉(Humicola grisea)、Aspergillus shirousami和柔毛腐质霉(嗜热真菌属)(Humicola (Thermomyces) Ianiginosa)(参见例如 Boel 等人，(1984), EMBO J (《欧洲分子生物学组织杂志》)，第 3 卷第 1097-1102 页；W0 92/00381 ；W0 00/04136 ;Chen 等人，(1996)，Prot. Eng,第 9 卷第 499-505 页；Taylor 等人，(1978), Carbohydrate Res (《碳水化合物研究》)，第61卷第301-08页；以及Jensen等人,(1988), Can. J. Microbiol.(《加拿大微生物学杂志》)，第34卷第218-23页)。商业使用的具有葡糖淀粉酶活性的酶例如从黑曲霉产生(来自杰能科公司(Genencor),其为丹尼斯克公司(Danisco Α/S)的分公司)的0PTIDEXL -400and GZYME G9904X，或者从根霉属的种产生(CU. C0NC ，新日本化学株式会社(ShinNihon Chemicals) ;GLUCZYME ,日本天野製薬株式会社(Amano Pharmaceuticals))。葡糖淀粉酶可在异源宿主细胞(如木霉属宿主)中表达。例如，如第7，303，899号美国专利中所描述，来自灰腐质霉高温变种(Humicola grisea var. thermo idea)的腐质霉葡糖淀粉酶(H-GA)可从木霉属宿主重组表达。经过典型的发酵后，可将发酵液离心以分离生物量。可采用超滤法浓缩含有所表达的葡糖淀粉酶的澄清培养物过滤液后再在应用研究中使用。2.2.4.葡糖淀粉酶活性葡糖淀粉酶活性例如通过测量在pH4. 6、40°C下温育过程中从2%(w/v)可溶性淀粉底物溶液释放的还原糖来进行测定。一葡糖淀粉酶单位(GU)定义为在指定的条件下每小时从可溶性淀粉以葡萄糖形式释放一毫克还原糖所需的酶量。2.3.重纟目产牛的GSHEGSHE可以是重组表达的GSHE(rGSHE)。rGSHE包括从一个物种获得并在另一异源物种中表达的天然存在的蛋白质。在一些实施方案中，可通过遗传工程修饰天然存在的蛋白质的序列。经改变的蛋白质序列较之天然存在的序列可具有有利的性质，例如提高的比活性或者热稳定性。rGSHE序列被修饰的程度可不同。例如，rGSHE可与来自相同物种的天然存在的 GSHE 序列具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、93%、95%、97%、98%或99%序列同一性。rGSHE可在与获得G SHE的菌株不同的宿主真菌菌株中表达。在一些实施方案中，真菌菌株是曲霉属的种(Aspergillus sp.)、木霉属的种(Trichoderma sp.)、镰刀菌属的种(Fusarium sp.)或青霉属的种(Penicillium sp.)的丝状真菌菌株。真菌宿主包括构巢曲霉(A. nidulans)、泡盛曲霉(A. awamori)、米曲霉(A. oryzee)、棘抱曲霉(A. aculeatus)、黑曲霉(A. niger)、日本曲霉(A. japonicus)、里氏木霉(T. reesei)、绿色木霉(T. viride)、尖孢镰刀菌(F. oxysporum)和爺病镰刀菌(F. solani)。黑曲霉菌株在Ward等人，(1993),Appl. Microbiol. Biotechnol.(《应用微生物学与生物技术》)，第39卷第738-43页以及Goedegebuur等人，(2002), Curr. Gene (《当代基因》)，第41卷第89-98页中有公开。里氏木霉(T. reesei)的合适菌株例如包括 ATCC 1363UATCC 2692UATCC 56764,ATCC 56765、ATCC56767和NRRL 15709。在一些实施方案中，宿主菌株可以是RL-P37的衍生物，其在Sheir-Neiss 等人，(1984), Appl. Microbiol. Biotechnol.(《应用微生物学与生物技术》)，第20卷第46-53页中公开。表达GSHE的宿主菌株可能先前已通过遗传工程被操纵过。在一些实施方案中，可使真菌宿主的各种基因失活。这些基因可编码纤维素分解酶，如内切葡聚糖酶(KG)和外切纤维二糖水解酶(CBH)(例如cbhl、cbh2、egll和egl3)。第5，650，322号美国专利公开了RL-P37的衍生菌株，其在cbhl基因和cbh2基因中具有缺失。