艰难梭菌抗原的制作方法
【专利摘要】本发明提供了用于在脊椎动物受试者中治疗或预防艰难梭菌(Clostridium?difficile)感染的组合物和方法。所述方法用于向所述脊椎动物受试者施用有效减少或消除或预防艰难梭菌细菌感染的复发和/或诱导针对该蛋白的免疫应答的量的组合物。还提供了在脊椎动物中治疗或预防艰难梭菌感染的方法。
【专利说明】艰难梭菌抗原
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于在脊椎动物受试者中治疗或预防革兰氏阳性细菌艰难梭菌(Clostridium difficile)的感染的组合物和方法。提供了以有效减少、消除或预防感染复发的量向所述脊椎动物受试者施用蛋白质的方法。提供了在生物体中治疗或预防艰难梭菌感染的方法。
【背景技术】
[0002]艰难梭菌是一种人类肠道共生革兰氏阳性细菌，以2-5%的种群量存在。艰难梭菌具有二态生活周期，能够作为休眠但仍有传染性的芽孢和作为代谢活性的产毒素营养细胞存在。肠道中少量艰难梭菌的存在是无症状的；然而，细菌过度生长能够引起严重的和危及生命的疾病，特别是在老年人中。当正常肠道菌群被抗生素治疗消灭时，可能发生艰难梭菌的过度生长。因此，艰难梭菌是抗生素相关腹泻的主要原因，并且能够引起假膜性结肠炎(广泛的结肠炎症)。病原性艰难梭菌菌株产生几种已知毒素。两种这样的毒素，即肠毒素(毒素A)和细胞毒素(毒素B)，造成在感染的患者中观察到的腹泻和炎症。
[0003]住院或留居在疗养院中增加了艰难梭菌感染的风险。据估计，在住院最多2周的患者中染得艰难梭菌的比率为13%，在住院超过4周的患者中为50%。因此，艰难梭菌是常见的医源性病原体，并且在全世界是住院患者发病和死亡的主因。由于艰难梭菌这种生物体形成耐热芽孢，艰难梭菌能够在医院或疗养院环境中长时间残留。一旦芽孢被摄入，由于它们的耐酸性，它们能够存活地通过胃。一旦进入结肠，芽孢可以在暴露于胆汁酸后萌发成营养细胞。
[0004]艰难梭菌感染在最初治疗后的复发是常见问题，因为在25%的进行过首次感染发作治疗的患者中发生疾病的复发。这主要是由于该生物体能够作为芽孢保持在休眠且耐抗生素的状态中这一事实。
[0005]当前用于治疗艰难梭菌感染的疗法针对生物体生活周期的营养阶段。这些治疗包括抗生素例如万古霉素或甲硝哒唑。氟喹诺酮类抗生素例如环丙沙星和左氧氟沙星的使用不幸地导致新的高毒力的且耐抗生素的艰难梭菌菌株的出现。其他的特别是用于预防复发的治疗包括预防性途径，例如使用益生菌以利用非致病生物体例如嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)或布拉氏酵母菌(Saccharomyces boulardii)恢复肠道菌群。通过鉴定影响代谢功能或必需毒力因子的突变，已开发出基于鼠伤寒菌(Typhimurium)的活疫苗。Clin.Microbiol.Rev.5 (1992) 328-342。
[0006]到目前为止，在疫苗方面的尝试集中于A和B毒素以及营养细胞表面蛋白(SLPA)，它们都是由代谢活性细菌产生的蛋白质。因此，所有当前疗法解决由营养阶段细菌造成的原发感染，而不针对由休眠但仍有感染性的芽孢引起的复发。有鉴于可能出现由毒性越来越高且耐药的艰难梭菌菌株引起的传染病，对于在靶向艰难梭菌生活周期的顽固芽孢期的基础上的用于治疗或预防与所述生物体相关的疾病的发生及其复发的有效疫苗组合物或抗体治疗仍存在未满足的需求。[0007]发明概沭
[0008]本文描述了用于在脊椎动物受试者中治疗或预防艰难梭菌感染的组合物和方法。
[0009]在第一方面，本发明提供了含有结合艰难梭菌芽孢多肽或片段的抗体或片段的组合物，其中所述芽孢多肽或片段可以是BclAl、BclA2、BclA3、Alr、SlpA旁系同源物、SlpAHMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD 或 FliD。
[0010]在第二方面，本发明提供了含有结合艰难梭菌芽孢多肽或片段的抗体或片段的组合物，其中所述芽孢多肽或片段可以具有与SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 或 SEQ IDNO:10中所示的氨基酸序列至少80-95%同一的氨基酸序列。
[0011]在第三方面，本发明提供了结合艰难梭菌芽孢多肽或片段的分离的抗体或片段，其中所述多肽或片段可以是BclAl、BclA2、BclA3、Alr、SlpA旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD 或 FliD。
[0012]在第四方面，本发明提供了结合艰难梭菌芽孢多肽或片段的抗体或片段，其中所述多肽或片段可以具有与 SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5, SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:9 或 SEQ ID NO:10 中所示的氨基酸序列至少80-95%同一的氨基酸序列。
[0013]在所述前四个方面 的各种实施方式中，所述抗体或片段可以是多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体、完整免疫球蛋白分子、scFv、嵌合抗体、Fab片段、F(ab’ )2或二硫键连接的Fv0
[0014]在所述前四个方面的其他实施方式中，所述抗体或片段可以具有重链免疫球蛋白恒定结构域，其可以是人IgM恒定结构域、人IgGl恒定结构域、人IgG2恒定结构域、人IgG3恒定结构域、人IgG4恒定结构域或人IgAl/2恒定结构域。
[0015]在所述前四个方面的其他实施方式中，所述抗体或片段可以具有轻链免疫球蛋白恒定结构域，其可以是人IgK恒定结构域或人IgX恒定结构域。
[0016]在所述前四个方面的再进一步的实施方式中，所述抗体或片段可以以至少I X IO9M或至少I X IO10M的亲和常数(Kaff)结合抗原。
[0017]在所述前四个方面的其他实施方式中，所述抗体或其片段可以抑制或延迟芽孢萌发。
[0018]在所述第一和第二方面的某些实施方式中，所述组合物也可以含有结合艰难梭菌毒素A、毒素B的抗体或结合毒素A和毒素B的抗体的组合。在所述第一和第二方面的其他实施方式中，所述组合物还可以含有抗生素例如甲硝哒唑或万古霉素。
[0019]所述前四个方面的组合物可以通过向需要这样的治疗的患者施用有效减少或预防与艰难梭菌相关疾病的量的组合物而使用在治疗所述疾病的方法中，所述量可以是I至100毫克每千克受试者体重的范围内的量。所述组合物可以静脉内(IV)、皮下(SC)、肌肉内(IM)或口服施用。
[0020]在前四个方面的其他实施方式中，所述组合物可通过向动物施用有效量的所述组合物而用于被动免疫的方法中。
[0021]在第五方面，本发明提供了通过以在受试者中有效诱导免疫应答的量向所述受试者施用一定量的艰难梭菌芽孢多肽或片段或变体和药学上可接受的佐剂在所述受试者中诱导免疫应答的方法，所述芽孢多肽或片段或变体可以是BclAl、BclA2、BclA3、Air、SlpA旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD 或 FliD。
[0022]在第六方面，本发明提供了通过以在受试者中有效诱导免疫应答的量向所述受试者施用艰难梭菌芽孢多肽或片段或变体和药学上可接受的佐剂在所述受试者中诱导免疫应答的方法，所述芽孢多肽或片段或变体可以具有与SEQ ID N0:U SEQ ID NO:2、SEQ IDN0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列至少80-95%同一的氨基酸序列。
[0023]在第七方面，本发明提供了难过以在需要治疗的受试者中有效减少或预防感染的量向所述受试者施用一定量的艰难梭菌芽孢多肽或片段或变体和药学上可接受的佐剂在所述受试者中减少或预防艰难梭菌感染的方法，所述芽孢多肽或片段或变体可以是BclAl、BclA2、BclA3、Air、SlpA 旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD 或 FliD。
[0024]在第八方面，本发明提供了以在需要治疗的受试者中有效减少或预防感染的量向所述受试者施用艰难梭菌芽孢多肽或片段和药学上可接受的佐剂在所述受试者中减少或预防艰难梭菌感染的方法，所述芽孢多肽或片段可以具有与SEQ ID NO:U SEQ ID NO:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQID NO:9或SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列至少80-95%同一的氨基酸序列。
