专利名称：一种c8:0/c10:0/c12:0/c14:0中链脂肪酸及其乙酯的生产方法
技术领域：
本发明属于生物化工领域，特别涉及一种C8:0/C10:0/C12:0/C14:0中链脂肪酸
及其乙酯的生产方法。
背景技术：
生物柴油作为化石能源的可替代品，具有安全、可生物降解、燃烧完全等优点，已受到许多国家的高度关注与重视。2010年，全球生物柴油产量约为1700万吨，并呈现持续增长的趋势。目前，生物柴油主要利用动、植物油脂、油脂精练后的下脚料、油泥以及城市潲水油、油炸食品后的废油等，经改性处理，在催化剂催化下与短链醇如甲醇或乙醇等复合而成。生物柴油的主要成分是脂肪酸短链酯，如脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯等。原料成本和生产工艺是制约生物柴油生产的两大因素。生物柴油的生产原料目前大多是采用植物油脂和少量动物油脂，如豆油(主要是美国采用)、菜籽油(欧洲采用)、棕榈油(印度尼西亚)和废油(日本)等。我国主要使用地沟油和酸化油作为原料生产生物柴油(谭天伟等，2002)。原料不足是制约生物柴油规模化生产的关键因素，原料成本已占生物柴油生产成本的75%以上，而且，大量种植含油植物存在与农业争地、破坏生物多样性等问题。自20世纪90年代以来，利用微生物或藻类发酵生产油脂成为燃料油脂研究的重要方向和热点领域。清华大学吴庆余等利用氮限制培养异养微藻脂，油脂含量达到50%以上，但微藻培养存在生物量小(10-20g/L)、培养周期长等不足，而微生物具有代谢旺盛、培养周期短、易于实现大规模生产等优点。通过优化发酵工艺，微生物的油脂产量可达菌体干重的50-70% (施安辉等，2003 ;Papanikolaou S et al.，2004)。微生物油脂在脂肪酸组成上同植物油相似，是生产生物柴油的潜在原料。利用微生物培养生产油脂，是可持续发展的必然，也必将成为生物柴油合成的新方向(赵宗保，2005 ;黄英明等，2006 ；Eric J. Steen et al. , 2010)。目前国内生物柴油主要原料来自地沟油，主要组分是长链脂肪酸(C16:0-C18:0)， 低温性能较差，不适合我国北方地区的冬季使用。添加部分中链脂肪酸乙酯可以有效改善生物柴油的低温性能，扩大其使用范围。另外，中链脂肪酸(C8:0-C14:0)亦用于化妆品、润滑油基础油等，应用范围广，市场前景大。但目前中链脂肪酸多为从植物种子提取，来源有限，而且价格较高。微生物油脂多为胞内产物，必须从组织、细胞中分离后，才能用于油脂原料及生物柴油生产，而且长链脂肪酸居多，这一过程关系油脂成分及生物柴油的质量与成本。随着现代分子生物学尤其合成生物学的发展，通过基因工程的手段，调控脂肪酸合成的相关酶的表达，增加特异性链长脂肪酸的产量，进而合成脂肪酸乙酯，是微生物合成特定油脂及生物柴油的前沿技术。该方法既可以解决生物柴油的原料问题，又可以解决生产工艺步骤多、酶易失活等问题。与其它菌株相比，大肠杆菌具有遗传背景清楚、易于改造、生长速度快、适合高密度发酵等优点，是微生物法合成化学品和燃料的理想菌株。利用大肠杆菌生产高附加值脂肪酸和生物柴油是不争地、不靠天、可持续生产的新途径。与公知技术相比，本发明具有以下优点(I)微生物油脂及生物柴油发酵生产周期短，不受场地、季节等因素的影响，不占用耕地资源，容易实现工业化生产。(2)脂肪酸及脂肪酸乙酯以游离方式分泌到细胞外，便于分离。(3)发酵液得到了高浓度的中链游离脂肪酸，克服了生物柴油生产中原料油脂的高成本、胞内油脂不易分离的问题。(4)直接发酵得到高浓度的脂肪酸乙酯，克服了生物柴油生产工艺复杂、成本高的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用重组大肠杆菌(Escherichia coli)直接合成脂肪酸及其乙酯的可再生能源工艺路线，使微生物可以作为细胞工厂直接发酵生产脂肪酸及其乙酯。本发明首次采用三种植物萼距花属植物(Cuphea hookeriana) /月桂树 (Umbellularia californica)/ 香樟(Cinnamomum camphora)中具有不同特异性FAT (fatty acyl-acyl carrier protein thioesterase)家族中的硫酯酶基因 chFatB/ucFatB/ccFatB 来构建工程菌，即将基因chFatB/ucFatB/ccFatB克隆至表达载体pETDuet_l中，得到重组质粒pETDuet-chFatB/pETDuet-ucFatB/pETDuet-ccFatB。