2. 4.载体和真菌转化可通过包含有效连接到GSHE编码序列的调节序列的载体(特别是表达载体)，将编码GSHE的异源多核苷酸引入到真菌宿主细胞中。载体可以是任何这样的载体，其当被引入到真菌宿主细胞中时能整合到宿主细胞基因组中，其可在该基因组中复制。美国真菌遗传资源中心(Fungal Genetics Stock Center)白勺菌株目录(在互联网上》www. FGSC. net〈〈)列举了合适的载体。合适的表达载体和/或整合载体的另外的例子可在Van den Hondel等人，(1991), Moee Gene Manipulations in Fungi (《在真菌中的更多基因操纵》)，Bennett等人编辑，学术出版社(Academic Press)，第396-428页以及第5，874，276号美国专利中找到。示例性的载体包括 PFB6、pBR322、PUC18、pUClOO 和 pENTR/D。可将编码GSHE的核酸有效连接到在真菌宿主细胞中显示转录活性的合适启动子中。该启动子可衍自编码对于该宿主细胞而言同源或异源的蛋白质的基因。在木霉属宿主中有用的启动子包括例如cbhl、cbh2、egll和egl2。在一个实施方案中，该启动子可以是该宿主细胞的天然启动子。例如，当里氏木霉(T. reesei)可为该宿主时,该启动子可以是天然的里氏木霉启动子，如cbhl，其为以登录号D86235寄存在GenBank的诱导型启动子。诱导型启动子是在环境或发育调节下活跃的启动子。在另一个实施方案中，该启动子是该真菌宿主细胞的异源启动子。有用的启动子的其他例子包括来自泡盛曲霉(A. awamori)和黑曲霉(A. niger)葡糖淀粉酶基因的启动子。参见Nunberg等人，(1984) ,Mol. Cell Biol.(《分子与细胞生物学》)，第4卷第2306-15页以及Boel等人，(1984)，EMBO J (《欧洲分子生物学组织杂志》)，第3卷第1581-85页。例外，可采用里氏木霉xinl基因和纤维二糖水解酶基因。参见EP 137 280 Al。可将GSHE编码序列有效连接到信号序列。编码信号序列的DNA可与待表达的GSHE基因天然相关。例如，信号序列可由灰腐质霉(Humicola grisea)或泡盛曲霉(Aspergillusawamori) GSHE基因编码。信号序列和启动子序列可衍自相同来源。例如，信号序列可以是有效连接到cdhl启动子的cdhl信号序列。表达载体通常包括终止序列。终止序列和启动子序列可衍自相同来源。在一些实施方案中，终止序列对于宿主细胞而言是同源的。合适的终止子序列可以是衍自木霉属菌株(如里氏木霉)的cbhl。其他有用的真菌终止子包括来自黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的终止子。参见Nunberg等人，(1984)，同上，以及Boel等人，(1984)，同上。表达载体通常包括选择性标记。选择性标记的例子包括那些赋予抗微生物抗性(例如潮霉素和腐草霉素)的标记。也可使用营养选择性标记，包括amdS标记、argB标记和pyr4标记。在用于木霉属的转化的载体系统中有用的标记例如在以下文献中有描述Biqtech_ct of Filamentous Fungi (《丝状真菌的生物技术》)，Finkelstein等人编辑，Butterworth-Heinemann 出版社，美国麻省波士顿市，(1992),第 6 章；以及 Appued MoleculaeGenetics of Filmentous Fungi (《丝状真菌的应用分子遗传学》)，Kinghorn等人编辑，BlackieAcademic and Professional 出版社，英国伦敦 Chapman and Hall (1992)。选择性标记可以例如是编码乙酰胺酶的amdS基因。转化有amdS标记的细胞可在作为氮源的乙酰胺上生长。参见Kelley等人，(1985)，EMBO J (《欧洲分子生物学组织杂志》)，第4卷第475-79页；以及Penttila等人,(1987), Gene (《基因》),第61卷第155-64页。包含编码GSHE的多核苷酸的表达载体，可以是能够在给定的真菌宿主生物中自主复制或者能够整合到宿主的DNA中的载体。在一个实施方案中，表达载体是质粒。在一个实施方案中，表达载体包含这样的DNA序列，其中启动子、GSHE编码区和终止子都来源于待表达的基因。