[0025]在第五至第八方面的各种实施方式中，所述药学上可接受的佐剂是白介素12或热休克蛋白。在其他实施方式中，所述施用是口服、鼻内、静脉内或肌肉内施用。在其他实施方式中，所述变体是突变体，其可以是融合蛋白。所述融合蛋白可以含有艰难梭菌毒素A或B的序列，例如TcdA的N-末端催化结构域、TcdB的N-末端催化结构域、TcdB的C-末端片段4或TcdA的C-末端受体结合片段。或者，所述融合蛋白可以是蛋白质BclAl、BclA2、BclA3、Alr、SlpA 旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn_S0D 或 FliD 及其片段中任一种，或具有 SEQ ID NO:USEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO -J、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO:10 中所示的氨基酸序列的蛋白质及其片段，与所述蛋白质组的另一个成员的融合体。
[0026]在第九方面，本发明提供了含有有效免疫量的分离多肽或片段或变体和药学上可接受的载体的组合物，其中所述组合物在受试者中有效诱导针对艰难梭菌感染的免疫应答，并且其中所述分离的多肽或片段或变体含有艰难梭菌芽孢多肽或片段，其可以是BclAl、BclA2、BclA3、Air、SlpA 旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD 或 FliD。
[0027]在第十方面，本发明提供了含有有效免疫量的分离多肽或片段或变体和药学上可接受的载体的组合物，其中所述组合物在受试者中有效诱导针对艰难梭菌感染的免疫应答，并且其中所述分离的多肽或片段或变体具有与SEQ ID NO=USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 或SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列至少80-95%同一的氨基酸序列。
[0028]在所述第九和第十方面的各种实施方式中，所述组合物还含有药学上可接受的佐剂，其可以是水包油型乳液、ISA-206、Quil A、白介素12或热休克蛋白。在这些方面的进一步实施方式中，所述变体是突变体，其可以是融合蛋白。所述融合蛋白可以含有艰难梭菌毒素A或B的序列，例如TcdA的N-末端催化结构域、TcdB的N-末端催化结构域、TcdB的C-末端片段4或TcdA的C-末端受体结合片段。或者，所述融合蛋白可以是蛋白质BclAl、BclA2、BclA3、Air、SlpA 旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD 或 FliD 及其片段中任一种，或具有 SEQ ID NO:USEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:
5、SEQID NO:6、SEQ ID NO -J、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO:10 中所示的氨基酸序列的蛋白质及其片段，与所述蛋白质组的另一个成员的融合体。
[0029]在第十一方面，本发明提供了通过以在需要治疗的受试者中有效减少或预防感染的量向所述受试者施用一定量的编码艰难梭菌芽孢多肽或片段或变体的核酸和药学上可接受的佐剂在所述受试者中减少或预防艰难梭菌感染的方法，所述多肽或片段或变体可以是 BclAl、BclA2、BclA3、Alr、SlpA 旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn_S0D 或 FliD。[0030]在第十二方面，本发明提供了通过以在需要治疗的受试者中有效减少或预防感染的量向所述受试者施用一定量的编码艰难梭菌芽孢多肽或片段或变体的核酸和药学上可接受的佐剂在所述受试者中减少或预防艰难梭菌感染的方法，所述芽孢多肽或片段或变体具有与 SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:
6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 或 SEQ ID NO:10 中所示的氨基酸序列至少80-95%同一的氨基酸序列。
[0031]在所述第十一和第十二方面的各种实施方式中，所述药学上可接受的佐剂可以是水包油型乳液、ISA-206、Quil A、白介素12或热休克蛋白。在这些方面的进一步他实施方式中，所述变体是突变体，其可以是融合蛋白。所述融合蛋白可以含有艰难梭菌毒素A或B的序列，例如TcdA的N-末端催化结构域、TcdB的N-末端催化结构域、TcdB的C-末端片段4或TcdA的C-末端受体结合片段。或者，所述融合蛋白可以是蛋白质BclAl、BclA2、BclA3、Air、SlpA 旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH 和 Fe-Mn-SOD 及其片段中任一种，或具有 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6,SEQ ID N0:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO:10 中所示的氨基酸序列的蛋白质及其片段，与所述蛋白质组的另一个成员的融合体。
[0032]在第十三方面，本发明提供了编码艰难梭菌芽孢多肽或片段或变体的分离的核酸，所述芽孢多肽或片段或变体可以是BclAl、BclA2、BclA3、Air、SlpA旁系同源物、SlpAHMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD 或 FliD。
[0033]在第十四方面，本发明提供了编码艰难梭菌芽孢多肽或片段或变体的分离的核酸，其中所述核酸编码与 SEQ ID NO:USEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5,SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:9 或 SEQ ID NO:10 中所示的氨基酸序列至少80-95%同一的氨基酸序列。
[0034]在所述第十三和第十四方面的各种实施方式中，所述变体是突变体，其可以是融合蛋白。所述融合蛋白可以含有艰难梭菌毒素A或B的序列，例如TcdA的N-末端催化结构域、TcdB的N-末端催化结构域、TcdB的C-末端片段4或TcdA的C-末端受体结合片段。或者，所述融合蛋白可以是蛋白质BclAl、BclA2、BclA3、Air、SlpA旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD 或 FliD 及其片段中任一种，或具有 SEQ ID NO:U SEQ ID NO:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQID NO:9和SEQ ID NO:10中所不的氣基酸序列的蛋白质及其片段,与所述蛋白质组的另一个成员的融合体。
[0035]在所述第十三和第十四方面的再进一步的实施方式中，所述核酸包含在表达载体中，其可以是细菌或哺乳动物表达载体。哺乳动物表达载体的实例包括含有CMV启动子的表达载体。其他哺乳动物表达载体包括pcDNA3002Neo或pET32a。细菌表达载体的实例包括pET32a。在这些方面的某些实施方式中，所述表达载体可以包含在宿主细胞中，例如在哺乳动物细胞表达的情况下的HEK293F、NSO-U CHO-KU CHO-S或PER.C6，以及在细菌表达的情况下的大肠杆菌(E.coli)。
[0036]附图简沭
[0037]图1A示出了用Asc I和Hpa I对BclA3_pcDNA3002Neo的限制性消化以证实质粒中BclA3插入片段的存在。从pcDNA3002Neo质粒切除的BclA3的预期大小为1.6kb，且pcDNA3002Neo质粒为6.8kb。(第I道:未消化的BclA3_pcDNA3002Neo质粒；第2道:消化的 BclA3-PcDNA3OO2Neo 质粒)。
[0038]图1B示出了纯化的BclA3蛋白的SDS-PAGE和western印迹分析。使用AktaPurifier，将BclA3转染的上清液在HisTRAP Ni柱上纯化。将洗脱的蛋白在浓缩前以15 μ L的体积上样到SDS-PAGE凝胶上(左)。(第I道:纯化的BclA3蛋白)。所述蛋白质的预期大小为44kDa。第二块凝胶(右)以Syg蛋白质跑样，转移到硝酸纤维素膜上并用针对所表达蛋白质的His标签的抗体探测(第I道:纯化的BclA3蛋白-8 μ g)。[0039]图2A示出了用AscI和HpaI对Alr_pcDNA3002Neo的限制性消化以证实质粒中Alr插入片段的存在。从pcDNA3002Neo质粒切除的Alr的预期大小为1.3kb，和空pcDNA3002Neo质粒为6.8kb。(第I道:未消化的Alr_pcDNA3002Neo质粒；第2道:消化的Alr-pcDNA3002Neo 质粒)。