将重组质粒分别转入大肠杆菌 BL21 (DE3)中，IPTG诱导重组质粒表达，表达的硫酯酶特异性水解特定链长的脂酰ACP，即可分别制得C8:0-C10:0/C12:0/C14:0中链脂肪酸，其中pETDuet-chFatB重组大肠杆菌所产C8:0和ClO: O脂肪酸所占比例为5. 42 %与12. 6 % ；PETDuet-ucFatB重组大肠杆菌所产 C12:0脂肪酸所占比例为34. 52% ；PETDuet-ccFatB重组大肠杆菌所产C14:0脂肪酸所占比例为32. 21%。再异源表达来自不动杆菌ADPl (Acinetobacter baylyi)中的高度非特异性高度非特异性的双功能蜡酯合成酶(WS)/酰基辅酶A 二酰甘油酰基转移酶，通过外源性流加乙醇的方式，催化脂肪酸代谢产物脂酰辅酶A与乙醇反应生成脂肪酸乙酯，即完成脂肪酸乙酯的生产新途径。具体为将不动杆菌中酰基转移酶基因atfA分别克隆至表达载体 pETDuet-chFatB/pETDuet-ucFatB/pETDuet-ccFatB 中得到重组质粒 pETDuet-chFatB-atfA/pETDuet-ucFatB-atfA/pETDuet-ccFatB-atfA。将重组质粒分别转入大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导重组质粒表达，表达的硫酯酶特异性水解特定链长的脂酰ACP，分别得到C8:0-C10:0/C12:0/C14:0中链脂肪酸；这些中链脂肪酸会在胞内形成脂酰-CoA，共同表达的酰基转移酶利用外源性流加的乙醇(1% -5% )与中链脂酰-CoA发生酰基转移反应合成脂肪酸乙醇酯，得到利用重组大肠杆菌直接合成CS: 0-C10:0/C12:0/ C14:0中链脂肪酸乙醇酯的可再生资源工艺路线。本发明中硫酯酶特征在于通过特异性催化C8:0/C10:0/C12:0/C14:0脂酰ACP水
解来提高大肠杆菌体内脂肪酸的含量；高度非特异性酰基转移酶的特性在于可催化脂酰 CoA与任意结构的醇类(包括乙醇)发生酰基转移反应生成脂肪酸乙醇酯。本发明首次克隆并表达来自萼距花属植物/月桂树/香樟中的特异性硫酯酶基因生产中链脂肪酸及其乙酯，可以有效改善生物柴油的低温性能，且发酵原料易得，可再生； 产物可直接分泌至胞外，产物提取工艺简单，大大降低成本，简化了生产工艺。
图I :DNA琼脂糖凝胶电泳。左侧纯化后的萼距花属植物中硫酯酶基因PCR产物， 1248bp。右侧为DNA大小标准品。图2 :构建的重组载体pETDuet-chFatB的图谱，chFatB基因克隆于pETDuet-Ι载体，基因两端带有NdeI和EcoRV位点。图3 =DNA琼脂糖凝胶电泳。右侧纯化后的月桂树中硫酯酶基因PCR产物，1149bp。 左侧为DNA大小标准品。图4 :构建的重组载体pETDuet-ucFatB的图谱，UcFatB基因克隆于pETDuet-Ι载体，基因两端带有NdeI和EcoRV位点。图5 =DNA琼脂糖凝胶电泳。右侧纯化后的香樟中硫酯酶基因PCR产物，1149bp。 左侧为DNA大小标准品。图6 :构建的重组载体pETDuet-ccFatB的图谱，ccFatB基因克隆于pETDuet-Ι载体，基因两端带有NdeI和EcoRV位点。图7 =DNA琼脂糖凝胶电泳。左侧纯化后的不动杆菌中酰基转移酶基因PCR产物， 1377bp。右侧为DNA大小标准品。图8 :构建的重组载体pETDuet-chFatB-atfA的图谱，atfA基因克隆于 pETDuet-chFatB载体，基因两端带有NcoI和EcoRI位点。图9 :构建的重组载体pETDuet-ucFatB-atfA的图谱，atfA基因克隆于 pETDuet-ucFatB载体，基因两端带有NcoI和EcoRI位点。图10 :构建的重组载体pETDuet-ccFatB-atfA的图谱，atfA基因克隆于 pETDuet-ccFatB载体，基因两端带有NcoI和EcoRI位点。图11、图12、图13 :分别表示含有重组质粒pETDuet-chFatB-atfA、 pETDuet-ucFatB-atfA、pETDuet-ccFatB-atfA三株工程大肠杆菌经诱导后，其培养液中脂肪酸乙酯的生产情况；C8:0表不Octanoic acid, ethyl ester ;C10:0表不Decanoic acid, ethyl ester ；C12:0 表不 Dodecanoic acid, ethylester ；C14:0 表不 Tetradecanoic acid, ethylester ;C16:0 表不 Hexadecanoic acid, ethylester ;C18:1 表不 Oleic acid, ethylester ;C18:0 表不 Octadecanoic acid, ethyl ester。