可缺失掉不需要的DNA序列(例如，编码不想要的结构域)，使待表达的结构域处于其自身转录和翻译调节序列的控制下。在另一个实施方案中，表达载体可以是预装配的，含有高水平转录所需的序列和选择性标记。可将GSHE基因或其部分的编码区插入到这个通用表达载体中，使得它处于这个表达构建体的启动子和终止子序列的转录控制下。例如，将表达的序列插入到强cbhl启动子的下游。用于连接包含编码GSHE的多核苷酸的载体、启动子、终止子和其他序列并将它们插入到合适的载体中的方法是本领域公知的。连接通常可通过在便利的限制位点处进行连接来完成。如果不存在这种位点，则按照常规做法使用合成的寡核苷酸接头。
Cloning (《分子克隆》),Sambrook等人编辑,冷泉港出版社(Cold Spring Harbor) (1989);以及 More Gene Manipulations in Fungi (《在真菌中的更多基因操纵》)，Bennett等人编辑，学术出版社(Academic Press),美国圣地亚哥,(1991),第 70-76 页。有已知的方法可用来获得具有一个或多个失活基因的真菌宿主细胞。参见第5，246，853号美国专利、第5，475，101号美国专利和WO 92/06209。基因失活可通过以下手段完成完全或部分缺失、插入失活、或者任何其他能使基因对于其预定目的而言无功能的手段(即，使得该基因被防止表达功能蛋白)。任何已被克隆的、来自木霉属的种或其他丝状真菌宿主的基因都可进行缺失。例子包括cbhl、cbh2、egll和egl2。在一些实施方案中，可通过用已知的方法将待失活的所需基因的某种形式插入到质粒中来完成基因缺失。然后可在所需基因编码区内部的适当限制性内切核酸酶位点处切割该缺失质粒，并用选择性标记替换该基因编码序列或其部分。来自待缺失的基因的基因座的侧翼DNA序列(优选约O. 5至2. Okb之间)保留在该标记基因的任一侧上。适当的缺失质粒通常将具有存在于其中的独特限制性酶位点，以使得含有该缺失基因的片段(包括侧翼DNA序列)和选择性标记基因能够作为单一线性块被去除。将DNA构建体或载体引入到宿主细胞中的技术是公知的，包括转化、电穿孔、核微注射、转导、脂转染介导的转染、DEAE-糊精介导的转染、与磷酸钙DNA沉淀物一起温育、用包被DNA的微粒进行高速轰击以及原生质体融合等等。一般的转化技术在MMaiLAK Cloning(《分子克隆》)，Sambrook等人编辑,冷泉港出版社(Cold Spring Harbor) (1989)等其他文献中有教导。特别地，转化丝状真菌的方法在Campbell等人，(1989), Curr. Genet (《当代遗传学》)，第16卷第53-56页中公开。第6，022，725号美国专利；第6，268，328号美国专利；Harkki 等人，(1991)，Enzyme Microb. Technol (《酶微生物技术》)，第 13 卷第 227-233页；Harkki 等人，(1989)，BioTechnol (《生物技术》)，第 7 卷第 596-603 页；EP 244 234 ；以及EP 215 594中公开了在木霉属中表达异源蛋白。还请参照Nevalainen等人,“TheMolecular Biology of Trichod`erma and its Application to the Expression of BothHomologous and Heterologous Genes”(“木霉属的分子生物学及其在表达同源和异源基因中的应用”)，载于Industeial Mykmw (《分子工业真菌学》)，Leong等人编辑，马塞尔 德克尔公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，第129-148页，1992。有关曲霉菌株的转化，还请参照Cao等人，(2000), Protein Sc1.(《蛋白质科学》),第9卷第991-1001页。可用载体系统构建遗传上稳定的转化株，从而编码GSHE的核酸可稳定整合到宿主菌株染色体中。然后可通过已知的技术纯化转化株。在一个非限制性例子中，包含amdS标记的稳定转化株通过其较快的生长速率和通过其在含有乙酰胺的固体培养基上形成具有光滑而不是凹凸不平的轮廓的圆形菌落而与不稳定转化株区别开来。在一些情况中，可如下进行稳定性的进一步测试在固体非选择性培养基(例如缺乏乙酰胺)上生长转化株，从这个培养基收获孢子，并测定随后将会萌发并在含有乙酰胺的选择性培养基上生长的这些孢子的百分数。