专利名称：拜氏梭菌及其以木糖渣为原料发酵制备生物丁醇的方法
技术领域：
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及高产丁醇的拜氏梭菌Clostridiumbei jerinckii Y_3及ー种利用エ业废弃物木糖洛经氢氧化韩脱毒预处理、厌氧酶解及梭菌发酵生产生物丁醇的方法。
背景技术：
丁醇作为重要的有机化工原料，在医药エ业、塑料エ业、有机エ业、印染等方面具有广泛用途。除可用作溶剂外，丁醇还是一种极具潜力的大宗动カ燃料，其燃烧值和汽油相当，是汽车用油的替代品。丁醇的生产エ艺主要有化学合成法和微生物发酵法两种。随着石油资源的日益枯竭，采用以石油为原料丙烯羰基合成法生产丁醇已举步维艰，而且由于技术落后，装置偏小导致产能不够，致使中国丁醇市场长期供应不足，不能满足国内市场的需求。生物发酵法制备丁醇有其独到的优势，发展生物丁醇将极大地缓解丁醇供应不足的现状。目前，困扰生物丁醇产业发展的主要障碍有第一，发酵原料费用高，发酵用基质在丁醇发酵生产成本的70%左右；第二，由于发酵原料及产物的毒性，导致产物浓度低；第三，产物回收费用高，由于发酵产物浓度低，回收丁醇消耗大量能源。其中菌株和原料问题一直是困扰丁醇发酵的瓶颈。近年来，国内外对纤维原料发酵产丁醇的研究很多，主要围绕菌种诱变选育，寻找合适的纤维原料及其糖液制备、发酵エ艺条件优化和溶剂提取等方面进行。Mermelstein等(Biotechnol. Bioeng. 1993,42 176-183)利用基因工程技术构建了重组菌株，丁醇产量比出发菌株提高了 37%。可见，进行菌株改良是提高丁醇产量，增强发酵竞争力的关键手段之一。另外由于我国人口众多，用传统的原料(玉米和甘蔗)发酵生产丁醇势必会造成与人争粮的问题，造成粮食短缺，因此开展以可再生的生物质材料为原料生物转化生产生物丁醇是符合国情的研究方向。木糖渣是玉米棒芯经酸水解制取木糖、木糖醇后剩下的酸性固体纤维残渣，其主要成分为纤维素、半纤维素和木质素。木糖渣中的半纤维素比例降低，纤维素比例较高，使木糖渣成为一种很有潜力的纤维素原料。而作为纤维残渣的木糖渣目前却被エ厂视为废弃物，其存放不仅占用了大量的耕地，并对周边环境造成了严重污染。因此合理地开发和利用废弃木糖渣，不仅能控制污染，保护农田生态环境，还可取得显著的经济效益。相比于其他原料如谷物、薯类、糖蜜及秸杆等而言，木糖渣作为丁醇生产的原料，具有来源稳定，收集和储存成本低等优点。因此将其应用于液体生物丁醇的开发有具备较好的经济价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一株高产拜氏梭菌菌株，使其厌氧发酵丁醇产量提高，以解决生物发酵生产丁醇菌种能力问题。本发明的又一目的在于提供ー种利用该高产拜氏梭菌菌株以エ业废弃物木糖渣、为原料制备生物丁醇的方法，以解决木糖渣制备生物丁醇过程中抑制物不利于纤维素酶酶解和该菌株厌氧发酵的难题。为实现上述目的，本发明提供的一株高产拜氏梭菌，其分类命名为拜氏梭菌Clostridium bei jerinckii Y-3,其保藏登记号为CGMCC 5805,保藏单位中国普通微生物菌种保藏管理中心。本发明提供的利用高产拜氏梭菌Y-3以木糖渣为原料发酵制备生物丁醇的方法，包括如下步骤I)利用氢氧化钙脱毒エ艺对木糖渣的固液混合物进行预处理； 2)步骤I)预处理得到的木糖渣残渣中加入纤维素酶进行酶解，得到含多组份糖的酶解液；