具体实施例方式本发明提供的一种利用重组大肠杆菌直接合成脂肪酸乙酯的可再生能源工艺路线，使脂肪酸得到有效利用。本发明通过以下技术方案解决这一技术问题先针对来自萼距花属植物中的硫酯酶基因(ChFatB)/月桂树中的硫酯酶基因(UcFatB)/香樟中的硫酯酶基因(ccFatB)进行密码子优化,然后利用全基因合成方法分别合成chFatB/ucFatB/ccFatB 基因，并以不动杆菌基因组DNA为模板，分别设计相应的引物并添加特殊的酶切位点，PCR 扩增后琼脂糖凝胶回收获得目的基因DNA片段，酶切后连接至双启动子pET载体上，转化到大肠杆菌中，筛选获得阳性重组质粒，质粒经纯化、电泳检测、测序鉴定目的基因。重组质粒在大肠杆菌中诱导表达与外源性流加乙醇后，继续培养，在重组大肠杆菌体内和发酵液中均可获得中链脂肪酸乙酯。本发明提供的方法，大肠杆菌中表达特异性调控中链脂肪酸合成及酰基转移反应的关键酶基因，可高密度发酵且生长速度快，为高品质的中链脂肪酸乙酯合成开辟途径。实验步骤I)采用的菌种不动杆菌ADPl (Acinetobacter baylyi ；ATCC :33305)大肠杆菌BL21 (DE3)2)采用的培养基LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，121°C湿热灭菌20min)， 若配制平板培养基，则需加入I. 5%琼脂粉；选择性LB培养基50ml的LB培养基中加入 50 μ L左右O. I %的氨苄青霉素溶液；脑心浸液培养基(心提取物5. Og/L,脑提取物12. 5g/L，示胨10. Og/L,葡萄糖
2.0g/L,NaCl 5. 0g/L,Na2HP04 2. 5g/L，pH7. 4，115°C湿热灭菌 20min)，若配制平板培养基， 则需加入I. 5%琼脂粉。3)实验方法分别以全基因合成技术所合成的一个来自萼距花属植物(Cuphea hookeriana)/ 月桂树(Umbellularia californica)/ 香樟(Cinnamomum camphora)中的硫酯酶基因 DNA [acyl-acyl carrier protein (ACP) thioesterase]和利用博迈德试剂盒法所提取的不动杆菌ADP I (Acinetobacter baylyi)基因组DNA为模板，PCR扩增获得带有特殊酶切位点的硫酯酶基因和高度非特异性的双功能蜡酯合成酶(WS) /酰基辅酶A 二酰甘油酰基转移酶(wax ester synthase/acy I-CoA: diacy I glycerol acy I transferase)基因。用胶回收试剂盒回收目的片段，用相应的限制性内切酶分别酶切硫酯酶基因 chFatB/ucFatB/ccFatB片段和双启动子的原核表达载体pETDuet-Ι，并于16°C过夜连接， 即为构建好的原核表达载体pETDuet-chFatB/pETDuet-ucFatB/pETDuet-ccFatB ;将构建好的重组质粒利用化学转化方法(即42°C热击法)转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，即可获得产硫酯酶的工程大肠杆菌。将工程大肠杆菌按I %的接种量接种到50mL LB液体培养基中，37°C快速振荡培养，在培养液中加入诱导剂后继续在37°C快速振荡培养 3-5h，诱导表达目的蛋白；提取发酵液中脂肪酸，测定C8:0/C10:0/C12:0/C14:0特异性脂肪酸所占比例，即为制备好的中链脂肪酸。再利用相应的限制性内切酶分别酶切酰基转移酶基因atfA片段和双启动子的原核表达载体 pETDuet-chFatB/pETDuet-ucFatB/pETDuet-ccFatB,并于 16°C过夜连接，即为构建好的原核表达载体pETDuet-chFatB/pETDuet-ucFatB/pETDuet-ccFatB ；将构建好的重组质粒利用化学转化方法(即42°C热击法)转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中， 即可获得产硫酯酶与酰基转移酶的工程大肠杆菌。将工程大肠杆菌按I %的接种量接种到 50mL LB液体培养基中，37°C快速振荡培养，在培养液中加入诱导剂与外源性流加乙醇后， 继续在37°C快速振荡培养3-5h，诱导表达目的蛋白；提取发酵液中脂肪酸乙酯，测定C8:0/ C10:0/C12:0/C14:0特异性脂肪酸乙酯所占比例，即为制备好的中链脂肪酸乙酯。下面结合实施例对本发明的具体方法做进一步的说明