也可用本领域已知的其他方法来选择转化株。在一个实施方案中，转化用的木霉属的种的制备涉及到从真菌菌丝体制备原生质体。参见Campbell等人,(1989), Curr. Genet (《当代遗传学》),第16卷第53-56页。菌丝体可从萌发的营养孢子获得。在这个情况中，可用能消化细胞壁的酶处理菌丝体，从而得到原生质体。然后可通过在悬浮介质中存在渗透稳定剂来保护原生质体。合适的稳定剂包括山梨醇、甘露糖醇、氯化钾、硫酸镁等。通常，这些稳定剂在悬浮介质中的浓度在0.8M至1. 2M之间变动，例如1. 2M山梨醇。DNA向宿主木霉属的种的菌株中的摄取依赖于钙离子浓度。通常，在摄取溶液中使用约IOmM CaCl2至50禮CaCl20摄取溶液中的其他组分可包括缓冲系统，如TE缓冲液(IOmM Tris,pH7. 4;lmM EDTA)或者 IOmMMOPS(吗啉丙磺酸)(pΗ6· 0)和聚乙二醇(PEG)。据认为，聚乙二醇的作用是融化细胞膜，从而允许该介质的内容物被递送到木霉属的种的菌株的细胞质中，并且质粒DNA得以转移到细胞核。这个融化在很多情况下使质粒DNA的多个拷贝整合到宿主染色体中。通常，将含有密度为105至107/mL、已进行过透化处理的木霉属的种的原生质体或细胞的悬浮液用于转化。将在适当溶液(例如1. 2M山梨醇；50mM CaCl2)中100 μ L体积的这些原生质体或细胞与所需的DNA混合。通常，可将高浓度的PEG加到摄取溶液。可将O.1至I体积的25%PEG4000 (例如0. 25体积)加到原生质体悬浮液。也可向摄取溶液加入添加剂例如二甲基亚砜、肝素、亚精胺、氯化钾等帮助转化。对于其他真菌宿主细胞有类似的程序可使用。参见例如，第6，022，725号美国专利和第6，268，328号美国专利。然后可将混合物在大约0°C下温育10至30分钟的时间。可向混合物加入另外的PEG以进一步增强所需的基因或DNA序列的摄取。通常，可按转化混合物体积的5至15倍体积加入25%PEG4000 ;但是，更大或更小的体积也是适合的。25%PEG4000可为转化混合物体积的约10倍。在可加入PEG后，接着可将转化混合物在室温下或在冰上温育，然后再加入山梨醇和CaCl2的溶液。然后可将原生质体悬浮液进一步加到生长培养基的熔化等分试样。这个生长培养基仅允许转化株的生长。本领域技术人员熟知，可使用类似的程序和方法来转化宿主细胞并在宿主细胞中异源表达其他酶，如淀粉水解酶。2. 5.细朐培养通常将适当的宿主细胞在含有生理盐和营养物的标准培养基中培养，如以下文献中所描述Pourquie 等人，Biochemistey And Genetics OfCellulose Degradation (《纤维素降解的生物化学和遗传学》)，Aubert等人编辑,学术出版社(Academic Press),第71-86页(1988)；以及Ilmen等人，(1997), Appl. Environ. Microbiol (《应用环境微生物学》)，第63卷第1298-1306页。常见的商业制备的培养基包括酵母麦芽浸膏(YM)肉汤、Luria Bertani (LB)肉汤和沙氏葡萄糖肉汤(SD)肉汤。培养条件也是标准的。例如，可将培养物在摇瓶培养或发酵罐中在适当的培养基中在大约28°C下温育，直到达到所需的GSHE表达水平。丝状真菌的合适培养条件可在科学文献中得到，或者从美国模式培养物保藏所和美国真菌遗传资源中心(在互联网上>>http://www. FGSC. net )得到。真菌生长确立后，使细胞暴露于能有效造成或允许淀粉水解酶特别是本文所定义的GSHE的表达的条件。在GSHE编码序列处于诱导型启动子的控制下的情况中，向培养基中以能有效诱导GSHE表达的浓度加入诱导剂，例如糖、金属盐或抗生素。26GSHE活件的鉴定GSHE测定法可评估已转化了编码淀粉水解酶的异源多核苷酸的细胞系对该淀粉水解酶的表达。GSHE测定法可在蛋白质水平、RNA水平上进行，或者通过使用特别针对葡糖淀粉酶的活性和/或产生的功能生物测定法进行。一般来讲，用来分析GSHE的表达的示例性测定法包括RNA印迹法、斑点印迹法(DNA或RNA分析)、RT-PCR (反转录酶聚合酶链反应)、原位杂交、使用适当标记的探针和DNA印迹法。GSHE的产生和/或表达可在样品中直接测量，例如通过直接测量培养基中的还原糖(如葡萄糖)的测定法或者通过测量葡糖淀粉酶活性、表达和/或产生的测定法来直接测量。