3)在酶解液中加入氮源，调节pH至6-8，制成木糖渣水解液发酵培养基；4)将拜氏梭菌Y-3接种至步骤3)制成的木糖渣水解液发酵培养基中，厌氧条件下发酵制备生物丁醇。所述的方法，其中，步骤I)的木糖渣为玉米芯酸水解后的残渣。所述的方法，其中，步骤I)的氢氧化钙脱毒エ艺中氢氧化钙为O. 4-0. 6M的氢氧化钙溶液，木糖渣的固液混合物中的料液比为8-12% w/v，用氢氧化钙溶液调节木糖渣的固液混合物的pH至10-11，之后加入亚硫酸钠。所述的方法，其中，步骤2)加入纤维素酶之前，先将经氢氧化钙脱毒エ艺处理的木糖渣残渣和pH为4-5，浓度为O. 1-0. 2M的醋酸钠-醋酸缓冲液按固液比8-10% w/v混合，经过脱氧处理后高压灭菌。所述的方法，其中，步骤2)所述纤维素酶为纤维素酶复合物和β -葡萄糖苷酶；酶解的pH值为4-5。所述的方法，其中，步骤3)中的木糖渣水解液发酵培养基为pH 6-8的含有碳源、氮源及无机盐的固液培养基；其中的碳源为酶解液中的多组分糖；氮源为麸皮、玉米粉、豆柏、米糠、花生饼、牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、硝酸盐或铵盐中的ー种以上混合物。所述的方法，其中，步骤4中发酵温度为33_37°C。本发明的方法，将氢氧化钙脱毒处理工艺应用于木糖渣的预处理，減少了纤维素酶解和梭菌厌氧发酵过程中存在的抑制物，从而提高产糖量及溶剂产量，最終減少生物丁醇的生产成本，解决了传统生物发酵生产丁醇菌种能力和原料不足的问题，实现了エ业废弃物向高附加值生物能源的转变，是ー种环境友好、エ业应用前景良好的制备生物丁醇的方法。
具体实施例方式一方面，本发明要解决的技术问题是提供一株高产拜氏梭菌菌株，使其厌氧发酵丁醇产量提高，以解决生物发酵生产丁醇菌种能力问题；另ー方面，本发明要解决的技术问题是提供一种该高产拜氏梭菌菌株以エ业废弃物木糖渣为原料制备生物丁醇的方法，以解决木糖渣制备生物丁醇过程中抑制物不利于纤维素酶酶解和该菌株厌氧发酵的难题。为了解决上述技术问题，发明采用的技术方案如下
一株高产拜氏梭菌，其分类命名为拜氏梭菌Clostridium bei jerinckii Y_3,其保藏登记号为=CGMCC 5805，保藏单位中国普通微生物菌种保藏管理中心(地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院生物研究所)，保藏日期为2012年2月24日。本发明所述的高产拜氏梭菌Clostridium beijerinckii Y_3的筛选方法,将出发菌株拜氏梭菌Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 (购于英国国家エ业、海洋和食品菌种保藏中心)经甲基磺酸こ酯(EMS)诱变后，利用淀粉平板和2-脱氧-D-葡萄糖平板筛选得到高淀粉酶活力的菌株，再经厌氧发酵筛选得到高产丁醇、丙酮、こ醇的目标菌株。其具体诱变步骤如下a) EMS诱变将拜氏梭菌原始菌株活化培养，25mL厌氧瓶装液量10 15mL，培养温度33 37°C，培养时间12 16小时，得到处于对数生长期的菌液；取lmL，离心收集菌体，用50mM无菌磷酸盐缓冲液(pH 7. O)洗涤菌体3次，之后加入含有O. 5 2% EMS的种 子培养基中，处理10 60分钟后，离心弃上清，加入5%的硫代硫酸钠终止反应；b)淀粉平板初筛菌株经EMS诱变后，用无菌生理盐水洗出，稀释成不同浓度涂布于淀粉平板培养基上，在33 37°C温度下厌氧培养12 30小吋，滴加碘液，挑选出在该平板上透明圈较大的菌落；c) 2-脱氧-D-葡萄糖平板复筛将步骤b)筛选的菌株接种于25mL厌氧瓶装液量10 15mL的种子培养基中，33 37°C厌氧培养10 14小时，无菌生理盐水稀释至适当浓度涂布于2-脱氧-D-葡萄糖平板培养基中，在33 37 °C温度下厌氧培养12 30小时，滴加碘液，挑选出在该平板上透明圈较大的菌落；d)厌氧发酵将步骤c)筛出的菌落接入种子培养基扩大培养，培养温度33 37°C，厌氧培养培养时间10 16小时，然后在发酵培养基中发酵，接种量5% 15% (v/V)，发酵温度33 37°C，厌氧发酵发酵时间60 80小时；考察筛选出的菌落发酵丁醇和总溶剂的产量。