[0040]图2B示出了纯化的Alr蛋白质的SDS-PAGE分析。使用Akta PurifierJ^AlrR染的上清液在HisTRAP Ni柱上纯化。将含有和不含巯基乙醇(2ΜΕ)的洗脱蛋白质以2 μ g的量上样到SDS-PAGE凝胶上(左)。(第I道:纯化的Alr蛋白质_2 μ g ;第2道:纯化的Alr蛋白质-2 μ g+2ME)。所述蛋白质的预期大小为45kDa。第二凝胶(右)以~30 μ g蛋白质跑样以加大蛋白+/-2ME之间的差异(第3道:纯化的Alr蛋白质-2 yg ;第4道:纯化的Alr蛋白质-2yg+2ME)。
[0041]图2C示出了纯化的Alr蛋白的western印迹分析。使用Akta PurifierJ^Alr转染的上清液在HisTRAP Ni柱上纯化。将含有和不含β-巯基乙醇(2ΜΕ)的洗脱蛋白质以2yg的量上样到SDS-PAGE凝胶上，然后转移到硝酸纤维素膜上并用抗his抗体(1:3000)探测(第2道:纯化的Alr蛋白质-2 μ g ;第3道:纯化的Alr蛋白质_2 μ g+2ME)。所述蛋白质的预期大小为45kDa。
[0042]图3A显示了用AscI和HpaI对SlpA para-pcDNA3002Neo的限制性消化以证实质粒中SlpA旁系同源物插入片段的存在。从pcDNA3002NeO质粒切除的SlpA旁系同源物的预期大小为1.9kb，和空pcDNA3002Neo质粒为6.8kb。(第I道:未消化的SlpApara-pcDNA3002Neo 质粒；第 2 道:消化的 SlpA para-pcDNA3002Neo 质粒)。
[0043]图3B示出了纯化的SlpA旁系同源物的SDS-PAGE和western印迹分析。使用AktaPurifier，将SlpA旁系同源物转染的上清液在HisTRAP Ni柱上纯化。将含有和不含β-巯基乙醇(2ΜΕ)的洗脱蛋白质以2 μ g的量上样到SDS-PAGE凝胶上(左和中)。(第I道:纯化的SlpA旁系同源物蛋白质_2μ g ;第2道:纯化的SlpA旁系同源物蛋白质_2 μ g+2ME)。所述蛋白质的预期大小是84kDa。在另一凝胶(右)中以2yg蛋白质跑样，将其转移到硝基纤维素膜上，并用针对所表达蛋白质的His标签的抗体探测(第4道:纯化的SlpA旁系同源物蛋白质-2 μ g)。
[0044]图4A示出了用AscI和HpaI对CD1021_pcDNA3002Neo的限制性消化以证实质粒中CD1021插入片段的存在。从pcDNA3002Neo质粒上切除的CD1021的预期大小为1.8kb，和空 pcDNA3002Neo 质粒为 6.8kb。(第 I 道:未消化的 CD1021_pcDNA3002Neo 质粒；第 2 道:消化的 CDlO21-PcDNA3OO2Neo 质粒)。
[0045]图 4B 示出了纯化的 CD1021 的 SDS-PAGE 分析。使用 Akta Purif ier，将 CD1021 转染的上清液在HisTRAP Ni柱上纯化。将洗脱蛋白质以2 μ g的量上样到SDS-PAGE凝胶上(第I道:纯化的⑶1021蛋白质；第2道:纯化的⑶1021蛋白质+2ME)。所述蛋白没有糖基化时的预期大小为65kDa。
[0046]图4C示出了纯化的⑶1021的western印迹分析。另一凝胶以2 μ g蛋白质跑样，将其转移至硝基纤维素膜上，并用针对所表达蛋白质的His标签的抗体探测(左侧印迹上的第I道:纯化的⑶1021蛋白质+2ME ;右侧印迹上的第I道:纯化的⑶1021蛋白质)。 [0047]图5示出了重组艰难梭菌毒素A片段4和毒素B片段I区域和完整Ted A和B毒素的SDS-PAGE分析。(A)胶体蓝染色的SDS-PAGE凝胶上的毒素A片段4 (第I道)。毒素A片段4的预期大小为114kDa。(B)抗His抗体探测的western免疫印迹上的毒素B片段I (第I道)。毒素B片段I的预期大小为82kDa。(C)胶体蓝染色的SDS-PAGE凝胶上的完整毒素B (第I道)和完整毒素A (第2道)。毒素A的预期大小为308kDa,毒素B的预期大小为270kDa。
[0048]图6示出了纯化的FliD的SDS-PAGE。使用Akta Purif ier，将FliD转染的上清液在HisTRAP Ni柱上纯化。将洗脱蛋白质以2 μ g的量上样到SDS-PAGE凝胶上(第I道:纯化的FliD蛋白质+2ME ;第2道:纯化的FliD蛋白质)。所述蛋白质没有糖基化时的预期大小为55kDa。
[0049]图7示出了检测小鼠血清中的⑶1021抗体与来自于菌株ATCC43255的分离的艰难梭菌芽孢的结合的ELISA结果。
[0050]图8示出了检测小鼠血清中的FliD抗体与来自于菌株ATCC43255的分离的艰难梭菌芽孢的结合的ELISA结果。
[0051]图9示出了检测小鼠血清中的Alr抗体与来自于菌株ATCC43255的分离的艰难梭菌芽孢的结合的ELISA结果。
[0052]图10示出了检测小鼠血清中的BclA3抗体与来自于菌株ATCC43255的分离的艰难梭菌芽孢的结合的ELISA结果。
[0053]图11示出了检测小鼠血清中的FliD抗体与纯化的艰难梭菌FliD蛋白质的结合的ELISA结果。
[0054]图12示出了检测小鼠血清中的Alr抗体与纯化的艰难梭菌Alr蛋白质的结合的ELISA结果。
[0055]图13示出了检测小鼠血清中的BclA3抗体与纯化的艰难梭菌BclA3蛋白质的结合的ELISA结果。
[0056]图14示出了检测小鼠血清中的⑶1021抗体与纯化的艰难梭菌⑶1021蛋白质的结合的ELISA结果。[0057]图15示出了检验抗芽孢抗体对ATCC43255芽孢萌发的抑制效应的萌发分析的结
果O
[0058]图16示出了艰难梭菌芽孢抗原的考马斯蓝染色。
[0059]图17示出了用兔抗艰难梭菌芽孢pAb探测的艰难梭菌芽孢抗原的Western印迹。
[0060]图18示出了用来自于Alr免疫小鼠的血清探测的艰难梭菌芽孢抗原的Western印迹。
[0061]图19示出了用来自于BclA3免疫小鼠的血清探测的艰难梭菌芽孢抗原的Western印迹。 [0062]图20示出了用来自于CD1021免疫小鼠的血清探测的艰难梭菌芽孢抗原的Western 印迹。
[0063]图21示出了用来自于FliD免疫小鼠的血清探测的艰难梭菌芽孢抗原的Western印迹。
[0064]详细描沭
[0065]总的来说，本发明涉及用于在脊椎动物受试者中预防或治疗革兰氏阳性生物体艰难梭菌的细菌感染的组合物和方法。提供了用于诱导针对艰难梭菌感染的免疫应答的方法。所述方法用于向需要的脊椎动物受试者施用有效量的蛋白质或药剂以减少、消除或预防艰难梭菌的细菌感染或带菌状态。
[0066]提供了用于在受试者中诱导针对艰难梭菌细菌的免疫应答的组合物和方法，包括以在受试者中有效诱导免疫应答的量向受试者施用包含分离的多肽(例如艰难梭菌芽孢抗原)和佐剂的组合物。所述方法可用于产生抗体，其用于被动免疫或作为疫苗的组分以防止艰难梭菌的感染或感染复发。
[0067]应该理解，本发明不限于特定方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，它们当然可以改变。还应该理解，本文中使用的术语仅仅是出于描述特定方面的目的，并且不打算是限制性的。当在本说明书和随附的权利要求书中使用时，单数形式“一”、“一个”或“该”包括复数指称物，除非内容明确指明不是如此。
[0068]当在本文中用于指称可测量的值例如量、时间长度等时，术语“约”意味着涵盖与指定值有± 20 %或± 10 %、更优选地± 5 %、甚至更优选地± I %、且更优选地±0.1%的变异，因为这样的变异适合于执行所公开的方法。
[0069]除非另有定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。尽管在实践中可以使用与本文所描述的相似或等同的任何方法和材料来测试本发明，但在本文中描述了优选的材料和方法。
[0070]“脊椎动物”、“哺乳动物”、“受试者”、“哺乳动物受试者”或“患者”可互换使用，且是指哺乳动物例如人类患者和非人类灵长动物，以及实验动物例如兔、大鼠和小鼠、奶牛、马、山羊和其他动物。动物包括所有脊椎动物例如哺乳动物和非哺乳动物，例如小鼠、绵羊、狗、奶牛、禽类、鸭、鹅、猪、鸡、两栖动物和爬行动物。
[0071]术语“佐剂”是指以非特异性方式起作用以提高对特定抗原或抗原组合的免疫应答的药剂，因此例如减少任何给定组合物中所需的抗原的量和/或降低产生针对目标抗原的充分免疫应答所需的注射频率。参见例如A.C.Allison J.Reticuloendothel.Soc.(1979)26:619-630。这样的佐剂在下面进一步描述。术语“药学上可接受的佐剂”是指能够安全地施用于受试者并可接受用于制药应用的佐剂。
[0072]当在本文中使用时，“定植”是指哺乳动物的肠道中艰难梭菌的存在。