适合于测定GSHE活性的底物包括颗粒淀粉底物。例如，可通过任何便利的方法来测定葡萄糖浓度，例如通过使用葡萄糖试剂盒Nol5-UV (西格玛化学有限公司(Sigma ChemicalCo.))或者诸如Technicon自动分析仪(加拿大萨斯嘻彻温省(Saskatchewan, Canada))的仪器来测定。合适的葡萄糖氧化酶试剂盒和葡萄糖己糖试剂盒可从实验仪器公司(Instrumentation Laboratory)(美国麻省列克星敦市(Lexington, MA))商购。葡糖淀粉酶活性可通过3，5 二硝基水杨酸(DNS)方法进行测定。参见Goto等人，(1994)，Biosc1.Biotechnol. Biochem(《生物科学生物技术生物化学杂志》),第58卷第49_54页。在一个非限制性例子中，rGSHE水解15%淀粉固形物的水悬浮液中的颗粒淀粉成为至少90重量％、95重量％和97重量％ds葡萄糖的糖溶液。另外,可通过免疫学方法来评估蛋白质表达,如对细胞、组织切片的免疫组织化学染色，或者例如通过蛋白质印迹法或ELISA对组织培养基的免疫测定。这种免疫测定法可用来定性和定量评估GSHE的表达。这种方法的细节是本领域技术人员知道的，并且许多用于实施这种方法的试剂是可商购获得的。GSHE可由重组木霉属宿主表达，表达量大于I克蛋白质每升培养基(g/L)。重组木霉属宿主表达的GSHE的量可大于 2g/L、5g/L、10g/L、20g/L、25g/L、30g/L 或 50g/L 培养基。2. 7. GSHE活件的钝化和/或分离一般地讲，细胞培养物中产生的淀粉水解酶(例如nGSHE或rGSHE)被分泌到培养基中，可例如通过从细胞培养基中除去不想要的组分来进行分离。在一些情况中，GSHE可能以细胞形式产生，这使得需要从细胞裂解物回收。可使用本领域技术人员常规应用的技术，从产生该酶的细胞中纯化该酶。例子包括但不限于亲和层析(Tilbeurgh等人，(1984),FEBS Lett杂志，第16卷第215页)；离子交换色谱方法(Goyal等人，(1991), Biores.Technol(《生物资源技术》),第 36 卷第 37 页；Fliess 等人，(1983) ,Eur. J. Appl. MicrobiolBiotechnol (《欧洲应用微生物学与生物技术杂志》)，第17卷第314页；Bhikhabhai等人，(1984), J. Appl. Biochem (《应用生物化学杂志》),第6卷第336页；以及Ellouz等人,(1987), Chromatography (《色谱》),第396卷第307页),包括用具有高拆分力的材料进行的离子交换(Medve等人，(1998), J. Chromatography (《色谱杂志》),第A808卷第153页；疏水相互作用色谱(Tomaz等人，(1999), J. Chromatography (《色谱杂志》)，第A865卷第123页;两相分配(Brumbauer等人,(1999), Bioseparation (《生物分离》),第7卷第287页)；乙醇沉淀；反相HPLC ;在二氧化硅或阳离子交换树脂上进行的色谱，如DEAE ;色谱聚焦；SDS-PAGE ;硫酸铵沉淀；以及凝胶过滤，例如使用Sephadex G-75。3. LT工艺备件在LT工艺中，可将优选为浆液形式的包含大米底物的组合物与至少一种GSHE接触或温育，以水解颗 粒淀粉。GSHE可以在无细胞提取物中供应(例如，从培养基分离的GSHE),或者在含有表达和分泌GSHE的真菌细胞的培养基(例如发酵液)中供应。可在LT工艺中使用超过一种GSHE。当使用两种或更多种GHSE时，它们可以是葡糖淀粉酶和α-淀粉酶的组合，或者它们可以是多种不同的葡糖淀粉酶或多种不同的α-淀粉酶。当α-淀粉酶添加有葡糖淀粉酶时，α-淀粉酶单位(AAU)与葡糖淀粉酶单位(GU)之比可在15:1至1:15的范围内。在一些实施方案中，该比例可在10:1至1:10、5:1至1:5、4:1至1:4、约2:1至1:4或者约2:1至1:2的范围内。在一些实施方案中，葡糖淀粉酶将与α-淀粉酶同时加到大米底物。在其他实施方案中，可依序加入葡糖淀粉酶和α-淀粉酶。在这个情况中，GSHE可相互间相隔约I至60分钟内或者约I至30分钟内加入。淀粉水解酶可与GSHE—起使用。该淀粉水解酶可以是GSHE。当该淀粉水解酶是GSHE之外的酶时，它以本领域公知的催化淀粉水解的浓度和条件使用。除了 GSHE，淀粉水解酶包括但不限于普鲁兰酶、淀粉酶、纤维素酶、果胶酶和葡聚糖。葡糖淀粉酶向包含大米底物的组合物的加入量为约O. 001至15. O⑶/g浆液干固形物之间，该浆液可调整至10-55%干固形物。在其他实施方案中，葡糖淀粉酶的加入量可为约O. 01至10. O⑶/g干固形物之间、约O. 01至5. O⑶/g干固形物之间、约O. 01至2. OGU/g干固形物之间、约O. 01至1. 5⑶/g干固形物之间、约O. 05至1. 5⑶/g干固形物之间或约