实施例II脂肪酸调控相关基因-萼距花属植物中硫酯酶的克隆与重组载体的构建I. I萼距花属植物中硫酯酶基因的克隆利用全基因合成的方法合成萼距花属植物(Cuphea hookeriana)中的硫酯酶基因 DNA (acy I-acy I carrier protein (ACP) thioesterase)。萼距花属植物中 chFatB 编码硫酯酶基因，该基因可特异性地将CS: 0-C10:0脂酰ACP水解为脂肪酸，即可在重组大肠杆菌体内获得中链脂肪酸。以上述合成的萼距花属植物中硫酯酶基因DNA为模板，根据GenBank序列设计引物，并添加相应的酶切位点(Nde I和EcoR V)与保护碱基，PCR扩增硫酯酶基因chFatB所用引物如下上游引物5，-GGAATTCCATATGGTTGCTGCGGCTGCCAGC-3’下游引物5’ -CGGGATATCTTAGCTAACGCTGTTACCG-3 ’PCR 反应体系含有 I μ L 基因组 DNA，10 μ L 2 XPfu Master Mix 引物各 O. 5 μ L，加双蒸水补至20 μ L。反应条件为预变性94度3min，94度变性30s，退火55度30s，延伸72 度2min50s，循环30次，72度10min，4度保存。这样就PCR扩增克隆到目的硫酯酶基因chFatB 该基因序列长度为1248bp，PCR扩增结束后对PCR产物进行I %的琼脂糖凝胶电泳，所得到目的DNA条带为1248bp(如图I所示)，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的基因。I. 2 pETDuet-chFatB 重组载体的构建将克隆的chFatB基因与pETDuet-Ι载体(购于Novagen公司)用相同的酶(NdeI 和EcoRV)进行酶切，载体与外源基因片段按摩尔比I : 3-1 10的比例，16°C连接过夜， 对长出的单菌落进行菌落PCR与质粒酶切验证，测序结果正确即获得阳性重组载体。测定其序列如序列I所示，编码如序列2所示的氨基酸序列。所构建的重组载体pETDuet-chFatB的图谱(见图2)。2含有萼距花属植物硫酯酶基因chFatB工程大肠杆菌的构建将构建好的含有硫酯酶基因ChFatB重组载体42 °C热击转化到大肠杆菌 BL21 (DE3)感受态细胞中，经菌落PCR鉴定、酶切鉴定、和测序鉴定筛选获得阳性重组工程菌，即获得了含有底物特异性的硫酯酶基因工程大肠杆菌，_80°C保存该菌株。实施例2I脂肪酸调控相关基因-月桂树中硫酯酶的克隆与重组载体的构建I. I月桂树中硫酯酶基因的克隆利用全基因合成的方法合成月桂树(Umbellularia californica)中的硫酯酶基因 DNA (acy I-acy I carrier protein (ACP) thioesterase)。月桂树中 UcFatB 编码硫酯酶基因，该基因可特异性地将C12:0脂酰ACP水解为脂肪酸，即可在重组大肠杆菌体内获得单一的中链脂肪酸。以上述合成的月桂树中硫酯酶基因DNA为模板，根据GenBank序列设计引物，并添加相应的酶切位点(Nde I和EcoR V)与保护碱基，PCR扩增硫酯酶基因UcFatB所用引物如下