[0073]“带菌状态”是细菌例如艰难梭菌可以在正常受试者中生长而不引起受试者患病的过程。带菌状态是环境、宿主和病原体的非常复杂的相互作用。各种因素控制无症状带菌状态与疾病状态。因此，本发明的一个方面包括治疗或预防带菌状态。
[0074]“治疗”或“处理”是指⑴阻止感染或重新感染，例如预防，或(ii)减轻或消除目标疾病的症状，即治疗。“治疗”或“处理”可以是指施用包含目标多肽例如艰难梭菌芽孢抗原或针对这些抗原产生的抗体的组合物。使用所述组合物治疗受试者可以预防或降低感染的风险和/或诱导针对目标多肽的免疫应答。治疗可以是预防性的(以阻止或延迟疾病的发作，或阻止其临床或亚临床症状的表现)或者可以是在疾病表现后治疗性地抑制或改善症状。
[0075]“预防”或“防止”是指用多肽或抗体组合物的预防性给药或疫苗接种。
[0076]“治疗有效量”或“有效减少或消除细菌感染的量”或“有效量”是指足以预防艰难梭菌细菌感染，或改善(例如减轻、减少、降低)与艰难梭菌细菌感染相关的至少一种症状，或诱导针对艰难梭菌抗原的免疫应答的多肽或抗体的量。组合物的施用不是必须消除艰难梭菌细菌感染的症状，只要化合物施用的益处超过害处即可。同样地，当在本文中用于指称艰难梭菌细菌感染时，术语“治疗”不打算指受试者必需从感染治愈或其所有临床征兆被消除，只要通过组合物的施用实现受试者状况的一些缓解或改善即可。
[0077]当在本文中使用时，术语“免疫应答”是指免疫系统细胞对在免疫细胞中产生生物化学变化的外部或内部刺激(例如抗原、细胞表面受体、细胞因子、趋化因子和其他细胞)的反应，其引起免疫 细胞迁移、杀死靶细胞、细胞吞噬作用、抗体产生、免疫应答的其他可溶性效应物等。
[0078]“保护性免疫”或“保护性免疫应答”意指受试者对组合物发起主动免疫应答，以使得在随后暴露于艰难梭菌细菌或细菌激发后，受试者能够对抗感染。因此，保护性免疫应答一般在受试者中降低随后暴露于艰难梭菌细菌时引起的发病和死亡的发生率。保护性免疫应答一般也减少艰难梭菌细菌在受试者中的定植。
[0079]“主动免疫应答”是指受试者对抗原例如艰难梭菌芽孢抗原的免疫原性反应。具体来说，该术语意指在受试者群体中具有一定益处的对随后暴露于艰难梭菌细菌或抗原的任何水平的保护，不论所述保护采取的是降低死亡率、减少症状例如胃胀或腹泻、防止复发还是降低疾病的任何其他有害效应等的形式，也不论所述保护是部分的还是完全的。“主动免疫应答”或“主动免疫”的特征在于“在遇到免疫原后宿主组织和细胞的参与。它一般涉及淋巴网状组织中具有免疫能力的细胞的分化和增殖，其导致抗体的合成或细胞介导的反应性的发生或两者。” Herbert B.Herscowitz, “Immunophysiology:CellFunction and Cellular Interactions in Antibody Formation,，，Immunology:BasicProcessesl 17 (Joseph A.Bellanti ed., 1985)。换句话说,主动免疫应答由宿主在由于感染或在本发明的情形中由于组合物的施用而暴露于免疫原后发动。主动免疫可以与被动免疫形成对照，后者通过“预先形成的物质(例如抗体、转移因子、胸腺移植物、白介素-2)从主动免疫的宿主向未免疫宿主的转移”来获得。同上。
[0080]“被动免疫”一般是指将预制抗体的形式的主动体液免疫力从一个个体转移到另一个个体。因此，被动免疫是可以通过抗体转移获得的短期免疫的形式，所述抗体可以以几种可能的形式施用，例如作为人类或动物血浆或血清、作为用于静脉内(IVIG)或肌肉内(IG)使用的合并的动物或人类免疫球蛋白、作为来自于被免疫受试者或从疾病恢复的供体的高滴度动物或人类IVIG或IG以及作为单克隆抗体。被动转移可以预防性地用于阻止疾病发作，以及可用于几种类型的急性感染的治疗。通常，源自于被动免疫的免疫力仅仅持续短时间，并提供即时保护，但是身体不发生记忆，因此患者具有晚些时候被相同病原体感染的风险。
[0081]多肽
[0082] 术语“多肽”或“肽”是指氨基酸聚合物，不论聚合物的长度如何；因此，肽、寡肽和蛋白质包括在多肽的定义中。该术语也不指定或排除多肽的表达后修饰，例如，包含糖基、乙酰基、磷酸酯基、脂基等的共价连接的多肽明确地被术语多肽所涵盖。在所述定义中还包括含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然存在的氨基酸、仅天然存在于非相关生物系统中的氨基酸、来自于哺乳动物系统的修饰氨基酸等)的多肽、具有取代的键的多肽以及本领域中已知的天然存在和非天然存在的其他修饰。
[0083]术语“分离的蛋白质”、“分离的多肽”或“分离的肽”是就其来源或衍生源来说，(I)不伴有在其本原状态下与其天然相伴的组分，(2)不含来自于同一物种的其他蛋白质，(3)由来自于不同物种的细胞表达，或(4)自然界中不存在的蛋白质、多肽或肽。因此，化学合成或在不同于其天然来源细胞的细胞系统中合成的肽与其天然相伴组分“分离”。也可以使用本领域公知的蛋白质纯化技术，通过分离而使蛋白质基本上不含天然相伴的组分。
[0084]在本发明的意义中，术语“多肽”、“蛋白质”、“肽”、“抗原”或“抗体”包括一般在能够在受试者中诱导免疫应答或在抗体的情况下结合抗原方面表现出生物活性的变体、类似物、直系同源物、同源物和衍生物及其片段。
[0085]本发明的多肽包括源自于艰难梭菌芽孢抗原或其片段的氨基酸序列，其对应于天然存在的蛋白质或对应于变体蛋白质的氨基酸序列，即其中少数氨基酸被置换、添加或缺失但其保留基本上相同的免疫性质的天然存在蛋白质的氨基酸序列。此外，这样的衍生部分可以被氨基酸进一步修饰，特别是在N-和C-末端，以使得多肽或片段在构象上受限和/或允许在完成适当的化学作用后偶联到免疫原性载体上。本发明的多肽涵盖源自于艰难梭菌芽孢抗原的氨基酸序列的功能活性变体多肽，其中氨基酸已被缺失、插入或置换而基本上不损害其免疫性质，即这样的有功能活性变体多肽保留了基本的肽生物学活性。通常，这样的功能变体多肽具有与例如SEQ ID No:1至4中的氨基酸序列同源、优选地高度同源的氨基酸序列。
[0086]在一种实施方式中，这样的功能活性变体多肽显示出与选自SEQ ID No:l至4的氨基酸序列至少 60%,65%,70%,75%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性。多肽的序列相似性，其也被称为序列同一性，通常使用序列分析软件来测量。蛋白质分析软件使用为各种置换、缺失和其他修饰(包括保守氨基酸置换)指派的相似性量度值来匹配相似的序列。例如，GCG含有程序例如“Gap”和“Bestfit”，其可以使用缺省参数来确定密切相关的多肽(例如来自于不同物种的同源多肽)之间或野生型蛋白与其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见例如GCG6.1版。也可以使用GCG6.1版中的程序FASTA，使用缺省或推荐的参数来比较多肽序列。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供了质询和检索序列之间的最佳重叠区域的比对和百分序列同一性(Pearson,Methods Enzymo1.183:63-98(1990)；Pearson, Methods Mol.Biol.132:185-219 (2000))。当将本发明的序列与含有来自于不同生物体的大量序列的数据库进行比较时，可选的算法是计算机程序BLAST、特别是blastp或 tblastn，其使用缺省参数。参见例如 Altschul 等，J.Mol.Biol.215 =403-410 (1990)；Altschul 等，Nucleic Acids Res.25:3389-402(1997)。
[0087]功能活性的变体包含天然存在的功能活性的变体例如等位基因变体和种变体，以及可以通过例如诱变技术或通过直接合成来产生的非天然存在的功能活性的变体。
[0088]功能活性变体可以表现出例如与本文公开的艰难梭菌芽孢抗原的氨基酸序列至少 60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性，并仍保留生物活性。当这种比较需要比对时，将序列进行比对以获得最大同源性。变异位点可以发生在序列中的任何位置，只要生物活性与本文公开的艰难梭菌芽孢抗原基本上相似，例如诱导免疫应答的能力。关于如何得到表型沉默的氨基酸置换的指导提供在Bowie等，Science, 247:1306-1310(1990)中，其教导为了研究氨基酸序列对改变的耐受性，存在两种主要策略。第一种策略利用进化过程中自然选择的氨基酸置换的耐受性。通过对不同物种中的氨基酸序列进行比较，可以确认在物种之间保守的氨基酸位置。这些保守的氨基酸对蛋白质功能可能是重要的。相反，其置换被自然选择所耐受的氨基酸位置表示了对蛋白质功能来说不关键的位置。因此，可以修饰耐受氨基酸置换的位置而仍维持修饰多肽的特定免疫原性活性。