0.1至1. O⑶/g干固形物之间。取决于α -淀粉酶的比活性，α -淀粉酶向包含大米底物的组合物的加入量通常可为约O. 001至5. Okga-淀粉酶/公吨(MT)大米底物。在一些实施方案中，a -淀粉酶的加入量可为约O. 01至5. Okg/MT、约O. 05至4. Okg/MT、约O.1至2. 5kg/MT或者约O. 5至
1.5kg/MT。例如，可向一公吨的淀粉加入约O. 01至1. 5kg的GZYME G997或SPEZYME FRED(杰能科公司(Genencor),其为丹尼斯克公司(Danisco Α/S)的分公司)。在其他实施方案中，GZYME G997 或 SPEZYME FRED 的加入量可为约 O. 05 至1. Okg/MT 之间、约 O.1 至 O. 6kg/MT之间、约O. 2至O. 6kg/MT之间或者约O. 4至O. 6kg/MT之间。可将包含大米底物和 水解酶的混合物在等于或低于构成大米底物的蛋白质的变性温度下进行温育。在一些实施方案中，该温度可为低于约72°C、70°C、68°C、65°C、63°C、60 V、58°C、55 V、50°C >45 V或40°C，但不低于10°C。在其他实施方案中，该过程可在约70°C至50°C之间的温度下进行。在另外的实施方案中，该过程可在约70°C至55°C之间、还有约65°C至55°C之间的温度下进行。该混合物可在以下范围内的pH下进行温育约pH3.0至 ρΗ6· 5、约 ρΗ3· O 至 ρΗ6· O、约 ρΗ3· O 至 ρΗ5· 5、约 ρΗ3· 5 至 ρΗ5· O、约 ρΗ3· O 至 ρΗ4· O、约ΡΗ4. 5至6. 5或者约ρΗ5. O至6. O。该混合物当在以上指明的温度和pH下温育时，可温育例如约2至100小时、约10至100小时、约5至50小时或者约10至24小时的时间。在一些实施方案中，大米底物的至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的干固形物被转化为增溶的淀粉水解物。在一些实施方案中，大米底物的干固形物被完全增溶。该过程的葡萄糖收率，以占总增溶干固形物的百分比计，为至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、95· 5%,96%,96. 5%,97%,97. 5%,98%,98. 5%、99% 或 99. 5%。在24小时时间里，大米底物的至少80%、85%和90%的颗粒淀粉可被增溶和水解。在其他实施方案中，在24小时时间里,大米底物的至少95%的颗粒淀粉可被增溶和水解。在另外其他实施方案中，在24小时时间里，大米底物的至少98%的颗粒淀粉可被增溶和水解。可将温育的浆液的pH降低到约3. O至4. O的pH，以终止酶对大米底物的反应。在温育充分的时间后，可将包含增溶的大米淀粉水解物的级分与温育的浆液分离开来，留下包含基本上不溶性的大米蛋白浓缩物的残余物。本领域技术人员熟知完成分离的方法。一般地讲，这些分离方法中的一些包括离心、常规过滤方法和膜分离过程。3.1.大米蛋白浓缩物大米底物中的大部分淀粉的水解产生出增溶的淀粉级分和含有不溶性大米蛋白的残余物级分。可将增溶的淀粉级分与残余物级分分离开来，该残余物级分称为大米蛋白浓缩物。可将大米蛋白浓缩物例如悬浮在水中并通过过滤器而将其进一步纯化。大米蛋白浓缩物中的蛋白质的重量百分比大于10%、20%、30%、40%或50%。在一些实施方案中，大米蛋白浓缩物的蛋白质含量在约10%至60%、约10%至50%、约20%至45%或约30%至40%的范围内。可通过将以上获得的大米蛋白浓缩物与GSHE和淀粉水解酶在以上指明的温度和PH下进一步温育一段时间，以水解剩余的颗粒淀粉或不溶性淀粉，来获得高纯度大米蛋白浓缩物。如前所述，获得两个级分增溶淀粉和不溶性大米蛋白。可将级分进行分离以获得高纯度大米蛋白浓缩物。可通过在约55°C至60°C的温度下降低pH，例如从ρΗ5· 5降低到ρΗ3· 0-4. O范围内的pH，来终止残余物中剩余的淀粉的酶水解。