专利名称：一种将液态漆酶制备成高浓度高纯度固态漆酶的方法
技术领域：
本发明提供了一种将微生物发酵生产的液态漆酶制备成高浓度高纯度固态漆酶的方法，该发明的特点是以2010年9月15日保存于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC M 2010235的Pycnoporus sp. SYBC-L3高产漆酶的密孔菌属菌株为生产出发菌株，将各种不同成分的培养基和各种不同方法发酵生产的液态漆酶粗酶液制备成高浓度高纯度的固态漆酶，所制备的产品既便于运输、保藏，又便于出口创汇竞争国际市场，还可广泛应用于纺织印染、造纸、草坪修复、能源再生、饲料、食品、废水处理等领域，该发明的方法和原则也将为生物技术类产品的纯化、浓缩、制备所借鉴使用，属于生物技术领域。
背景技术：
漆酶具有广泛的底物，不仅能催化氧化多种芳香族化合物，还能降解木质素、去除许多有毒酚类物质的毒性，还可以使多种染料脱色及去除石油工业废水的毒性等，因此在纺织印染、造纸、草坪修复、能源再生、饲料、食品、废水处理等领域具有较大的应用价值而受到广泛的关注。现有漆酶的研究表明，漆酶的制备多数局限在实验室制备，所制备的漆酶活力偏低且制备成本偏高，我国市场上虽有固态漆酶，但酶活力很低且纯度也很低，高活力高纯度的固态漆酶完全依赖进口且价格昂贵，每克10万单位的进口固态漆酶，售价竟高达1600 元-4000元人民币，甚至这样的高价有时进口货还缺货，从而极大地影响了漆酶在各领域中具有较大的应用价值的推广实施，其原因可能是国外在进行液态漆酶纯化和浓缩时，采用了传统实验室的方法，即将液态漆酶采用硫酸铵分级沉淀——DEAE-纤维素离子交换柱层析——冷冻干燥等方法，从而使液态漆酶的纯化和浓缩成本费用较高且效率较低，难以大批量制备，这促使我们去探索研究寻求怎样将液态漆酶既要能低成本的纯化和浓缩，又要能高效率且大批量的制备成高活性高纯度的固态漆酶的方法，“一种将液态漆酶制备成高浓度高纯度固态漆酶的方法”就是在这样的探索研究中发明的。
发明内容
1、本发明发现和提供了一种既可将液态漆酶低成本的纯化和浓缩，又可将液态漆酶高效率且大批量制备成高活性高纯度固态漆酶的方法，率先将工厂常见的超滤设备和喷雾干燥设备应用于高活性高纯度固态漆酶的制备。2、本发明发现和提供了在使用超滤设备进行漆酶粗酶液纯化和浓缩时需根据液态漆酶的分子量大小和对纯度的要求来选择超滤膜的规格、分子量的原则、思路和方法。3、本发明发现和提供了在使用喷雾干燥机设备具体选用进风温度和出风温度时， 需根据液态酶液所含物质的浓度和酶对温度的耐热性来决定，一般来说酶耐热性好，进风温度可高些；进风温度与出风温度温差越大、液态酶液所含物质的浓度越大，则干燥成固态酶的速度越快的特点和方法。4、本发明发现和提供了使用喷雾干燥设备——进风温度150°C至200°C、出风温度70°C至90°C将液态漆酶喷雾干燥制备成固态漆酶的使用条件。5、本发明发现和提供了使用超滤设备——分子量为1万-10万规格的超滤膜可将液态漆酶纯化浓缩5-20倍的条件和规律。6、本发明发现和提供了将发酵液——漆酶粗酶液直接用喷雾干燥设备按进风温度150°C至200°C、出风温度70°C至90°C的条件可喷雾干燥成固态漆酶，固态漆酶的每克酶活是发酵粗酶液每毫升酶活的50倍以上，液态发酵粗酶液体积和重量是固态漆酶体积和重量的100倍以上的规律。7、本发明发现和提供了将发酵液——漆酶粗酶液先用超滤设备一选用分子量为1万-10万规格的超滤膜将液态漆酶粗酶液超滤纯化浓缩5-20倍，再用喷雾干燥设备按进风温度150°C至200°C、出风温度70°C至90°C的条件喷雾干燥制备成高浓度高纯度固态漆酶，固态漆酶的每克酶活是发酵粗酶液每毫升酶活的250倍以上，液态发酵粗酶液体积和重量是固态漆酶的体积和重量的800倍以上的规律。