上游引物5’-GGAATTCCATATGGCTACCACCTCTCTGGCCAG-3’下游引物5，-CGGGATATCTTAAACACGCGGTTCCGC-3，PCR 反应体系含有 I μ L 基因组 DNA，10 μ L 2 XPfu Master Mix 引物各 O. 5 μ L，加双蒸水补至20 μ L。反应条件为预变性94度3min，94度变性30s，退火55度30s，延伸72 度2min30s,循环30次,72度IOmin, 4度保存。这样就PCR扩增克隆到目的硫酯酶基因UcFatB 该基因序列长度为1149bp，PCR扩增结束后对PCR产物进行I %的琼脂糖凝胶电泳，所得到目的DNA条带为1149bp (如图3所示)，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的基因。I. 2 pETDuet-ucFatB 重组载体的构建将克隆的UcFatB基因与pETDuet_l载体(购于Novagen公司)用相同的酶(Nde I和EcoR V)进行酶切，载体与外源基因片段按摩尔比I : 3-1 10的比例，16°C连接过夜，对长出的单菌落进行菌落PCR与质粒酶切验证，测序结果正确即获得阳性重组载体。测定其序列如序列3所示，编码如序列4所示的氨基酸序列。所构建的重组载体pETDuet-ucFatB的图谱(见图4)。2含有月桂树中硫酯酶基因UcFatB工程大肠杆菌的构建将构建好的含有硫酯酶基因UcFatB重组载体42 °C热击转化到大肠杆菌 BL21 (DE3)感受态细胞中，经菌落PCR鉴定、酶切鉴定、和测序鉴定筛选获得阳性重组工程菌，即获得了含有底物特异性的硫酯酶基因工程大肠杆菌，_80°C保存该菌株。实施例3I脂肪酸调控相关基因-香樟中硫酯酶的克隆与重组载体的构建I. I香樟中硫酯酶基因的克隆利用全基因合成的方法合成香樟(Cinnamomum camphora)中的硫酯酶基因 DNA (acy I-acy I carrier protein (ACP) thioesterase)。香樟中 ccFatB 编码硫酯酶基因，该基因可特异性地将C14:0脂酰ACP水解为脂肪酸，即可在重组大肠杆菌体内获得中链脂肪酸。以上述合成的香樟中硫酯酶基因DNA为模板，根据GenBank序列设计引物，并添加相应的酶切位点(Nde I和EcoR V)与保护碱基，PCR扩增硫酯酶基因ccFatB所用引物如下上游引物5’ -GGAATTCCATATGGCCACTACCAGCCTGGCCA-3 ’下游引物5’-CGGGATATCTTACACGCTGCTTTCCGCCG-3’PCR 反应体系含有 I μ L 基因组 DNA，10 μ L 2 XPfu Master Mix 引物各 O. 5 μ L，加双蒸水补至20 μ L。反应条件为预变性94度3min，94度变性30s，退火55度30s，延伸72 度2min30s,循环30次,72度IOmin, 4度保存。这样就PCR扩增克隆到目的硫酯酶基因ccFatB 该基因序列长度为1149bp，PCR扩增结束后对PCR产物进行I %的琼脂糖凝胶电泳，所得到目的DNA条带为1149bp (如图5所示)，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的基因。I. 2 pETDuet-ccFatB 重组载体的构建
将克隆的ccFatB基因与pETDuet-Ι载体(购于Novagen公司)用相同的酶(Nde I和EcoR V)进行酶切，载体与外源基因片段按摩尔比I : 3-1 10的比例，16°C连接过夜，对长出的单菌落进行菌落PCR与质粒酶切验证，测序结果正确即获得阳性重组载体。测定其序列如序列5所示，编码如序列6所示的氨基酸序列。所构建的重组载体pETDuet-ccFatB的图谱(见图6)。2含有香樟中硫酯酶基因ccFatB工程大肠杆菌的构建将构建好的含有硫酯酶基因ccFatB重组载体42 °C热击转化到大肠杆菌 BL21 (DE3)感受态细胞中，经菌落PCR鉴定、酶切鉴定、和测序鉴定筛选获得阳性重组工程菌，即获得了含有底物特异性的硫酯酶基因工程大肠杆菌，_80°C保存该菌株。实施例4中链脂肪酸的合成、提取与气相检测I游离中链脂肪酸的合成将工程大肠杆菌pETDuet-chFatB/pETDuet-ucFatB/pETDuet-ccFatB 按 I % 的接种量接种到500mL LB液体培养液中(内含50 μ g .mr1的氨苄青霉素)，37°C，200rpm振荡培养(约3h)，当0D600约为O. 4-0. 6时，在菌液中加入4mM诱导剂IPTG至终浓度Immol Γ1, 继续在30°C条件下振荡培养24h，培养液在SOOOrpm条件下，离心lOmin，取含有游离脂肪酸的上清液保存，为后续检测工作做准备。2游离中链脂肪酸的提取提取20ml发酵液中游离脂肪酸，先加入2mL HCl充分混匀酸化，再加入20ml乙酸乙酯，在振荡仪上振荡15s，充分进行萃取，在提取过程中遵循少量多次的原则，5000r离心 lOmin，分离并收集有机层。再重复添加乙酸乙酯进行二次萃取。