[0089]第二种策略使用遗传工程以在克隆基因的特定位置处引入氨基酸变化，以鉴定对蛋白质功能来说关键的 区域。例如，可以使用定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham等，Science, 244:1081-1085 (1989))。然后可以测试得到的变体多肽的特定生物学活性。
[0090]按照Bowie等，这两种策略揭示出蛋白质对氨基酸置换的惊人的耐受性。作者还指出在蛋白质中某些氨基酸位置处可能容许哪些氨基酸改变。例如，埋得最深或最内部(在蛋白质的三级结构内)的氨基酸残基要求非极性侧链，而一般来说表面或外部侧链的很少特征是保守的。
[0091]将突变引入到蛋白质的氨基酸中的方法对于本领域技术人员来说是公知的。参见例如 Ausubel 主编的 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons,Inc.(1994) ;T.Maniatis,E.F.Fritsch 和 J.Sambrook,Molecular Cloning:A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)。
[0092]也可以使用可商购的试剂盒例如“QuikChange定点诱变试剂盒” (Stratagene)或直接通过肽合成来引入突变。通过替换对多肽功能没有显著影响的氨基酸产生肽的功能活性变体可以由本领域技术人员来实现。
[0093]可以在本发明的多肽中进行的一种类型的氨基酸置换是保守氨基酸置换。“保守氨基酸置换”是将氨基酸残基用具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链R基团的另一种氨基酸残基置换的氨基酸置换。一般来说，保守氨基酸置换不显著改变蛋白质的功能性质。在两个或以上氨基酸序列通过保守置换而彼此不同的情况下，序列百分同一性或相似性程度可以向上调整以对于置换的保守性质进行校正。进行这种调整的手段对于本领域技术人员来说是公知的。参见例如Pearson, Methods Mol.Biol.243:307-31 (1994)。[0094]具有化学性质相似的侧链的氨基酸组的实例包括:1)脂族侧链:甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂族羟基侧链:丝氨酸和苏氨酸；3)含有酰胺的侧链:天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链:苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链:赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链:天冬氨酸和谷氨酸；以及7)含硫侧链:半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸置换组是:缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
[0095]或者，保守置换是在Gonnet 等，Science256:1443-45(1992)中公开的 PAM250 对数似然性矩阵中具有正值的任何改变。“轻度保守”置换是在PAM250对数似然性矩阵中具有非负值的任何改变。[0096]也可以使用杂交技术分离功能活性变体。简单来说，使用与编码目标肽、多肽或蛋白例如艰难梭菌芽孢抗原的全部或部分核酸序列具有高同源性的DNA来制备功能活性肽。因此，本发明的多肽还包括功能上等同并且由与编码任一种艰难梭菌芽孢抗原的核酸或其互补序列杂交的核酸分子编码的实体。本领域技术人员可以使用容易获得的密码子表方便地确定编码本发明的肽的核酸序列。如此，这些核酸序列未在本文中给出。
[0097]编码功能活性变体的核酸分子也可以使用编码目标肽、多肽、蛋白质、抗原或抗体例如艰难梭菌芽孢抗原的核酸分子DNA的一部分作为探针，通过基因扩增方法例如PCR来分离。
[0098]出于本发明的目的，应该考虑到本发明的几种多肽、蛋白质、肽、抗原或抗体可以组合使用。可以设想所有可能的组合类型。例如，可以使用包含一种以上多肽(优选选自本文中公开的艰难梭菌芽孢抗原)的抗原。在某些实施方式中，抗原可以包括一种或多种芽孢抗原与源自于营养细胞的抗原例如毒素A或B组合。同样的序列可以以几个拷贝使用在相同多肽分子上，或者其中不同氨基酸序列的肽可以使用在相同多肽分子上；不同的肽或拷贝可以彼此直接融合或用适当的连接物分隔开。当在本文中使用时，术语“多聚化的(多)肽”是其中指氨基酸序列不同或相同的多肽存在于单一多肽分子上的两种组合类型。因此，在单一多聚化多肽分子上可以存在2至约20个相同和/或不同的肽。
[0099]在本发明的一种实施方式中，本发明的肽、多肽、蛋白质或抗原源自于天然来源，或者从细菌来源分离。因此，可以使用标准的蛋白质纯化技术从来源分离本发明的肽、多肽、蛋白质或抗原。
[0100]或者，本发明的肽、多肽和蛋白质可以化学合成或使用重组DNA技术产生。例如，本发明的肽、多肽或蛋白质可以通过本领域公知的固相程序来合成。适合的合成可以利用“T-boc”或“F-moc”程序来进行。环状肽可以通过固相程序，在全自动装置中使用公知的“F-moc”程序和聚酰胺树脂来合成。或者，本领域技术人员应该了解手动执行所述过程所必需的实验室程序。用于固相合成的技术和程序描述在E.Atherton和R.C.Sheppard的“Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach，，，IRL at Oxford UniversityPress 出版(1989)和 D.Andreau 等的 “Methods in Molecular Biology, Vol.35:PeptideSynthesis Protocols” (M.W.Pennington 和 B.M.Dunn 主编)，第 7 章 pp91_171 中。
[0101]或者，可以使用本领域公知的技术将编码本发明的肽、多肽或蛋白质的多核苷酸引入到能够在适合的表达系统中表达的表达载体中，然后分离或纯化表达的目标肽、多肽或蛋白质。在本领域中可获得多种细菌、酵母、植物、哺乳动物和昆虫表达系统，并且可以使用这些表达系统中的任一种。任选地，可以将编码本发明的肽、多肽或蛋白质的多核苷酸在无细胞翻译系统中翻译。
[0102]对应于艰难梭菌芽孢抗原的核酸序列也可用于设计寡核苷酸探针和用于筛选基因组或cDNA文库中来自于其他艰难梭菌变体或甚至其他细菌物种的基因。用于制备寡核苷酸探针和DNA文库以及通过核酸杂交对它们进行筛选的基本策略对于本领域的普通技术人员来说是公知的。参见例如DNA Cloning:Vol.1,同上；Nucleic Acid Hybridization,同上；01igonucleotide Synthesis,同上；Sambrook等，同上。一旦通过阳性杂交鉴定来自被筛选文库的克隆，其可以通过限制性酶分析和DNA测序来证实特定文库插入片段含有艰难梭菌基因或其同源序列。然后可以使用标准技术进一步分离该基因，并且如果需要，使用PCR方法或限制性酶来删除全长序列的部分。
[0103]或者，可以通过合成而不是克隆来制备编码目标蛋白质的DNA序列。DNA序列可以被设计成具有适用于特定氨基酸序列的密码子。一般来说，如果序列被用于表达，人们应该选择对于目标宿主来说优选的密码子。通过标准方法从制备的重叠寡核苷酸组装完整序列，并将其组装成完整的编码序列。参见例如Edge (1981) Nature292:756 ；Nambair等，(1984)Science223:1299 ；Jay 等，(1984) J.Biol.Chem.259:6311。 [0104]一旦所需蛋白质的编码序列已被制备或分离，可以将它们克隆到任何适合的载体或复制子中。大量克隆载体对于本领域技术人员来说是已知的，适合的克隆载体的选择是选择的问题。用于克隆的重组DNA载体和它们可以转化的宿主细胞的实例包括噬菌体λ (大肠杆菌)、pBR322(大肠杆菌)、pACYC177(大肠杆菌)、ρΚΤ230(革兰氏阴性细菌)、PGV1106 (革兰氏阴性细菌)、pLAFRl (革兰氏阴性细菌)、pME290 (非大肠杆菌的革兰氏阴性细菌)、pHV14(大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、pBD9 (芽孢杆菌)、PIJ61 (链霉菌)、pUC6 (链霉菌)、YIp5 (酵母菌)、YCpl9 (酵母菌)和牛乳头瘤病毒(哺乳动物细胞)。参见Sambrook等，同上；DNA Cloning，同上；B.Perbal，同上。可以将基因置于启动子、核糖体结合位点(用于细菌表达)和任选的操纵子(在本文中合称“控制”元件)的控制之下，以便在用含有该表达构建物的载体转化的宿主细胞中将编码所需蛋白质的DNA序列转录成RNA。编码序列可以含有或可以不含信号肽或前导序列。前导序列可以在翻译后加工中被宿主移除。参见例如美国专利号4，431，739,4, 425，437,4, 338，397。载体的实例包括 pET32a(+)和 pcDNA3002Neo。