步骤a)中所述的EMS诱变方法中，优选I % EMS作为诱变剂量，20分钟作为诱变时间。步骤b)所采用的淀粉平板培养基，碳源为淀粉和葡萄糖两种的混合，氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为こ酸铵、氯化铵中的ー种或多种，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆的ー种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的ー种或多种；生长因子为对氨基苯甲酸、维生素B1、生物素和玉米浆中的一种或多种的混合，固体培养基中添加琼脂。步骤c)所采用的2-脱氧-D-葡萄糖平板培养基，碳源为2-脱氧-D-葡萄糖和淀粉两种的混合，氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为こ酸铵、氯化铵中的ー种或多种，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆的ー种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的ー种或多种；生长因子为对氨基苯甲酸、维生素B1、生物素和玉米浆中的ー种或多种的混合，固体培养基中添加琼脂。步骤a)、c)和d)所采用的种子培养基中，碳源为葡萄糖和淀粉中的ー种或多种；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为こ酸铵、氯化铵中的ー种或多种，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆的ー种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的ー种或多种；生长因子为对氨基苯甲酸、维生素B1、生物素和玉米浆中的ー种或多种的混合。步骤d)所采用的发酵培养基中，碳源为葡萄糖、淀粉、木质纤维水解液中的ー种或多种；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为こ酸铵、氯化铵中的ー种或多种，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆的ー种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的ー种或多种；生长因子为对氨基苯甲酸、维生素B1、生物素和玉米浆中的ー种或多种的混合。本发明提供的利用上述高产拜氏梭菌以木糖渣为原料发酵制备生物丁醇的方法，包括如下步骤
I)利用氢氧化钙脱毒エ艺对木糖渣的固液混合物进行预处理；2)步骤I)预处理得到的木糖渣残渣中加入纤维素酶进行酶解，得到含多组份糖的酶解液；3)在酶解液中加入氮源，调节pH至6-8，制成木糖渣水解液发酵培养基；4)将高产拜氏梭菌接种至步骤3)制成的木糖渣水解液发酵培养基中，发酵制备生物丁醇。所述的方法，其中，步骤I)的木糖渣为玉米芯酸水解后的残渣。所述的方法，其中，步骤I)的氢氧化钙脱毒エ艺中氢氧化钙为O. 4-0. 6 M的氢氧化钙溶液，木糖渣的固液混合物中的料液比为8-12% w/v，用氢氧化钙溶液调节木糖渣的固液混合物的pH至10-11，之后加入亚硫酸钠。所述的方法，其中，步骤2)加入纤维素酶之前，先将经氢氧化钙脱毒エ艺处理的木糖渣残渣和pH为4-5，浓度为O. 1-0. 2M的醋酸钠-醋酸缓冲液按固液比8-10% w/v混合，经过脱氧处理后高压灭菌。所述的方法，其中，所述纤维素酶为诺維信公司生产的用于转化木质纤维素原料的Biomass KU，其中包括纤维素酶复合物(NS 50013)和β -葡萄糖苷酶(NS 50010);酶解的pH值为4-5。