然后可如上所述将可溶性大米淀粉水解物与残余物分离开来，以获得高纯度大米蛋白浓缩物。可使用第一水解反应中的相同淀粉水解酶，或者可使用另一不同的GSHE和淀粉水解酶的组合。高纯度大米蛋白浓缩物的蛋白质含量(ΝΧ5. 95)通常大于60%、63%、65%、68%、70%和75%。在一些实施方案中，高纯度大米蛋白浓缩物将具有约65%或更高、还有约70%或更高的蛋白质含量。可使用常规和公知的技术，例如真空干燥、喷雾干燥和冷冻干燥，将根据该过程获得的大米蛋白浓缩物或高纯度大米蛋白浓缩物进行干燥。在一些实施方案中，根据本发明获得的大米蛋白浓缩物的水分含量将低于约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%和2%。在一些实施方案中，所获得的高纯度蛋白质浓缩物将被干燥至低于6%、5%、4%、3%、还有2%的水分含量。在一些实施方案中，水分含量将`在约2%至5%之间。3.2.大米蛋白浓缩物的性质与大豆蛋白浓缩物相比，大米蛋白浓缩物或高纯度大米蛋白浓缩物中的某些氨基酸的重量百分比相对较高。例如，在根据本发明获得的大米蛋白浓缩物中，谷氨酸、缬氨酸、亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、天冬氨酸或丙氨酸的量可较高。此外，与通过采用常规高温处理的淀粉加工方法所获得的蛋白质级分相比，根据本文所述的方法获得的蛋白浓缩物和高纯度蛋白浓缩物具有改进的特性。例如，与从常规的HT工艺获得的蛋白质相比，该蛋白浓缩物和高纯度蛋白浓缩物包含在碱性pH水平下特别是在10. O的pH水平下具有更高的溶解度的蛋白质。在一些实施方案中，本发明的大米蛋白浓缩物在PHlO下的蛋白质溶解度将为至少20%、至少40%或至少50%。在另外的实施方案中，与通过HT工艺生产的蛋白浓缩物相比，该蛋白浓缩物和高纯度蛋白浓缩物包括在酸性pH水平下特别是在2. O的pH水平下具有更高的溶解度的蛋白质。在一些实施方案中，在pH2. O下的溶解度将为至少15%、至少20%、至少25%或至少30%。3.3.大米蛋白浓缩物的食品产品大米蛋白浓缩物可用于食品产品中。在这个方面，大米蛋白浓缩物可与其他食品成分、风味增强剂、稳定剂、防腐剂等一起使用。首先将大米蛋白浓缩物用水或其他合适的溶剂分散以形成湿面团，然后与食品产品的其他成分混合。用于这个目的的“湿面团”是这样的面团，其用水或另一合适的溶剂充分分散至适于进行切块和/或挤出及进一步操作。从大米浓缩物形成的湿糊状所含的水或另一合适溶剂的量可比从大豆蛋白制备湿面团所需的量低45重量％。在这个上下文中的“约”意指基于与测量相关的正常误差、相对湿度等，预期在45重量％上下有一定的变动。因此，“约”通常涵盖比大豆蛋白湿面团少40-50重量％的水的面团。所谓“小于”约45%，意指相对水分含量与大豆湿面团相比可例如低40%、35%、30%，前提条件是大米蛋白湿面团仍适于进行切块和/或挤出及进一步操作。大米蛋白浓缩物也可以是食品添加剂。在一个这种实施方案中，大米蛋白浓缩物作为功能食品(例如营养棒或糖果)的添加剂可提供额外的营养价值。大米蛋白浓缩物还可用作补充物或补充物的成分。例如，可将大米蛋白浓缩物添加到食品产品以补充膳食蛋白摄入。大米蛋白浓缩物的用途的非限制性例子包括牛轧糖型棒芯的成分，或者焦糖芯或另一相似的高粘度棒芯中的成分。大米蛋白浓缩物还可添加到预定用于人以外的动物的动物饲料。大米蛋白浓缩物可作为成分添加到动物饲料，且它可构成动物饲料中的大部分蛋白质来源。以下实施例更详细地描述本发明的主题。本文引述的所有参考文献都以引用方式将其全部内容具体并入本文。提供以下实施例是为了说明而非限制受权利要求书保护的本发明。

实施例实施例1用WO 2005/082155 A2中描述的方法产生LT工艺的大米蛋白浓缩物。在本实施例中，将IOkg全米在40kg水中浸泡过夜，同时进行轻微搅动，然后进行粉碎(大于95%通过30目筛)以产生浆液。将浆液的pH调节至pH5. 5。用两种GSHE来催化淀粉的水解来自杰能科-丹尼斯克(Genencor-Danisco)的α -淀粉酶G Zyme+ G997 (2AAU/g淀粉干固形物)
和来自腐质霉属的颗粒淀粉水解葡糖淀粉酶(1. OGAU/g淀粉干固形物)(参见第7，303，899号美国专利，以引用方式并入本文)。将浆液在60°C下温育24小时。用压滤机分离增溶的淀粉级分和含有不溶性大米蛋白的残余物级分，以获得滤饼形式的不溶性大米蛋白。将滤饼悬浮在水中，充分搅拌以混合均匀，然后再次通过压滤机。将来自压滤机的大米蛋白滤饼在60°C真空炉干燥机中干燥，用于进行进一步评估。LT工艺的大米蛋白浓缩物的组成在表I中示出。表I