本发明的技术方案本发明是以2010年9月15日保存于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为 CCTCC M 2010235的Pycnoporus sp. STOC-L3高产漆酶的密孔菌属菌株为生产出发菌株，将各种不同成分的培养基和各种方法生产的液态漆酶粗酶液为起始酶液分成3个步骤并运用超滤设备和喷雾干燥设备来实现制备成高浓度高纯度固态漆酶的，并运用相同的DMP酶活力测定方法测定固态漆酶和液态漆酶的活力并进行比较，同时对固态漆酶和液态漆酶的重量和体积液进行比较，具体如下1、起始液态漆酶液的来源包括(1)以豆粕或硝酸钠为氮源，以麦芽糖或葡萄糖或果糖或纤维二糖或蔗糖等为碳源发酵生产制备的液态漆酶。(2)以马铃薯为主要原料发酵制备的液态漆酶。(3)以水稻秸秆为原料固态发酵制备的液态漆酶。2、纯化浓缩干燥的3个步骤包括(1)先将发酵生产制备出的漆酶粗酶液，用抽滤或压滤或离心的方法，除去菌体、 较大的悬浮物和颗粒。(2)再将上述除去菌体、较大的悬浮物和颗粒的粗酶液，用超滤设备，先选用1万分子量的超滤膜，超滤除去分子量在1万以下的小分子物质，然后用10万分子量的超滤膜， 收集分子量在1-10万的液体，得到纯化且浓缩了 5-20倍的酶液，因为我们制备的漆酶的分子量约为5. 8万左右。(3)最后将经超滤浓缩纯化后的漆酶液，用喷雾干燥机设备，选用进风口温度 150-200°C、出风温度70-90°C的条件，进行喷雾干燥，得到高浓度高纯度的固态漆酶。将高浓度高纯度固态漆酶和液态漆酶粗酶液的活力进行比较，将高浓度高纯度固态漆酶和液态漆酶酶粗酶液的体积或重量进行比较。(4)直接将除去菌体、较大的悬浮物和颗粒的粗酶液用喷雾干燥设备按进风温度 150°C至200°C、出风温度70°C至90°C的条件喷雾干燥成固态漆酶，将固态漆酶和液态漆酶粗酶液的活力进行比较，将固态漆酶和液态漆酶酶粗酶液的体积或重量进行比较。3、酶活的测定方法
3mL 反应体系中包括0. 5ml 10mmol/L 的 2，6_ 二甲氧基酚；2. 4ml pH = 3. 0 的 0. lmol/L磷酸氢二钠-柠檬素缓冲液；0. Iml粗酶液——发酵液经冷冻高速离心机IOOOOg 离心10分钟得到上清液并视酶活力稀释，以去离子水替代粗酶液溶液作为空白对照，在 469nm处测吸光值每隔k读取一次吸光度值，一般持续进行Imin后停止测定，以反应的线性范围计算酶活。酶活力定义1分钟催化一微摩尔底物所需酶量，酶活性以U · L—1表示。本发明的有益效果本发明打破了将液态漆酶用实验室传统方法纯化和浓缩制备成高活性高纯度固态漆酶的做法，使得既可将液态漆酶低成本的纯化和浓缩，又可将液态漆酶高效率且大批量的制备成高活性高纯度固态漆酶的想法变为现实，且方便易行。由于大大降低了纯化和浓缩的成本，所制备的产品既便于运输、保藏，又便于出口创汇竞争国际市场，从而将极大的促进漆酶在各个领域中的运用。同时，这一发明的方法和思路，也将为生物技术类产品的纯化和浓缩方法的研究和生产提供借鉴和帮助。由于漆酶可广泛应用于纺织印染、造纸、草坪修复、能源再生、饲料、食品、废水处理等方面，因此本发明将有力的促进漆酶的工业化生产和应用，结合我们的等待审批的专利——高产漆酶的菌株和产漆酶的方法将实施于企业生产，必将生产制备出价廉质优的漆酶产品来替代价格昂贵的进口漆酶并出口竞争国际市场。因此本发明具有广泛的工业使用价值和显著的经济效益和社会效应前景。