所述的方法，其中，步骤3)中的木糖渣水解液发酵培养基为pH 6-8的含有碳源、氮源及无机盐的固液培养基；其中的碳源为木糖渣酶解液中的多组分糖；氮源为麸皮、玉米粉、豆柏、米糠、花生饼、牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、硝酸盐或铵盐中的ー种以上混合物。所述的方法，其中，步骤4)中的丁醇生产菌为拜氏梭菌Clostridiumbeijerinckii Y_3，发酵条件为厌氧，发酵温度为33_37°C。本发明采用EMS诱变拜氏梭菌，利用淀粉平板和2-脱氧-D-葡萄糖平板筛选出高淀粉酶活力的菌株，该菌株能高效利用不同碳源发酵生产丁醇，葡萄糖为碳源时，在5L发酵罐中总溶剂和丁醇产量分别达到了 15. 8g/L和9. 4g/L，分别比出发菌提高了 30.6%和40. 3%。以下提供更佳实施例，同时列举对比例对本发明的效果进行比较，以更好的理解本发明。然而本领域技术人员容易理解，实施例中所描述的物料配比、エ艺条件及其结果仅用于说明和帮助理解本发明的技术方案，而不应当也不会限制权利要求的范围。实施例I :本实施例说明将原始菌株拜氏梭菌C. beijerinckii NCIMB 8052进行甲基磺酸こ酯(EMS)诱变的方法。原始菌株拜氏梭菌C. beijerinckii NCIMB 8052购于英国国家エ业、海洋和食品菌种保藏中心(NCMB)，进行EMS诱变的方法如下将原始菌株拜氏梭菌C. beijerinckii NCIMB 8052于33 37°C下活化培养12 18小时，得到生长旺盛、菌体粗壮的菌液；取新鲜培养的菌液lmL，离心收集菌体，用50mM无菌磷酸缓冲液(pH 7. O)洗涤菌体3次，之后加入含有O. 5 2% EMS的种子培养基中，处理10 60分钟后，离心弃上清，加入5%的硫代硫酸钠终止反应；通过计算存活率可知，I %EMS是最佳诱变剂量，20分钟是最佳诱变时间。实施案例2 :本发明说明筛选优良拜氏梭菌的方法。其中，所使用的培养基配方如下(I)淀粉平板培养基可溶性淀粉5g/L，葡萄糖5g/L，酵母粉lg/L，磷酸氢ニ钾、O. 5g/L，磷酸ニ氢钾O. 5g/L，こ酸铵2. 2g/L，七水合硫酸镁O. 2g/L，一水合硫酸锰O. 01g/L,七水合硫酸亚铁O. 01g/L,氯化钠O. 01g/L,对氨基苯甲酸O. 001g/L,维生素B1 O. 001g/L,生物素0.0001g/L，琼脂15g/L，其余为水，pH 6.5。(2) 2-脱氧-D-葡萄糖平板培养基可溶性淀粉5g/L，2_脱氧-D-葡萄糖5g/L，酵母粉lg/L，磷酸氢ニ钾0. 5g/L，磷酸ニ氢钾0. 5g/L，こ酸铵2. 2g/L，七水合硫酸镁0. 2g/L，一水合硫酸锰0. 01g/L,七水合硫酸亚铁0. 01g/L,氯化钠0. 01g/L,对氨基苯甲酸0. OOlg/L，维生素B1 0.001g/L，生物素0.0001g/L，琼脂15g/L，其余为水，pH 6.5。(3)发酵种子培养基葡萄糖20g/L，酵母粉lg/L，磷酸氢ニ钾0. 5g/L，磷酸ニ氢钾0. 5g/L，こ酸铵2. 2g/L，七水合硫酸镁0. 2g/L，一水合硫酸锰0. 01g/L,七水合硫酸亚铁0. 01g/L，氯化钠0. 01g/L,对氨基苯甲酸0. 001g/L,维生素B1 0. 001g/L,生物素0. OOOlg/L，其余为水，pH 6.5。(4)发酵培养基葡萄糖60g/L，酵母粉lg/L，磷酸氢ニ钾0. 5g/L，磷酸ニ氢钾0. 5g/L，こ酸铵2. 2g/L，七水合硫酸镁0. 2g/L，一水合硫酸锰0. 01g/L,七水合硫酸亚铁
