专利名称：碱性进料的制作方法
碱性进料本文报道了一种原核细胞(如大肠杆菌菌株)在化学成分限定的培养基中高细胞密度培养从而产生多肽的方法，其中氨基酸通过浓缩的碱性溶液(同时调节培养基的PH并作为氮源)进料。
背景技术：
近年来，蛋白质的生产已经稳步增加并且蛋白质可能成为最大的一群用于治疗近代各种疾病的治疗剂。蛋白质的影响来自于它们的特异性，如特异性靶标识别和结合功能。将细胞培养物用在发酵过程中以产生物质，特别地蛋白质。区分下述两种过程即其中细胞培养物未被遗传修饰并且形成它们本身的代谢产物和其中将生物以使它们产生更大量的它们本身的物质如蛋白或产生外源物质的方式进行遗传修饰。给产生所述物质的生物提供营养性培养基，所述营养性培养基保证生物的存活并且能够产生需要的靶标化合物。已知很多用于这些目的的培养基，所述培养基能够使特定宿主的培养最优化。由 Riesenberg(Riesenberg, D.，等，Curr. Opin. Biotechnol (目前生物技术观点).2 (1991) 380-384)和 Horn (Horn, U.，等，Appl. Microbiol. Biotechnol (应用微生物生物技术).46(1996)524-532)报道大肠杆菌的高细胞密度培养。Riesenberg, D.和Guthke, R. (Appl. Microbiol. Biotechnol (应用微生物生物技术).51 (1999) 422-430)报道了微生物的高细胞密度培养。由Shiloach，J.和Fass，R. (Biotechnol.Advances23 (2005) 345-357)综述了培养大肠杆菌到高细胞密度。在W091/10721中，报道了一种在搅拌的锅炉发酵器中高细胞密度发酵大肠杆菌的方法。在W097/29190中报道了质粒DNA生产和纯化的方法。在DD295867中报道了通过控制溶氧浓度和氧传递速率来控制需氧水下微生物培养物的生长。在EP0866876中报道了通过高细胞密度发酵在大肠杆菌中制备重组蛋白的方法。在W003/048374中，报道了用于制备芳香族氨基酸代谢物或其衍生物的方法。在W097/21829中报道了通过高细胞密度发酵在大肠杆菌中制备重组蛋白的方法。发明概沭已经发现如果将氨基酸以碱性溶液加入培养基中，可以以高细胞密度在化学成分限定的培养基中培养原核细胞，尤其是氨基酸营养缺陷型大肠杆菌K12菌株。本文报道的一个方面是以高细胞密度培养细菌细胞，尤其是大肠杆菌细胞的方法，其中细胞表达重组多肽，其中所述培养包括在培养过程中加入氨基酸的碱性溶液，所述氨基酸选自天冬氨酸盐、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，其中氨基酸在碱性溶液中具有这样的浓度，所述浓度比其在20°C和中性pH的水中的溶解度高，并且其中在培养中的一个时刻培养的细菌细胞的干细胞重量是至少20g/l。本文报道的一个方面是用于生产多肽的方法，所述方法包括下述步骤a)提供细菌细胞，尤其 是大肠杆菌细胞，其包含编码多肽的核酸，b)培养提供的细胞，
c)在培养的过程中用包含氨基酸的碱性溶液调节pH值，所述氨基酸选自天冬氨酸盐、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，d)从细胞或培养基中回收多肽并且由此产生多肽。本文报道的另一个方面是在培养细菌细胞的过程中使用包含氨基酸的碱性溶液来调节pH值。此外，本文报道的一个方面是氨基酸的碱性溶液作为在培养细菌细胞的过程中的进料的应用，其中所述氨基酸选自天冬氨酸盐、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸并且培养多达干细胞重量20g/l以上。下面是如前所述的所有方面的具体实施方案。在一个实施方案中，氨基酸是水溶性差的氨基酸。在一个实施方案中，所述细菌细胞是氨基酸营养缺陷型细胞并且营养缺陷是关于选自天冬氨酸盐、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的氨基酸。在另一个实施方案中，细菌细胞是大肠杆菌细胞或其突变体。在另一个实施方案中，氨基酸在20°C的水中具有50g/l以下的溶解度。在又一个实施方案中，氨基酸在20°C的水中具有40g/l以下的溶解度。在又一个实施方案中，氨基酸选自天冬氨酸盐、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。在又一个实施方案中，氨基酸选自天冬氨酸盐、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、亮氨酸、色氨酸和酪氨酸。在一个实施方案中，氨基酸是亮氨酸。在又一个实施方案中，氨基酸在碱性溶液中具有高于其在20°C的水中溶解度的浓度。在一个实施方案中，所述溶解度是在20°C的水中的溶解度的两倍，在另一个实施方案中，所述溶解度是在20°C的水中的溶解度的三倍。在另一个实 施方案中，所述溶解度高于在20°C和在pH6-8的pH值在水中的溶解度。在一个实施方案中，氨基酸在碱性溶液中具有25g/l以上的浓度，或在又一个实施方案中，具有30g/l以上的浓度，或在又一个实施方案中，具有35g/l以上的浓度。在一个实施方案中，氨基酸在碱性溶液中具有45g/l以上的浓度。在一个实施方案中，氨基酸在碱性溶液中具有约50g/l的浓度。