具体实施例方式实施例1取以豆粕或硝酸钠为氮源，以麦芽糖或葡萄糖或果糖或纤维二糖等为碳源发酵生产制备的液态漆酶粗酶液体积为40升，重量约40000克，粗酶液的活力为120U/ml。1、用先将发酵生产制备出的粗酶液，用大容量离心机离心或用定性滤纸抽滤或8 层纱布抽滤等方法，除去菌体、较大的悬浮物和颗粒。2、将上述除去菌体、较大的悬浮物和颗粒的粗酶液，用超滤设备，先选用1万分子量的超滤膜，超滤除去分子量在1万以下的小分子物质，然后用10万分子量的超滤膜，超滤收集分子量在1-10万的液体，得到纯化且浓缩了 10倍的液态漆酶。3、将经超滤浓缩纯化后的漆酶液，用喷雾干燥机设备，选用进风口温度200°C，出风温度70°C的条件，进行喷雾干燥，得到高纯度高活力固态漆酶25. 4克，用DMP法测固态漆酶活力为8. 5万U/g(相当于ABTS法测漆酶活力的二倍即17万U/g)。固态漆酶的每克酶活是发酵粗酶液每毫升酶活的708倍，液态发酵粗酶液体积和重量是固态漆酶的体积和重量的1575倍。4、如果将除去菌体、较大的悬浮物和颗粒的粗酶液直接用喷雾干燥机设备——选用进风口温度200°C，出风温度90°C的条件进行喷雾干燥，得到固态漆酶250克，用DMP法测固态漆酶活力为13640U/g(相当于ABTS法测漆酶活力的二倍即27^0U/g)。固态漆酶的每克酶活是发酵粗酶液每毫升酶活的114倍，液态发酵粗酶液体积和重量是固态漆酶的体积和重量的160倍。实施例2取以马铃薯为主要原料发酵高产制备的液态漆酶粗酶液体积为40升，重量40000克，粗酶液的活力为80U/ml。1、与实施例1中的(1)相同。2、与实施例1中的⑵相同，得到超滤后纯化和浓缩了 5倍的酶液。3、用喷雾干燥机设备-选用进风口温度150°C，出风温度70°C的条件，进行喷雾干燥，得到高纯度高活力固态漆酶27. 29克，用DMP法测固态漆酶活力为5. 1万U/g(相当于 ABTS法测漆酶活力的二倍即10. 4万U/g)。固态漆酶的每克酶活是发酵粗酶液每毫升酶活的638倍，液态发酵粗酶液体积和重量是固态漆酶的体积和重量的1466倍。4、将除去菌体、较大的悬浮物和颗粒的粗酶液直接用喷雾干燥机设备——选用进风口温度150°C，出风温度70°C的条件进行喷雾干燥，得到固态漆酶249克，用DMP法测固态漆酶活力为9120U/g(相当于ABTS法测漆酶活力的二倍即1.8 万U/g)。固态漆酶的每克酶活是发酵粗酶液每毫升酶活的114倍，液态发酵粗酶液体积和重量是固态漆酶的体积和重量的161倍。实施例3取以水稻秸秆为原料固态发酵制备的液态漆酶酶粗酶液体积为30升，重量30000 克，液态粗酶液的活力为9. 2U/ml。1、与实施例1中的(1)相同。2、与实施例1中的⑵相同，得到超滤后纯化和浓缩了 20倍的酶液。3、用喷雾干燥机设备-选用进风口温度180°C，出风温度80°C的条件，进行喷雾干燥，得到高纯度高活力固态漆酶13. 25克，用DMP法测固态漆酶活力为8280U/g(相当于 ABTS法测漆酶活力的二倍即1. 656万U/g)。固态漆酶的每克酶活是发酵粗酶液每毫升酶活的900倍，液态发酵粗酶液体积和重量是固态漆酶的体积和重量的2264倍。4、将除去菌体、较大的悬浮物和颗粒的粗酶液直接用喷雾干燥机设备——选用进风口温度180°C，出风温度80°C的条件进行喷雾干燥，得到固态漆酶151克，用DMP法测固态漆酶活力为1145U/g(相当于ABTS法测漆酶活力的二倍即2290U/g)。固态漆酶的每克酶活是发酵粗酶液每毫升酶活的125倍，液态发酵粗酶液体积和重量是固态漆酶的体积和重量的199倍。
权利要求