0.01g/L，氯化钠0. 01g/L,对氨基苯甲酸0. 001g/L,维生素B1 0. 001g/L,生物素0. OOOlg/L，其余为水，pH 6.5。筛选步骤I)淀粉平板初筛菌株经EMS诱变后，用无菌生理盐水洗出，稀释成不同浓度涂布于淀粉平板培养基上，在37°C温度下厌氧培养30小时，滴加碘液，挑选出在该平板上生长、菌落较大、且透明圈明显较大的菌落10株。2) 2-脱氧-D-匍萄糖平板复筛将初筛得到的菌株接种于25mL厌氧瓶装液量10 15mL的种子培养基中，37°C厌氧培养14小时，无菌生理盐水稀释至适当浓度涂布2-脱氧-D-葡萄糖平板培养基中，在33 37°C温度下厌氧培养30小时，滴加碘液，挑选出在该平板上透明圈明显大于出发菌的菌落。最终菌株Y-3显示了较高的淀粉酶活力。3)摇瓶发酵将诱变菌株Y-3和原始菌株接入种子培养基扩大培养，培养温度37°C，IOOmL厌氧瓶装液量50mL，培养12小吋。然后在发酵培养基中发酵，接种量为5% (v/v)，发酵温度35°C，250mL厌氧瓶装液量IOOmL,发酵时间96小时后检查诱变菌株的总溶剂产量和丁醇产量如表I所示表I诱变菌株Y-3和原始菌株发酵结果比较
权利要求
1.ー株拜氏梭菌,其分类命名为拜氏梭菌Clostridium beijerinckii Y_3,其保藏登记号为=CGMCC 5805，保藏单位中国普通微生物菌种保藏管理中心。
2.权利要求I所述的拜氏梭菌在生产丁醇中的应用。
3.ー种利用拜氏梭菌Υ-3以木糖渣为原料发酵制备生物丁醇的方法，包括如下步骤 1)利用氢氧化钙脱毒エ艺对木糖渣的固液混合物进行预处理； 2)步骤I)预处理得到的木糖渣残渣中加入纤维素酶进行酶解，得到含多组份糖的酶解液； 3)在酶解液中加入氮源，调节pH至6-8，制成木糖渣水解液发酵培养基； 4)将拜氏梭菌Y-3接种至步骤3)制成的木糖渣水解液发酵培养基中，厌氧条件下发酵制备生物丁醇。
4.如权利要求3所述的方法，其中，步骤I)的木糖渣为玉米芯酸水解后的残渣。
5.如权利要求3所述的方法，其中，步骤I)的氢氧化钙脱毒エ艺中氢氧化钙为O. 4-0. 6M的氢氧化钙溶液，木糖渣的固液混合物中的料液比为8-12% w/v，用氢氧化钙溶液调节木糖渣的固液混合物的PH至10-11，之后加入亚硫酸钠。
6.如权利要求3所述的方法，其中，步骤2)加入纤维素酶之前，先将经氢氧化钙脱毒エ艺处理的木糖渣残渣和pH为4-5，浓度为O. 1-0. 2M的醋酸钠-醋酸缓冲液按固液比8-10%w/v混合，经过脱氧处理后高压灭菌。
7.如权利要求3所述的方法，其中，步骤2)所述纤维素酶为纤维素酶复合物和β-葡萄糖苷酶；酶解的PH值为4-5。
8.如权利要求3所述的方法，其中，步骤3)中的木糖渣水解液发酵培养基为pH6-8的含有碳源、氮源及无机盐的固液培养基；其中的碳源为酶解液中的多组分糖；氮源为麸皮、玉米粉、豆柏、米糠、花生饼、牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、硝酸盐或铵盐中的ー种以上混合物。
9.如权利要求3所述的方法，其中，步骤4中发酵温度为33-37°C。
全文摘要
一株高产丁醇的拜氏梭菌，其分类命名为拜氏梭菌Clostridium beijerinckii Y-3，其保藏登记号为CGMCC 5805。本发明利用拜氏梭菌以木糖渣为原料制备生物丁醇的方法，包括氢氧化钙脱毒预处理、厌氧酶解、C.beijerinckii Y-3厌氧发酵培养基的制备及发酵生产生物丁醇。本发明利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变，淀粉平板和2-脱氧-D-葡萄糖平板筛选得到的高产丁醇菌株，能够利用经氢氧化钙脱毒工艺处理后的木糖渣为原料发酵生产丁醇，解决了传统生物发酵生产丁醇菌种能力和原料不足的问题，实现了工业废弃物向高附加值生物能源的转变，是一种环境友好、工业应用前景广阔的制备生物丁醇的方法。
文档编号C12R1/145GK102719371SQ20121008940
公开日2012年10月10日 申请日期2012年3月30日 优先权日2012年3月30日
发明者刘自勇, 张婉璐, 李福利 申请人:中国科学院青岛生物能源与过程研究所