利用乙酸乙酯的易挥发性对萃取的脂肪酸进行浓缩。这样即获得一定浓度的游离中链脂肪酸。3游离中链脂肪酸的气相检测对乙酸乙酯所萃取的脂肪酸利用甲酯化试剂(三氟化硼/甲醇VBF3/V甲醇 =12.88)甲酯化之后进行气相色谱分析，气相色谱条件如下=RTX-WAX毛细管色谱柱 (30mX0. 32mmX0. 25 μ m)，载气高纯氦气(99. 999%)，进样器温度220°C，检测器温度 250°C，载气柱头压10psi ;程序升温起始50°C，维持O. 5min ；25°C /min升温至150°C， 保持Imin ;3°C/min升温至220°C，保持lOmin。(结果见图11，12，13)从最终气相图谱中可分析得出pETDuet-chFatB重组大肠杆菌所产特异性C8:0和ClO:O脂肪酸所占比例为5. 42%与12. 6%，其余的脂肪酸C12:0、C14:0、C16:0、C18:0和C18:1所占比例为 18. 77 %、17. 71 %,27. 41%,10. 7%111 % ;pETDuet_ucFatB 重组大肠杆菌所产特异性 C12:0脂肪酸所占比例为34. 52%，其余的脂肪酸C14:0、C16:0、C18:0和C18:1所占比例为24. 07%,27. 21%、10· 8%和 O. 76% ；pETDuet-ccFatB 重组大肠杆菌所产特异性 C14:0 脂肪酸所占比例为32. 21%，其余的脂肪酸C12: O、C16:0、C18:0和C18:l所占比例为 22. 36%,31. 48%、12. 01%和 I. 2% 0实施例5I酰基转移酶基因的克隆与重组载体的构建I. I不动杆菌ADPl中酰基转移酶基因的克隆与序列测定不动杆菌ADPl (Acinetobacter baylyi)购买自美国标准生物品收藏中心(ATCC33305)。利用脑心浸液琼脂培养基活化菌种后，按I %的接种量接种于4ml LB液体试管培养基中，在37摄氏度摇床中培养12小时后，12000rpm离心Imin收集菌体。基因组DNA提取采用北京博迈德科技发展有限公司提供的细菌基因组提取试剂盒(具体方法参见说明书)。以上述所提取的不动杆菌基因组DNA为模板，根据GenBank序列设计引物，并添加相应的酶切位点与保护碱基，PCR扩增酰基转移酶基因所用引物如下上游引物5，-CATGccatggGCCGCCCATTACATCCGATT-3’下游引物5’ -CCGgaattcTTAATTGGCTGTTTTAATATC-3 ’PCR 反应体系含有 I μ L 基因组 DNA，10 μ L 2 XPfu Master Mix 引物各 O. 5 μ L，加双蒸水补至20 μ L。反应条件为预变性94度3min，94度变性30s，退火55度30s，延伸72 度3min,循环30次,72度IOmin, 4度保存。这样就PCR扩增克隆到目的酰基转移酶atfA基因该基因序列长度为1377bp，PCR扩增结束后对PCR产物进行I %的琼脂糖凝胶电泳，所得到目的DNA条带为1377bp (如图7所示)，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的基因。I. 2 pETDuet-chFatB-atfA 重组载体的构建将克隆的atfA基因与测序验证正确的pETDuet-chFatB载体(购于Novagen公司)用相同的酶(Nco I和EcoR I)进行酶切，37°C酶切3小时。载体与外源基因片段按摩尔比I : 3-1 10的比例，利用Fermentas的T4连接酶16°C连接过夜，用该连接产物转化大肠杆菌ToplO感受态细胞，涂布带有氨苄抗性LB琼脂平板，37度过夜培养后，挑取适量单菌落，在LB培养基中过夜培养，用试剂盒提取质粒，测序验证插入片段，并测定其序列如序列7所示，编码如序列8所示的氨基酸序列。测序结果正确即获得阳性重组载体。所构建的重组载体pETDuet-chFatB-atfA原理图谱如图8所示。I. 3 pETDuet-ucFatB-atfA 重组载体的构建将克隆的atfA基因与测序验证正确的pETDuet-ucFatB载体(购于Novagen公司)用相同的酶(Nco I和EcoR I)进行酶切，37°C酶切3小时。载体与外源基因片段按摩尔比I : 3-1 10的比例，利用Fermentas的T4连接酶16°C连接过夜，用该连接产物转化大肠杆菌ToplO感受态细胞，涂布带有氨苄抗性LB琼脂平板，37度过夜培养后，挑取适量单菌落，在LB培养基中过夜培养，用试剂盒提取质粒，测序验证插入片段，并测定其序列如序列7所示，编码如序列8所示的氨基酸序列。