专利名称：一种高产丙位癸内酯的解脂耶氏酵母基因工程菌及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株高产Y -癸内酯的Yarrowia Iipolytica基因工程菌，同时涉及基因工程菌的构建方法及在エ业发酵中的应用。
背景技术：
Y-癸内酯(γ-decalactone，⑶L)，广泛存在于水果、肉制品和日常食品中，其具有浓郁的果香香气，稀释后有桃子香气，是构成水果香味的关键成分。现已在120多种食物的香气成分中发现了 Y-癸内酷。在成熟果实中，Y-癸内酯的含量可以达到15yg/kg，其中89%是(R)-异构体。在1969年，Y-癸内酯被美国食品药品管理局认为是安全的食品和药品添加剤。Y-癸内酯以其诱人的香气和低香气阈值(在水中仅为0.08mg/kg)的特性 广泛用于各类花香、果香、东方香型、檀香型日化香精中，也可用于食品、烟草、饲料、食用香精中。在Y-癸内酯的生物制备中可利用微生物尤其是酵母菌作为菌种，以蓖麻油中主要成分蓖麻油酸(12-羟基-9-十八碳烯酸)作为底物，先经过氧化使碳链缩短，再经内酯化即可生成Y-癸内酷。Tahara首次报道使用能够产生香味物质的酵母菌Sporobolomyces odorus生产得到Y-癸内酷。酵母菌一般选用假丝酵母(Candida sp.)、耶罗威亚酵母(Yarrowia Iipolytica)、锁掷抱酵母(Sporidiobolus sp·)、毕赤酵母(Pichia sp.)等,其中以Yarrowia Iipolytica降解蓖麻油产Y -癸内酯的能力最为显著。β -氧化是指脂酰-CoA进入线粒体基质后，在脂肪酸β -氧化酶系催化下进行的氧化分解作用。酰基-辅酶A氧化酶(Acyl-CoA oxidase)、3_酮酰-辅酶A硫解酶(3-ketoacyl-CoA thiolase)及双功能酶(Bifunctional enzyme)是 β-氧化反应过程中三个非常重要的酶，其中酰基-CoA氧化酶(Acyl-CoA oxidase)是β-氧化反应过程中的第一歩催化酶，被普遍认为为限速酶，其活力高低与Y-癸内酯的产量有直接关系。在Yarrowia Iipolytica中酸基-CoA氧化酶有5个同エ酶Aoxl_Aox5,分别由P0X1-P0X5基因编码。研究发现，POXl基因在敲除后几乎没有看到酰基-CoA氧化酶的活性有所改变，Aoxl对催化蓖麻油酸生产Y-癸内酯没有显著的促进或抑制作用；长链特异性酰基-CoA氧化酶Aox2能够特异性地催化蓖麻油酸生产Y-癸内酷，其多表达可促进Y-癸内酯产量的増加；短链特异性酰基-CoA氧化酶Aox3的存在会使Y-癸内酯进一歩降解，产生更短碳链的脂类；P0X4基因在敲除后没有发现对Y-癸内酯产量有大的影响，但是在同时敲除P0X3、P0X4基因后，Y-癸内酯产量却比单独敲除P0X3基因时提高更大，故推测P0X4基因可能作用是有助于P0X3基因对短链Y-癸内酯的降解起到调节作用；P0X5基因的破坏使得蓖麻油酸(C18)第一歩降解受到了影响，但影响不显著，从而推断Aox5对生成其他Cltl产物(如3-羟基癸内酷、2-癸烯)和Y-癸内酯的降解有极其微弱的促进作用。同时Aox3的活性还可能受到其他3个同エ酶Aoxl、Aox4、Aox5的影响。同源重组的发生依赖于载体与目的基因片段之间存在一定的DNA同源片段，同源片段越长则越有利于同源重组事件的发生。传统的同源重组载体的构建以DNA连接酶和限制性内切酶为基础，通过一系列的酶切连接反应将各片段连接在同一个载体上。但这种方法在连接过程中引入了不必要的酶切位点碱基序列，而且对于长片段的连接有时难以找到合适的酶切位点。为了克服传统的酶切连接方法的缺陷，出现了以聚合酶链式反应为基础的片段拼接技术，即融合PCR技术(Splice overlap extension PCR)。融合PCR技术在不需要内切酶消化和连接酶处理的条件下，采用具有互补末端的引物将不同来源的扩增片段连接起来，为同源重组片段的构建提供了快速简捷的途径。现有的融合PCR技术一般包括两步PCR反应(1)应用特异性的引物，对各片段进行单独的扩增，特异性引物的5'末端带有一段相邻片段的互补序列；(2)在同一反应体系中加入各片段的混合物，以ー对外侧引物进行融合片段的全长扩増。融合PCR技术在应用过程中还存在缺陷，如融合产物长度一般不超过4. Okb、待融合片段的个数一般不超过3个、产物的特异性差等问题。随着分子生物学的发展，基因敲除技术得到了快速发展，基于基因敲除技术构建重组菌株的方法也日渐成熟，且其安全性也更加可靠。这为高产Y-癸内酯YarrowiaIipolytica基因工程菌株的构建提供了可能性。