[0105]允许相对于宿主细胞的生长调控蛋白质序列的表达的其他调控序列也可能是需要的。调控序列对于本领域技术人员来说是已知的，且其实例包括对化学或物理刺激(包括调控化合物的存在)做出响应以引起基因表达的启动或关闭的调控序列。载体中也可以存在其他类型的调控元件，例如增强子序列。
[0106]在插入到载体例如上述克隆载体中之前，可以将控制序列和其他调控序列与编码序列连接。或者，可以将编码序列直接克隆到已经含有控制序列和适合的限制性位点的表达载体中。
[0107]在某些情况下，可能必需修饰编码序列以便可以将其以适合的定向连接于控制序列，即维持正确的阅读框。也可能希望产生蛋白质的突变体或类似物。突变体或类似物可以通过删除一部分编码蛋白质的序列、通过序列的插入和/或通过置换序列内的一个或多个核苷酸来制备。用于修饰核苷酸序列的技术例如定点诱变描述在例如Sambrook等，同上；DNA Cloning,同上；Nucleic Acid Hybridization,同上中。
[0108]然后使用表达载体来转化适宜的宿主细胞。多种哺乳动物细胞系在本领域中是已知的，并包括可以从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)获得的永生化细胞系，例如但不限于中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如H印G2)、Madin-Darby牛肾(“MDBK”)细胞、HEK293F细胞、NS0-1细胞以及其它细胞。同样地，细菌宿主例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和链球菌(Streptococcus spp.)可以与本发明的表达构建体一起使用。可用于本发明中的酵母宿主包括但不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色假丝酵母(Candida albicans)、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、吉利蒙德毕赤酵母(Pichia guillerimondii)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia Iipolytica)。用于杆状病毒表达载体的昆虫细胞包括但不限于埃及伊蚊(Aedes aegypti)、苜猜银纹夜蛾(Autographa caiifornica)、家香(Bombyx mori)、黑腹果妮(Drosophila melanogaster)、菲律宾实妮(Spodoptera frifiperda)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)。
[0109]具有目标多核苷酸例如艰难梭菌芽孢抗原的表达载体也可以是本领域技术人员通常用于需要的宿主的DNA疫苗接种的载体。DNA疫苗接种可以以任何方式使用，例如用于首次宿主抗原性激发和/或用于目标抗原的加强激发。DNA疫苗接种和相关技术的一般特征在本领域中是公知的。也可以使用用于测量针对目标抗原的免疫应答是否已经产生和/或在宿主中是否已经建立针对细菌激发的保护的公知技术容易地确定DNA载体的适合剂量。
[0110]取决于所选的表达系统和宿主，可以通过将用上述表达载体转化的宿主细胞在使得目标蛋白得以表达的条件下进行培养来产生本发明的蛋白质。然后从宿主细胞分离该蛋白质并对其进行纯化。适合的生长条件和回收方法的选择在本领域的技术范围之内。
[0111]艰难梭菌芽孢抗原蛋白质序列也可以使用已知氨基酸序列或源自于目标基因的DNA序列的氨基酸序列，通过化学合成例如固相肽合成来产生。这样的方法对于本领域技术人员来说是已知的。对于固相肽合成技术参见例如J.M.Stewari^PJ.D.Young, Solid PhasePeptide Synthesis,第二版,Pierce Chemical C0., Rockford, IL (1984)以及 G.Barany 和R.B.Merrifield,The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,E.Gross和 J.Meienhofer主编，Vol.2, Academic Press, New York, (1980), pp.3-254 ;对于经典的溶液合成，参见M.Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin (1984)以及 E.Gross 和 J.Meienhofer 主编，The Peptides:Analysis, Synthesis, Biology,同上，Vol.1。如果所研究的抗原的小片段能够在目标受试者中引起免疫应答，则肽的化学合成可能是优选的。
[0112]本发明的多肽还可以包括作为存在多基因、可选转录事件、可选RNA剪接事件和可选翻译和翻译后事件的结果而产生的多肽。多肽可以表达在引起与肽在原始细胞中表达时存在的基本上相冋的翻译后修饰的系统例如培养细胞中，或者表达在引起当在原始细胞中表达时存在的翻译后修 饰(例如糖基化或切割)中发生改变或省略的系统中。[0113]本发明的肽、多肽、蛋白质或抗原可以作为融合蛋白来产生，所述融合蛋白含有不是本文公开的艰难梭菌芽孢抗原序列的一部分的其他不同氨基酸序列，例如氨基酸连接物或信号序列或免疫原性载体，以及可用于蛋白质纯化的配体例如谷胱甘肽-S-转移酶、组氨酸标签和葡萄球菌蛋白A。融合蛋白中可以存在一种以上本发明的多肽。异源多肽可以融合到例如本发明的肽、多肽或蛋白质的N-末端或C-末端。本发明的肽、多肽、蛋白质或抗原也可以作为包含同源氨基酸序列的融合蛋白来产生。可用于本发明的实施中的融合蛋白的实例包括但不限于本文描述的艰难梭菌芽孢抗原与艰难梭菌毒素A或B的部分，例如Tcd A的N-末端催化结构域、Tcd B的N-末端催化结构域或TcdB的C-末端片段4的融合体。也可以将艰难梭菌芽孢抗原或其片段彼此融合以形成适合用于本发明中的融合蛋白。
[0114]梭菌芽孢蛋白
[0115]在本发明的实施中可以使用多种艰难梭菌芽孢蛋白质中的任一种。这样的芽孢蛋白质可以通过搜索已知的艰难梭菌序列，包括最近已被测序的多种菌株的完整基因组序列来鉴定。可用于本发明的实施的芽孢蛋白质的进一步的实例也描述在文献中。参见例如Henriques 和 Moran, Annual Rev.Microbiol.,61:555-88 (2007)。艰难梭菌芽抱蛋白质的代表性实例包括下面所描述的那些。
[0116]BclA蛋白(包括BclAl、BclA2和BclA3)是胶原蛋白样蛋白质，其参与艰难梭菌芽孢的外孢壁的形成。外孢壁包围芽孢外被并造成芽孢抗性。诸如表面暴露的外孢壁蛋白的革巴标是用于治疗的良好的潜在革巴标。例如，BclA蛋白在炭痕芽抱杆菌(Bacillusanthracis)中具有直系同源物，并且已显示用BclA进行的免疫通过抑制萌发在动物中显示出针对炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)芽孢定植的保护作用。可以在本发明的实施中使用的艰难梭菌BclA序列的代表性实例包括但不限于具有下列NCBI登记号的蛋白质:FN545816(对于 BclAU A2 和 A3 分别为 402547-404145,3689444-3691084 和3807430-3809466 区)。
[0117]艰难梭菌中的Alr (丙氨酸消旋酶)蛋白是一种外孢壁酶，其参与将萌发与营养限制培养基中存在的芽孢数量相 关联的群体感应类型的机制。在芽孢杆菌物种中也存在直系同源蛋白质，其中所述蛋白已被显示存在于芽孢形成的晚期，并且对于抑制过早萌发从而提高细菌的存活率来说是必需的。可以在本发明的实施中使用的艰难梭菌Alr序列的代表性实例包括但不限于NCBI登记号为FN545816 (3936313-3937470区)的蛋白质。
[0118]SlpA蛋白编码S-层，其是芽孢上的主要表面抗原。已显示，SlpA蛋白在患者中诱导强的血清 IgG 应答(参见 Kelleher D.等，J.Med.Micr0.，55:69-83 (2006))。所述蛋白被分成N-末端(LMW)部分和C-末端(HMW)部分。SlpA HMW蛋白高度保守，并因此作为靶是有吸引力的。