在又一个实施方案中，碱性溶液具有9以上的pH值，在又一个实施方案中，具有10以上的pH值，并且在又一个实施方案中具有10.5以上的pH值。在一个实施方案中，碱性溶液是超过5% (w/v),或10% (w/v)以上,或15% (w/v)以上的氨溶液。在一个实施方案中，碱性溶液是在水中约12. 5% (w/v)的氨溶液。此外，在一个实施方案中，肽是人载脂蛋白Al或其衍生物。在又一个实施方案中，载脂蛋白Al具有选自SEQ ID NO =Ol-SEQ ID NO 35的氨基酸序列。在一个实施方案中，多肽具有选自SEQ IDNO 01, SEQ ID NO :02，SEQ ID NO :34，或 SEQ ID NO 35 的氨基酸序列。发明详沭本文报道了一种用于培养原核细胞，例如氨基酸营养缺陷型细菌细胞的方法，其中将至少一种氨基酸(例如所述细胞对于该氨基酸是营养缺陷型的)，加入碱性溶液中。还发现，如果包含至少一种氨基酸(如对于该氨基酸所述细胞具有营养缺陷)的进料在碱性溶液中被加入培养基中，可以以高细胞密度培养原核细胞，例如氨基酸营养缺陷型大肠杆菌K12菌株。当所述氨基酸在水中的溶解性差时，这尤其是有利的，并且可以通过在碱性溶液中溶解氨基酸来增加溶解度。同时，可以将碱性溶液用于调节培养基的pH值。通过在高度浓缩的单一进料溶液中组合氨基酸溶液和pH调节溶液，可以减少加入的体积，并且由此允许原核细胞的高细胞密度培养。另外，已经发现，在碱性进料溶液中至少45g/l的氨基酸浓度导致重组多肽的增加的产生。在一个实施方案中，用于培养原核细胞的方法包括下述步骤a)提供原核细胞，b)培养原核细胞，c)在原核细胞的培养过程中用包含氨基酸的碱性溶液调节pH值，所述氨基酸选自天冬氨酸盐、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。“氨基酸营养缺陷型原核细胞”是例如由于在包含编码相应的生物合成途径的蛋白的结构基因的基因座中突变或缺失而不能合成必需氨基酸的原核细胞。在不将相应氨基酸加入培养基中的情 况下，细胞不能增殖。营养缺陷可以关于任何氨基酸。原核细胞也可以是关于一种以上氨基酸的营养缺陷型。因此，在一个实施方案中，氨基酸营养缺陷型原核细胞是关于至少一种氨基酸的营养缺陷型。在又一个实施方案中，氨基酸营养缺陷型原核细胞是关于至少一种，至少两种，至少三种，至少四种，至少五种氨基酸的营养缺陷型。在又一个实施方案中，氨基酸营养缺陷型原核细胞是至多5种、至多10种或至多15种氨基酸的营养缺陷型。在又一个实施方案中，氨基酸营养缺陷型原核细胞是关于1-5种氨基酸,或1-3种氨基酸，或关于1-2种氨基酸，或关于一种氨基酸，或关于两种氨基酸或关于三种氨基酸或关于四种氨基酸的营养缺陷型。在一个实施方案中，氨基酸营养缺陷型原核细胞是细菌细胞。在一个实施方案中，细胞是埃希氏菌属(Escherichia)细胞，或芽孢杆菌属(Bacillus)细胞，或乳杆菌属(Lactobacillus)细胞，或棒杆菌属(Corynebacterium)细胞，或酵母(Yeast)细胞(酵母属(Saccharomyces)、念珠菌属(Candida)或毕赤酵母属(Pichia))。在又一个实施方案中，细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)细胞,或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞，或嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)细胞，或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)细胞，或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)酵母细胞。术语“调节值”指在整个培养过程中在预定的水平维持各个值，即持续或以预定的恒定时间间隔检查所述值，并且如果所述值在预定接受范围之外，通过加入校正流体进行改变。例如，术语“调节PH值”指在固定的时间点，即以固定的时间间隔周期性地确定培养基的PH值，并且如果确定的pH值在接受范围之外，如例如O.1pH单位或O. 15pH单位或O. 2pH单位，通过加入校正流体，如酸或碱性溶液，将pH值重新调节到预定的pH值。用于培养原核细胞以及用于培养氨基酸营养缺陷型原核细胞的方法是本领域技术人员已知的(见，例如 Riesenberg, D.，等，Curr. Opin. Biotechnol. 2 (1991) 380-384)。培养可以使用任何方法。在一个实施方案中，培养是批次培养，补料分批培养，灌注培养，半连续培养，或全细胞停留或部分细胞停留培养。培养唯一的需求是必须加入碱性溶液。这种加入也可以是单进料溶液或作为组合的进料和pH调节溶液。用于起始细胞培养的培养基可以是本领域技术人员已知的任何培养基，其中进料的氨基酸浓度在培养基中是低于5g/l，或低于7. 5g/l，或低于10g/l。必须指出，各种化合物浓度必需以预期不会对细胞的生长造成不利干扰的方式进行选择。在一个实施方案中，培养基是限定的葡萄糖-无机盐培养基。在一个实施方案中，培养是高细胞密度培养。术语“高细胞密度培养”指这样的培养方法，其中在培养中的一个时刻培养的原核细胞的干细胞重量是至少10g/l。在一个实施方案中，在培养中的一个时刻干细胞重量是至少20g/l，或至少50g/l，或至少100g/l或超过100g/l。为了达到这样的高细胞密度状态，在培养过程中加入的进料的体积和/或调节溶液的体积必需尽可能得小。例如在Riesenberg,D.,等,Appl. Microbiol. Biotechnol (应用微生物学生物技术).34(1990)77-82中报道了测定干细胞重量的方法。在提供的培养基中的营养物在培养的过程中代谢并且必需补充以避免限制。如果氨基酸具有差的溶解度，仅能够制备并加入低浓缩的进料溶液。为了提供需要量的氨基酸，必需加入大体积的进料溶液。这导致了总培养体积的增加，培养液的稀释，并且因此对于高细胞密度方法是不利的。20种天然存在的氨基酸的溶解度在下表中列出。