发明内容
本发明的目的之ー是提供ー种Yarrowia Iipolytica基因工程菌Tp_12。该菌种由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No. 5787，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。菌种保藏日期为2012年02月24日，分类命名为解脂耶氏酵母(拉丁名Yarrowia lipolytica)。该菌株利用蓖麻油酸产Y-癸内酯的转化率高，成本低，遗传稳定，且由于没有外源基因插入，生物安全性很高，可用于Y-癸内酯的エ业化生产。本发明的目的之ニ是提供Yarrowia lipolytica基因工程菌制备方法的核心技术——融合PCR。该方法不用考虑限制性内切酶酶切位点对实验的影响，而只用多轮PCR即可将不同的基因融合在一起，从而可以很快捷地构建好用于同源重组的敲除组件，且重复性好。本发明技术要点之三是利用酵母自身的铜抗性基因CRFl作为筛选标记，由于在构建过程中没有外源基因的插入所以转化子具有更高的生物安全性。Yairowialipolytica能够耐受较大浓度的铜离子,其铜离子抗性是S. cerevisiae的数倍,并且CRFl基因可编码铜-捕获转录因子，可捕获环境中的如铜离子等有毒金属离子，使得细胞可在含有大量金属离子的培养基中生长。不同Yarrowia lipolytica对铜离子的耐受度与其基因组内CRFl基因的拷贝数呈正比。由于CRFl基因的插入，转化子CRFl基因的拷贝数比野生型菌株更高，因而其对铜离子的抗性会明显提高。当将转化菌株和野生菌株分别接种至含不同铜离子浓度梯度的平板上时，铜离子浓度增高到一定水平，野生型菌株完全不能生长，而相比之下，能在此浓度或更高浓度铜离子培养基中正常生长的转化菌株就有可能是转化子。在本发明的一个实例中，很好的说明了这一点，从而筛选出成功敲除P0X3基因的转化子。本发明技术要点之四是利用石油醚对发酵液进行Y-癸内酯萃取而不是文献中所报道的こ醚。因为用こ醚萃取Y-癸内酯时发酵液中残留的蓖麻油也会进入到有机相、こ醚中，在之后的操作中也不易将こ醚去除掉，而蓖麻油不易挥发，在进行气相检测时可能残留在气相柱中堵塞柱子并影响检测结果，所以我们选用石油醚作为萃取剂。Y-癸内酯易溶于石油醚而蓖麻油不溶于石油醚这样就可以有效的避免上述问题，同时用石油醚萃取Y-癸内酯时，在振荡过程中不易乳化，有机相与水相分层迅速。本发明技术要点之五是对野生型菌株及转化子生长活力进行測定，发现转化子Tp-12以蓖麻油为主要碳源的发酵培养基中其生长活力明显低于野生型菌株。而在以葡萄糖为主要碳源的YEro培养基中其生长活力变化不大。由此我们可以推断出Ρ0Χ3基因对消化脂类物质有重要作用，而对葡萄糖的分解影响不大。菌株的生长能力对Y-癸内酯的产量有一定影响。同时，通过比较转化子Tp-12生长曲线与Y-癸内酯生成曲线，我们发现当菌株生长达到稳定期后Y-癸内酯才开始迅速积累，在生产过程中我们可以通过优化底物添加时间进一步提高Y-癸内酯的产量。本发明技术要点之六是通过气相检测可得到结果，野生型菌株Y-癸内酯的产量在70h时达到最大值O. 9g/L，但随着发酵时间的增加Y -癸内酯会被进ー步的降解为更短碳链的脂类，Y-癸内酯产量呈逐渐下降趋势，到120h Y-癸内酯几乎全部降解。敲除P0X3 基因并多表达P0X2基因的重组菌株Tp-12在IOOh时Y -癸内酯的产量达到最大值2. 9g/L，且产量稳定，发酵后期降解很小，可用于利用蓖麻油产Y-癸内酯的エ业化连续发酵培养。Y-癸内酯产量的增长是由于完全阻断了 Cltl水平下的β-氧化使Y-癸内酯不会被降解，同时加强C18水平的β-氧化以提高转化蓖麻油酸为Y-癸内酯的效率。本发明技术要点之七是米用麦麸作为发酵培养基的生长碳源。麦麸作为一种廉价的原料应用于Y-癸内酯的生物技术制备，不但能大大降低生产成本，更为重要的是，麦麸作为生长碳源的同时，能极大的提高Y-癸内酯的产率。