[0119]SlpA旁系同源物蛋白是艰难梭菌菌株630中与高丽SlpA亚基的氨基酸序列近缘的一大类开放阅读框(旁系同源物)。该氨基酸序列与枯草芽孢杆菌的两种细胞壁结合蛋白N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶(CWLB/LytC)及其增强子(CWBA/LytB)45%同源的(包括保守置换)。序列同源性具有功能相关性，因为艰难梭菌高MWSLP亚基显示出酰胺酶活性。通过与枯草芽孢杆菌的相似性，已表明同源性结构域介导对细胞壁的锚定，并因此鉴定了一类细胞壁组分。与此相一致的是，许多slpA旁系同源物编码典型的信号序列，表明它们是分泌的或膜结合的。在迄今为止鉴定到的29个slpA旁系同源物中，有12个定位在slpA周围的密集排列的簇中，并全都以相同方向转录，表明了协同调控和相关功能的可能性。已显示，在营养生长期间，紧邻slpA的3’的6个slpA样基因(0RF2至7)进行转录。C0G2247是推测的细胞壁结合结构域。可以在本发明的实施中使用的艰难梭菌slpA序列的代表性实例包括但不限于NCBI登记号为FN545816 (3157304-3159175，3162172-3164448区)的蛋白质。下面在实施例3中示出了 COG2247，一种推测的细胞壁结合结构域。
[0120]⑶1021(CotH)蛋白是在艰难梭菌芽孢上发现的一种假设蛋白质，已经针对其产生了抗体。由于这种蛋白质是表面暴露的，使其成为用于治疗的良好靶标。可以在本发明的实施中使用的艰难梭菌CD1021序列的代表性实例包括但不限于NCBI登记号为AM180355 (1191725-1193632 区)的蛋白质。
[0121]IunH编码肌苷水解酶，一种存在于炭疽芽孢杆菌外孢壁中的酶，在艰难梭菌中具有该酶的直系同源物。已提出这种酶在芽孢萌发的启动中发挥作用。可以在本发明的实施中使用的艰难梭菌IunH序列的代表性实例包括但不限于NCBI登记号为FN545816 (1866580-1867548 区)的蛋白质。[0122]Fe-Mn-SOD或超氧化物歧化酶(SOD)是催化超氧化物至氧和过氧化氢的歧化作用的一类酶，因此是细胞中的重要抗氧化防御者。许多细菌含有这种酶的带有铁和锰的形式。可以在本发明的实施中使用的艰难梭菌Fe-Mn-SOD序列的代表性实例包括但不限于NCBI登记号为NC_013316 (1802293-1802997区)的蛋白质。
[0123]fliD基因编码艰难梭菌的鞭毛帽蛋白(FliD)。已显示这种蛋白在体外和体内具有粘附性质，特别是已显示在与粘膜的粘附中有作用。已显示，与患有CDAD的患者组相比，在对照组中针对FliD的抗体水平明显更高，表明这种蛋白质能够诱导可能在宿主防御机制中发挥作用的免疫应答。独立的研究显示，该蛋白质存在于测试的17个临床分离株中的15个中，表明它存在在大多数菌株中。同一项研究还显示，在具有不同临床分离株的17位患者中，15位具有针对FliD的抗体。可以在本发明的实施中使用的艰难梭菌FliD序列的代表性实例包括但不限于具有下列NCBI登记号的蛋白质:Q9AHP4、AF297024、AF297025、AF297026、AF297027 和 AF297028。
[0124]表1提供了可以在本发明的实施中使用的艰难梭菌芽孢抗原蛋白质的示例性氨基酸序列。应该理解，下面提供的示例性序列的变体和片段也被本发明所涵盖。
[0125]
【权利要求】
1.一种组合物，其包含结合艰难梭菌(C.difficile)芽孢多肽或其片段的抗体或其片段，其中所述多肽或其片段选自BclAl、BclA2、BclA3、Air、SlpA旁系同源物、SlpA HMW,CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD 和 FliD0
2.一种组合物，其包含结合艰难梭菌芽孢多肽或其片段的抗体或其片段，其中所述多肽或其片段包含与 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 或 SEQ ID NO:10 中所示的氨基酸序列至少80-95%同一的氨基酸序列。
3.一种分离的抗体或其片段，其结合艰难梭菌芽孢多肽或其片段，其中所述多肽或其片段选自 BclAl、BclA2、BclA3、Air、SlpA 旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH, Fe-Mn-SOD和 FliD0
4.一种抗体或其片段，其结合艰难梭菌芽孢多肽或其片段，其中所述多肽或其片段包含与 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 或 SEQ ID NO:10 中所示的氨基酸序列至少80-95%同一的氨基酸序列。
5.权利要求1-4任一项的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段是多克隆抗体。
6.权利要求1-4任一项的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段是单克隆抗体。
7.权利要求1-4任一项的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段是人抗体。
8.权利要求1-4任一项的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段选自:(a)完整免疫球蛋白分子;(b) scFv ； (c)嵌`合抗体；(d)Fab片段；(e)F(ab’ )2 ;和(f) 二硫键连接的Fv。
9.权利要求1-4任一项的抗体或其片段，其包含选自下列的重链免疫球蛋白恒定结构域:(a)人IgM恒定结构域；(b)人IgGl恒定结构域；(c)人IgG2恒定结构域；(d)人IgG3恒定结构域；(e)人IgG4恒定结构域；和(f)人IgAl/2恒定结构域。
10.权利要求1-4任一项的抗体或其片段，其包含选自下列的轻链免疫球蛋白恒定结构域:(a)人IgK恒定结构域；和(b)人Ig λ恒定结构域。
11.权利要求1-4任一项的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段以至少IX IO9M的亲和常数(Kaff)与抗原结合。
12.权利要求1-4任一项的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段以至少IX IOkiM的亲和常数(Kaff)与抗原结合。
13.权利要求1-2任一项的组合物，其还包含选自结合艰难梭菌毒素Α、毒素B的抗体及结合毒素A和毒素B的抗体组合的成员。
14.权利要求1-2任一项的组合物，其还包含抗生素。
15.权利要求14的组合物，其中所述抗生素是甲硝哒唑或万古霉素。
16.一种治疗艰难梭菌相关疾病的方法，所述方法包括向需要的受试者施用有效减轻或预防所述疾病的量的权利要求1-2任一项的组合物。
17.一种治疗艰难梭菌相关疾病的方法，所述方法包括向需要的受试者施用有效减轻或预防所述疾病的量的权利要求3-4任一项的组合物。
18.一种治疗艰难梭菌相关疾病的方法，所述方法包括向需要的受试者施用有效减轻或预防所述疾病的量的权利要求13的组合物。
19.权利要求16的方法，其中所述组合物静脉内(IV)、皮下(SC)、肌肉内(IM)或口服施用。
20.权利要求17的方法，其中所述组合物静脉内(IV)、皮下(SC)、肌肉内(IM)或口服施用。
21.权利要求18的方法，其中所述组合物静脉内(IV)、皮下(SC)、肌肉内(IM)或口服施用。
22.权利要求16的方法，其中所述组合物以I至100毫克每千克受试者体重的范围的量施用。
23.权利要求17的方法，其中所述组合物以I至100毫克每千克受试者体重的范围的量施用。
24.权利要求18的方法，其中所述组合物以I至100毫克每千克受试者体重的范围的量施用。
25.一种被动免疫方法，所述方法包括向动物施用有效量的权利要求1-2任一项的组合物。
26.一种被动免疫方法，所述方法包括向动物施用有效量的权利要求3-4任一项的抗体或其片段。
27.一种在受试者 中诱导免疫应答的方法，所述方法包括以在所述受试者中有效诱导免疫应答的量向所述受试者给药艰难梭菌芽孢多肽或其片段或变体和药学上可接受的佐剂，所述多肽或片段或变体选自BclAl、BclA2、BclA3、Air、SlpA旁系同源物、SlpA HMW,CD1021、IunH, Fe-Mn-SOD 和 FliD0
28.一种在受试者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括以在所述受试者中有效诱导免疫应答的量向所述受试者施用艰难梭菌芽孢多肽或其片段或变体和药学上可接受的佐剂，所述多肽或片段或变体包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 或 SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列至少80-95%同一的氨基酸序列。
29.一种在需要的受试者中减少或预防艰难梭菌感染的方法，所述方法包括以在所述受试者中有效减少或预防感染的量向所述受试者施用艰难梭菌芽孢多肽或其片段或变体和药学上可接受的佐剂，所述多肽或片段或变体选自BclAl、BclA2、BclA3、Alr、SlpA旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD 和 FliD。