测序结果正确即获得阳性重组载体。所构建的重组载体pETDuet-ucFatB-atfA原理图谱如图9所示。1. 4 pETDuet-ccFatB-atfA 重组载体的构建将克隆的atfA基因与测序验证正确的pETDuet-ccFatB载体(购于Novagen公司)用相同的酶(Nco I和EcoR I)进行酶切，37°C酶切3小时。载体与外源基因片段按摩尔比I : 3-1 10的比例，利用Fermentas的T4连接酶16°C连接过夜，用该连接产物转化大肠杆菌ToplO感受态细胞，涂布带有氨苄抗性LB琼脂平板，37度过夜培养后，挑取适量单菌落，在LB培养基中过夜培养，用试剂盒提取质粒，测序验证插入片段，并测定其序列如序列7所示，编码如序列8所示的氨基酸序列。测序结果正确即获得阳性重组载体。所构建的重组载体pETDuet-ccFatB-atfA原理图谱如图10所示。2含有硫酯酶基因UcFatB与酰基转移酶基因atfA工程大肠杆菌的构建将构建好的含有硫酯酶基因UCFatB与酰基转移酶基因atfA重组表达载体42°C热击转化到大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞中，即获得了含有底物特异性硫酯酶基因和催化酰基转移反应的酰基转移酶基因的工程大肠杆菌，_80°C保存该菌株。实施例6I乙酸乙酯的合成、提取与气相质谱检测将工程大肠杆菌pETDuet-chFatB-atfA/pETDuet-ucFatB-atfA/ pETDuet-ccFatB-atfA按I %的接种量接种到500mL LB液体培养液中(内含50 μ g · πιΓ1 的氨苄青霉素)，37°C，200rpm振荡培养(约3h)，当0D600约为O. 4-0. 6时，在菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度Immol · L—1，再外源性流加2% (1% -5% )的乙醇至终浓度为
O.1% -O. 2%，继续在25°C条件下振荡培养24h。在上述发酵液中加入充足的乙酸乙酯，振荡15s，进行充分萃取，50001■离心 lOmin，分离并收集有机层。对乙酸乙酯萃取的脂肪酸乙酯样品进行GC检测，气相色谱条件为RTX-WAX毛细管色谱柱(30mXO. 32mmXO. 25 μ m)，载气高纯氦气(99. 999%),进样器温度220°C,检测器温度250°C，载气柱头压IOpsi ;程序升温起始50°C，维持O. 5min ；25°C /min升温至 150°C，保持lmin;3°C/min升温至220°C，保持lOmin。(结果见图11，12，13)从最终气相图谱中可分析得出pETDuet-chFatB-atfA重组大肠杆菌所产特异性C8:0和ClO:O脂肪酸乙酯所占比例为5. 42%与12. 6%，其余的C12:0、C14:0、C16:0、C18:0和C18:l脂肪酸乙酯所占比例为18. %Λ . 71%,27. 41%,10. 7%I. 11% ；pETDuet-ucFatB-atfA 重组大肠杆菌所产特异性C12:0脂肪酸乙酯所占比例为34. 52%，其余C14:0、C16:0、C18:0和 C18:1 脂肪酸乙酯所占比例为24. 07%,27. 21%,10. 8%和 O. 76% ；pETDuet-ccFatB-atfA 重组大肠杆菌所产特异性C14:0脂肪酸乙酯所占比例为32. 21 %，其余C12:0、C16:0、 C18:0和C18:1脂肪酸乙酯所占比例为22. 36%,31. 48%U2. 01%和I. 2%0
权利要求
1.一种C8:0/C10:0/C12:0/C14:0中链脂肪酸及其乙酯的生产方法，其特征在于，包括步骤I、分别将萼距花属植物/月桂树/香樟中来自脂酰酰基转运蛋白硫酯酶(FAT)家族中具有不同特异性硫酯酶基因chFatB/ucFatB/ccFatB克隆至原核表达载体,得到重组质粒转至BL21 (DE3)中，经IPTG诱导表达生产中链脂肪酸。步骤2、再将不动杆菌中高度非特异性的双功能蜡酯合成酶/酰基辅酶A 二酰甘油酰基转移酶基因atfA分别克隆至已连接硫酯酶基因chFatB/ucFatB/ccFatB的原核表达载体， 得到重组质粒转至BL21 (DE3)中，经外源性流加乙醇与IPTG诱导表达后生产中链脂肪酸乙醇酯。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所表达的来自萼距花属植物/月桂树/ 香樟中FAT家族硫酯酶可特异性水解特定链长的脂酰ACP，分别得到C8:0-C10:0/C12:0/ C14:0中链脂肪酸。