1.一种将液态漆酶制备成高浓度高纯度固态漆酶的方法，其特点是以2010年9月 15日保存于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC M 2010235的Pycnoporus sp. SYBC-L3高产漆酶的密孔菌属菌株为生产出发菌株，将各种不同成分的培养基和各种方法生产的液态漆酶粗酶液制备成高浓度固态漆酶，其中包括(1)以豆粕或硝酸钠为氮源，以麦芽糖或葡萄糖或果糖或纤维二糖等为碳源发酵生产制备的液态漆酶。(2)以马铃薯为主要原料发酵高产制备的液态漆酶。(3)以水稻秸秆为原料固态发酵制备的液态漆酶。
2.一种将液态漆酶制备成高浓度高纯度固态漆酶的方法，使用的主要设备是超滤机——选用分子量为1万-10万规格的超滤膜和喷雾干燥机——进风温度150°C至200°C、 出风温度70°C至90°C，将液态漆酶制备成高浓度高纯度固态漆酶，其工艺、条件和作用为(1)先将发酵生产制备出的漆酶发酵液，用抽滤或压滤或离心的方法，除去菌体、较大的悬浮物和颗粒，得到漆酶粗酶液，由于菌体是药用真菌，蛋白质含量高且产漆酶，故收集的菌体起码可作饲料或生物肥料。(2)将除去菌体、较大的悬浮物和颗粒的粗酶液，直接用喷雾干燥设备按进风温度 150°C至200°C、出风温度70°C至90°C的条件喷雾干燥成固态漆酶，固态漆酶的每克酶活是发酵粗酶液每毫升酶活的50倍以上，液态发酵粗酶液体积和重量是固态漆酶体积和重量的100倍以上。(3)用超滤设备——选用分子量为1万-10万规格的超滤膜将除去菌体、较大的悬浮物和颗粒的粗酶液超滤纯化并浓缩5-20倍，具体为先选用1万分子量的超滤膜，超滤除去分子量在1万以下的小分子物质，然后用10万分子量的超滤膜，超滤收集分子量在1-10万的液体，因为我们制备的漆酶的分子量约为5. 8万，得到纯化并浓缩了 5-20酶液。(4)用喷雾干燥机设备，选用进风温度150°C-200°C、出风温度70°C _90°C的条件将经超滤纯化浓缩了 5-20倍的漆酶液喷雾干燥制备成高浓度高纯度固态漆酶，固态漆酶的每克酶活是发酵粗酶液每毫升酶活的250倍以上，液态发酵粗酶液体积和重量是固态漆酶的体积和重量的800倍以上。
3.在选择超滤设备和喷雾干燥机设备的使用条件时，要按下列原则(1)超滤设备具体选用何种规格和分子量的超滤膜对粗酶液进行浓缩和纯化，需根据发酵制备的漆酶的分子量大小和对纯度的要求来决定，因为漆酶的分子量从几万到几十万不等。(2)喷雾干燥机设备具体选用进风温度和出风温度时，需根据液态酶液所含物质的浓度和酶对温度的耐热性来决定，一般来说酶耐热性好，进风温度可高些；进风温度与出风温度温差越大、液态酶液所含物质的浓度越大，则干燥成固态酶的速度越快。
全文摘要
一种将液态漆酶制备成高浓度高纯度固态漆酶的方法，提供了一种将微生物发酵生产的液态漆酶粗酶液制备成高浓度高纯度固态漆酶的方法，该发明的特点是以2010年9月15日保存于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC M 2010235的Pycnoporus sp.SYBC-L3高产漆酶的密孔菌属菌株为生产出发菌株，将各种不同成分培养基发酵生产的粗酶液用超滤设备——分子量为1万-10万规格的超滤膜纯化浓缩和用喷雾干燥设备——进风温度150℃至200℃、出风温度70℃至90℃将液态酶喷雾干燥制备成高浓度高纯度的固态漆酶，用DMP法测酶活并比较固态漆酶与液态粗酶液的酶活和体积，该发明将为生物技术类产品的纯化浓缩制备所借鉴使用，属于生物技术领域。
文档编号C12R1/645GK102559621SQ20121000791
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月12日 优先权日2012年1月12日
发明者廖祥儒, 张峰, 张明 申请人:江南大学