30.一种在需要的受试者中减少或预防艰难梭菌感染的方法，所述方法包括以在所述受试者中有效减少或预防感染的量向所述受试者施用艰难梭菌芽孢多肽或其片段或变体和药学上可接受的佐剂，所述多肽或片段或变体包含与SEQ ID NO=USEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3, SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列至少80-95%同一的氨基酸序列。
31.权利要求27-30任一项的方法，其中所述药学上可接受的佐剂是白介素12或热休克蛋白。
32.权利要求27-30任一项的方法，其中所述施用是口服、鼻内、静脉内或肌肉内施用。
33.权利要求27-30任一项的方法，其中所述变体是突变体。
34.权利要求27-30任一项的方法，其中所述变体是融合蛋白。
35.权利要求34的方法，其中所述融合蛋白包含艰难梭菌毒素A或B的序列。
36.权利要求35的方法，其中所述艰难梭菌毒素A或B的序列选自TcdB的N-末端催化结构域、TcdB的C-末端片段4和TcdA的C-末端受体结合片段。
37.权利要求34的方法，其中所述融合蛋白是BClAl、BclA2、BclA3、Alr、SlpA旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD和FliD及其片段组成的组中的成员，或SEQ IDNO: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10及其片段组成的组中的成员，与该组的另一个成员的融合体。
38.一种组合物，其包含有效免疫量的分离的多肽或其片段或变体和药学上可接受的载体，其中所述组合物在受试者中有效地诱导针对艰难梭菌感染的免疫应答，并且其中所述分离的多肽或其片段或变体包含选自BclAl、BclA2、BclA3、Air、SlpA旁系同源物、SlpAHMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD和FliD的艰难梭菌芽孢多肽或其片段。
39.一种组合物，其包含有效免疫量的分离的多肽或其片段或变体和药学上可接受的载体，其中所述组合物在受试者中有效地诱导针对艰难梭菌感染的免疫应答，并且其中所述分离的多肽或其片段或变体包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 或 SEQ IDNO:10中所示的氨基酸序列至少80-95%同一的氨基酸序列。
40.权利要求38或39的组合物，其中所述组合物还包含药学上可接受的佐剂。
41.权利要求40的组合物，其中所述药学上可接受的佐剂包括水包油乳液。
42.权利要求40的组合物，其中所述药学上可接受的佐剂是ISA-206和QuilA。
43.权利要求40的组合物，其中所述药学上可接受的佐剂是白介素12或热休克蛋白。
44.权利要求38或39的方`法，其中所述变体是突变体。
45.权利要求38或39的方法，其中所述变体是融合蛋白。
46.权利要求45的方法，其中所述融合蛋白包含艰难梭菌毒素A或B的序列。
47.权利要求46的方法，其中所述艰难梭菌毒素A或B的序列选自TcdA的N-末端催化结构域、TcdB的N-末端催化结构域、TcdB的C-末端片段4和TcdA的C-末端受体结合片段。
48.权利要求45的方法，其中所述融合蛋白是BClAl、BclA2、BclA3、Alr、SlpA旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD和FliD及其片段组成的组中的成员，或SEQ IDNO: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10及其片段组成的组中的成员，与该组的另一个成员的融合体。
49.一种在需要的受试者中减少或预防艰难梭菌感染的方法，所述方法包括以在所述受试者中有效减少或预防感染的量向所述受试者施用一定量的编码艰难梭菌芽孢多肽或其片段或变体的核酸和药学上可接受的佐剂，所述多肽或片段或变体选自BclAl、BclA2、BclA3、Air、SlpA 旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD 和 FliD。
50.一种在需要的受试者中减少或预防艰难梭菌感染的方法，所述方法包括以在所述受试者中有效减少或预防感染的量向所述受试者施用一定量的编码艰难梭菌芽孢多肽或其片段或变体的核酸和药学上可接受的佐剂，所述核酸编码与SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQID NO:9或SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列至少80-95%同一的氨基酸序列。
51.权利要求49或50的方法，其中所述变体是突变体。
52.权利要求49或50的方法，其中所述变体是融合蛋白。
53.权利要求52的方法，其中所述融合蛋白包含艰难梭菌毒素A或B的序列。
54.权利要求53的方法，其中所述艰难梭菌毒素A或B的序列选自TcdA的N-末端催化结构域、TcdB的N-末端催化结构域、TcdB的C-末端片段4和TcdA的C-末端受体结合片段。
55.权利要求52的方法，其中所述融合蛋白是BClAl、BclA2、BclA3、Alr、SlpA旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-S0D 和 FliD 组成的组中的成员，或 SEQ ID NO =USEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO: 10组成的组中的成员，与该组的另一个成员的融合体。
56.一种分离的核酸，其编码选自BclAl、BclA2、BclA3、Air、SlpA旁系同源物、SlpAHMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD和FliD的艰难梭菌芽孢多肽或其片段或变体。
57.一种分离的核酸，其编码艰难梭菌芽孢多肽或其片段或变体，其中所述核酸编码与SEQ ID NO:USEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 或 SEQ ID NO:10 中所示的氨基酸序列至少 80-95%同一的氨基酸序列。
58.权利要求56或 57的核酸，其中所述变体是突变体。
59.权利要求56或57的核酸，其中所述变体是融合蛋白。
60.权利要求59的核酸，其中所述融合蛋白包含艰难梭菌毒素A或B的序列。
61.权利要求60的核酸，其中所述艰难梭菌毒素A或B的序列选自TcdA的N-末端催化结构域、TcdB的N-末端催化结构域、TcdB的C-末端片段4和TcdA的C-末端受体结合片段。
62.权利要求59的核酸，其中所述融合蛋白是BClAl、BclA2、BclA3、Alr、SlpA旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD和FliD及其片段组成的组中的成员，或SEQ IDNO: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10及其片段组成的组中的成员，与该组的另一个成员的融合体。
63.—种表达载体,其包含权利要求56或57的核酸。
64.权利要求63的表达载体，其中所述表达载体是哺乳动物表达载体。
65.权利要求64的表达载体，其中所述哺乳动物表达载体包含CMV启动子。
66.权利要求63的表达载体，其中所述表达载体是pcDNA3002Neo或pET32a。
67.—种宿主细胞，其包含权利要求63的表达载体。
68.权利要求67的宿主细胞，其中所述宿主细胞是HEK293F、NS0-1、CH0-K1、CH0-S或PER.C6。
69.权利要求63的表达载体，其中所述表达载体是细菌表达载体。
70.权利要求69的表达载体，其中所述表达载体是pET32a。
71.权利要求67的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。
72.权利要求1-4任一项的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段抑制或延迟芽孢萌发。
【文档编号】C12P21/08GK103608464SQ201180068078
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2011年12月29日 优先权日:2010年12月29日
【发明者】J·贝里, D·约翰斯通, B·泰伊, M·洛佩斯, J·乔治, 韩笑冰 申请人:卡恩基因公司