权利要求
1.一种食品产品，所述食品产品包含通过低温工艺生产的大米蛋白浓缩物，所述工艺包括 (a)用(i)具有颗粒淀粉水解(GSH)活性的酶和(ii)第二淀粉水解酶在72°C或低于72°C的温度下和在3. O至6. 5的pH下水解大米底物中的大部分淀粉一段时间，该时间足以获得增溶的淀粉级分和含有不溶性大米蛋白的残余物级分；和 (b)将所述增溶的淀粉级分与所述残余物级分分离以获得所述大米蛋白浓缩物， 其中所述食品产品中的所述大米蛋白浓缩物为湿面团的形式，该湿面团与从相似数量的大豆蛋白制备的湿面团相比含有小于约45%的水分。
2.根据权利要求1所述的食品产品，其中所述食品产品是食品补充物或食品补充物的成分。
3.根据权利要求1所述的食品产品，其中所述食品产品是功能食品或功能食品的成分。
4.根据权利要求1所述的食品产品，其中所述食品产品是动物饲料添加剂或动物饲料添加剂的成分。
5.根据权利要求1所述的食品产品，其中所述食品产品是食品添加剂。
6.一种制备包含根据权利要求1所述的大米蛋白浓缩物的食品产品的方法，所述方法包括 (a)用(i)具有颗粒淀粉水解(GSH)活性的酶和(ii)第二淀粉水解酶在72°C或低于72°C的温度下和在3. O至6. 5的pH下水解大米底物中的大部分淀粉一段时间，该时间足以获得增溶的淀粉级分和含有不溶性大米蛋白的残余物级分；和 (b)将所述增溶的淀粉级分与所述残余物级分分离以获得所述大米蛋白浓缩物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述具有GSH活性的酶是葡糖淀粉酶。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶衍自腐质霉属、根霉属或曲霉属的菌株。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其中所述第二淀粉水解酶是α-淀粉酶。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述α-淀粉酶衍自细菌来源。
11.根据权利要求6-10中任一项所述的方法，其中所述具有GSH活性的酶通过在木霉属菌株或曲霉属菌株中的异源表达获得。
12.根据权利要求6-11中任一项所述的方法，其还包括纯化所述大米蛋白浓缩物。
13.根据权利要求6-12中任一项所述的方法，其还包括干燥所述大米蛋白浓缩物。
14.根据权利要求6-13中任一项所述的方法，其中所述大米蛋白浓缩物具有至少20%的蛋白质含量。
15.根据权利要求6-14中任一项所述的方法，其中所述大米底物被调成浆液并含有10至55%之间的干固体含量。
16.根据权利要求6-15中任一项所述的方法，其中所述温度在70°C至55°C之间。
17.根据权利要求6-16中任一项所述的方法，其还包括 (a)将在(b)部分中获得的大米蛋白浓缩物用具有GSH活性的酶和淀粉水解酶在3.0至6. 5的pH下和在70°C至55°C的温度下进行酶促水解，以获得包括增溶的淀粉和不溶性大米蛋白的级分；和 (b)将所述级分进行分离以获得高纯度大米蛋白浓缩物。
18.根据权利要求17所述的方法，其还包括 (a)将(d)部分中获得的高纯度大米蛋白浓缩物进行干燥。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中(C)部分的所述淀粉水解酶是α-淀粉酶。
20.根据权利要求17-19中任一项所述的方法，其中所述高纯度大米蛋白浓缩物具有至少60%的蛋白质含量。
全文摘要
在低温下制备的大米蛋白浓缩物表现出改进的功能性和有利的生理好处，包括降低的胆固醇和提高的乳酸脱氢酶活性，而血尿素氮没有提高。该大米蛋白浓缩物较之大豆蛋白浓缩物可用比较少的水制备成湿面团。大米蛋白浓缩物的使用因而改进了含有该浓缩物的食品制品的配制中的加工步骤。该食品产品有利地显示出延长的货架期和改进的可口质构。
文档编号A23J3/34GK103068264SQ201180040723
公开日2013年4月24日 申请日期2011年8月19日 优先权日2010年8月24日
发明者G·段, K·B·雅各布森, J·K·舍蒂, Q·应, T·威尔逊 申请人:丹尼斯科美国公司