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表
权利要求
1.用于培养表达多肽的大肠杆菌(Escherichiacoli)细胞的方法,其特征在于所述培养包括在培养过程中加入氨基酸的碱性溶液，所述氨基酸选自天冬氨酸盐、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸， 其中所述氨基酸在所述碱性溶液中具有高于在20°C和中性pH的水中的溶解度的浓度，并且所述氨基酸具有30g/l以上的浓度，和 其中所述碱性溶液是10% (w/v)以上的氨溶液，和其中培养的细菌细胞的干细胞重量在培养中的一个时刻是至少20g/l。
2.用于产生多肽的方法，所述方法包括下述步骤 a)培养包含编码所述多肽的核酸的大肠杆菌细胞， b)在培养过程中，用包含氨基酸的碱性溶液调节pH值，所述氨基酸选自天冬氨酸盐、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸， c)从细胞或培养基中回收所述多肽并且由此产生所述多肽， 其中所述氨基酸在所述碱性溶液中具有30g/l以上的浓度，和 其中所述碱性溶液是10% (w/v)以上的氨溶液。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于所述细菌细胞是氨基酸营养缺陷型细胞并且营养缺陷是关于选自天冬氨酸盐、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的氨基酸。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于所述碱性溶液具有9以上的pH值。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于所述多肽是人载脂蛋白Al或其衍生物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述载脂蛋白Al具有选自SEQID NO01-35的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述载脂蛋白Al具有选自SEQID NO :01，02，34和35的氨基酸序列。
8.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述氨基酸具有约50g/l的浓度。
9.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述碱性溶液是约12.5% (w/v)的氨在水中的氨溶液。
10.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述氨基酸是亮氨酸。
11.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述碱性溶液包含亮氨酸和脯氨酸。
12.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述碱性溶液是约12.5%(w/v)的氨溶液并且包含浓度各为约50g/l的氨基酸亮氨酸和脯氨酸。
13.氨基酸的碱性溶液作为细菌细胞的培养中的进料的应用，其中所述氨基酸选自天冬氨酸盐、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，并且所述培养是多达20g/l以上的干细胞重量，并且所述氨基酸在所述碱性溶液中具有30g/l以上的浓度，并且所述碱性溶液是10% (w/v)以上的氨溶液。
14.根据权利要求13的应用，其特征在于所述细菌细胞是氨基酸营养缺陷型细胞，并且营养缺陷是关于选自天冬氨酸盐、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的氨基酸。
15.根据权利要求2-12中任一项的方法,其特征在于所述大肠杆菌细胞是氨基酸营养缺陷型大肠杆菌细胞。
全文摘要
本文报道了一种培养细菌细胞的方法，包括加入在碱性溶液中的氨基酸用于pH调节。此外，一个方面是用于产生多肽的方法，包括下述步骤a)提供包含编码多肽的核酸的细菌细胞；b)培养提供的细胞；c)在培养过程中用包含氨基酸的碱性溶液调节pH；d)从细胞或培养基中回收多肽并由此产生多肽。
文档编号C12N1/20GK103068967SQ201180041407
公开日2013年4月24日 申请日期2011年8月25日 优先权日2010年8月30日
发明者克里斯蒂安·尚茨 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司