3.根据权利要求I所述方法，其特征在于，所表达的来自不动杆菌中高度非特异性的双功能蜡酯合成酶/酰基辅酶A二酰甘油酰基转移酶可催化外源性流加的乙醇(1% -5% ) 与胞内形成的中链脂酰-Cok发生酰基转移反应合成特定的C8:0-C10:0/C12:0/C14:0中链脂肪酸乙醇酯。
4.根据权利要求I所述方法，其特征在于，所述chFatB/ucFatB/ccFatB基因克隆至双启动子原核表达载体pETDuet-Ι,得到重组质粒pETDuet-chFatB/pETDuet-ucFatB/ pETDuet-ccFatB。其中硫酯酶基因置于T7promoter 2下游，由T7启动子驱动表达。
5.根据权利要求I所述方法，其特征在于，所述atfA基因克隆至双启动子原核表达载体 pETDuet-chFatB/pETDuet-ucFatB/pETDuet-ccFatB,得到重组质粒 pETDuet-chFatB-atfA/pETDuet-ucFatB-atfA/pETDuet-ccFatB-atfA。其中酸基转移酶基因置于T7promoter I下游，由T7启动子驱动表达。
6.根据权利要求I所述方法，其特征在于，已转入重组质粒pETDuet-chFatB/ pETDuet-ucFatB/pETDuet-ccFatB 的重组大肠杆菌，经添加 O. 2-0. 48mM IPTG 诱导硫酯酶表达后，可特异性水解特定链长的脂酰ACP，分别得到C8:0-C10:0/C12:0/C14:0中链脂肪酸，其中pETDuet-chFatB重组大肠杆菌所产C8:0和C10:0脂肪酸所占比例为5.42%% 12. 6% ；PETDuet-ucFatB重组大肠杆菌所产C12:0脂肪酸所占比例为34. 52% ； pETDuet-ccFatB重组大肠杆菌所产C14:0脂肪酸所占比例为32. 21%。
7.根据权利要求I所述方法，其特征在于，已转入重组质粒pETDuet-chFatB-atfA/ pETDuet-ucFatB-atfA/pETDuet-ccFatB-atfA 的重组大肠杆菌，经添加 O. 2-0. 48mM IPTG 诱导硫酯酶和酰基转移酶表达与外源性流加1% -5%乙醇后，可催化乙醇与相应的中链脂酰-Cok发生酰基转移反应合成特定的C8:0-C10:0/C12:0/C14:0中链脂肪酸乙醇酯。
8.根据权利要求I所述方法，其特征在于，所述的来自萼距花属植物/月桂树/香樟中 FAT家族硫酯酶的核酸序列如序列1/3/5所示，各自所编码氨基酸序列如序列2/4/6所示。
9.根据权利要求I所述方法，其特征在于，所述来自不动杆菌中高度非特异性的双功能蜡酯合成酶/酰基辅酶A 二酰甘油酰基转移酶的核酸序列如序列7所示，所编码氨基酸序列如序列8所示。
全文摘要
本发明涉及一种利用工程大肠杆菌合成C8:0/C10:0/C12:0/C14:0中链脂肪酸及其乙酯的生产方法。具体步骤为将萼距花属植物/月桂树/香樟中具有不同特异性硫酯酶基因chFatB/ucFatB/ccFatB克隆至表达载体pETDuet-1中得到相应重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌BL21，IPTG诱导表达，表达的硫酯酶特异性水解特定链长的脂酰ACP得到中链脂肪酸；分别将不动杆菌中酰基转移酶基因atfA克隆至表达载体pETDuet-chFatB/pETDuet-ucFatB/pETDuet-ccFatB中得到相应重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌BL21，IPTG诱导表达，共表达的酰基转移酶利用外源性流加的乙醇与中链脂肪酸在胞内形成的脂酰-CoA发生酰基转移反应合成脂肪酸乙酯，得到利用重组大肠杆菌直接合成中链脂肪酸及其乙酯的工艺路线。
文档编号C12P7/62GK102586350SQ20121000479
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月9日 优先权日2012年1月9日
发明者刘军锋, 刘珞, 王芳, 范丽苹, 谭天伟, 邓利 申请人:北京化工大学