初歩研究表明，麦麸的添加量作为影响Y-癸内酯产量的显著因素之一，可能是由于麦麸中含有丰富的阿魏酸、烟酸、肌醇等成分，它们有可能是促进蓖麻油生物转化成Y-癸内酯的重要影响因素。以麦麸为生长碳源，发酵周期约为72h，较普通发酵培养基周期大大缩短。当麦麸添加量为I. 5% -2. 5%吋，经初步经优化后，Y-癸内酯的产量接近4g/L，远远超过以葡萄糖为碳源时的Y-癸内酯产量。以麦麸为碳源，还能极大的降低发酵过程中的乳化程度，从而能有效提高Y-癸内酯的分离提取效率。实施例I. PCPP敲除组件的构建I.野生型Yarrowia lipolytica基因组总DNA的提取。2.利用SOE PCR技术进行PCPP敲除组件的构建。由NCBI 的 Entrez 检索系统,查知 Yarrowia lipolytica酵母菌的P0X3 基因，CRFl铜抗性基因及P0X2基因的全基因序列，并根据其CDS区的位置及启动子和終止子序列，用Primer premier 5. O软件设计其上游引物和下游引物。P0X3基因上段同源序列引物上游引物POX3-Up-I acaacaccttcacagagccacc下游引物P0X3-up -2 gaagacgagttgagacgaagactttcgcacccagtagtcgtCRFl基因引物上游引物 CRF1-1 acgactactgggtgcgaaagtcttcgtctcaactcgtcttc下游引物 CRF1-2 agagccgagggagaataaacggcgaaattggcggttggtat
P0X2基因引物上游引物 P0X2-1 ataccaaccgccaatttcgccgtttattctccctcggctct下游引物 P0X2-2 gattcccgtgcccgtattactctacccgcttgtctattccP0X3基因下段同源序列引物上游引物 P0X3_down-l ggaatagacaagcgggtagagtaatacgggcacgggaatc下游引物P0X3-down_2 accgaacccatactccac利用PCR的方法扩增Yarrowialipolytica P0X3基因(GenBank登陆号AJOO1301)上游同源序列，CRFl基因(GenBank登陆号Z23265)，P0X2(基因GenBank登陆号AJ001300)，P0X3基因下游同源序列。接着用SOE PCR的方法进行3轮PCR，构建敲除组件。
第一轮PCR表I. P0X3基因上游同源序列的PCR扩增反应体系
权利要求
1.一种Yarrowia Iipolytica基因工程菌株Tp_12 (CGMCC No. 5787),其特征在于敲除其染色体上的Ρ0Χ3基因的同时将Ρ0Χ2基因导入其内部以使转化菌株在Ρ0Χ3基因表达被阻断的同时可以多表达Ρ0Χ2基因。
2.ー种用于权利要求I所述的基因工程菌的制备方法，其特征在于运用了融合PCR(SOE PCR)的方法进行敲除组件的构建。
3.ー种用于权利要求2所述的构建敲除组件的SOE PCR方法，其特征在于融合PCR的引物设计方法。
4.ー种用于权利要求书I所述的基因工程菌株的筛选，其特征在于采用了菌株本身的铜抗性基因，保证了其生物安全性。
5.ー种用于权利要求书1、4所述的基因工程菌在生产Y-癸内酯中的应用。
6.ー种用于权利要求书5所述的基因工程菌在生产Y-癸内酯中的应用，其特征在于以麦麸为发酵培养基的生长碳源。
全文摘要
本发明公开了一种解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)基因工程菌及制备方法和应用，选取野生菌株染色体中POX3基因作为靶基因，在敲除POX3基因同时将POX2及CRF1基因插入到其内部，使其完全丧失短链特异性酰基-CoA氧化能力(POX3基因编码)，同时多拷贝了编码长链特异性酰基-CoA氧化酶的POX2基因，获得的工程菌株产γ-癸内酯的能力得到极大增强。标记基因CRF1也来自出发菌株，故可确保其生物安全性。转化子Tp-12遗传稳定且由于其在发酵过程中γ-癸内酯产量降解效率不明显，故其可用于利用蓖麻油产丙位癸内酯(γ-癸内酯)的工业化连续发酵培养。
文档编号C12N1/19GK102676410SQ20121006579
公开日2012年9月19日 申请日期2012年3月14日 优先权日2012年3月14日
发明者丁永志, 冯春利, 宋焕禄, 杜闪, 郭艳琼 申请人:北京工商大学