本发明涉及一种优势微生物通过一定配比加入普洱茶中发酵的方法，并将根据温度和水分的控制，稳定地生产优质普洱茶。
背景技术：
：：普洱茶(Pu-Ertea)原产于我国云南，目前推广到广西、四川等地，以大叶茶，野生茶，大理茶和苦茶的晒青茶为原料，堆积自然发酵生产的。普洱茶的品质特点为外形色泽棕褐、条索粗壮、内质滋味醇厚、陈香显著、汤色红浓、叶底红褐，具有降脂减肥、抗衰老、防癌等多种生理功能。并且对于防治心脑血管疾病，抗氧化，增强免疫力，缓解烟瘾危害等也有一定功效。目前，优质的传统普洱茶生产方法是生晒的青茶，加水、堆积、利用自然界微生物天然发酵、发酵温度到60℃，翻堆降温、一般发酵40～60天左右，自然风干、陈化得到普洱茶。但其传统方法盲目性大，有时能产优质产品，但有时出现劣质产品，产品质量不稳定，易感染杂菌，难以实现现代化稳定生产。曾报道的《云南普洱茶人工接种发酵研究》一文(彭翠珍等，云南大学学报，2008，30(S1)：351～355)，从自然发酵生产的普洱茶中分离筛选黑曲霉、青霉、毛霉、根霉、酵母等微生物；并将其单独菌、或者黑曲霉与酵母、或毛霉与黑曲霉、或青霉与酵母微生物组合，人工接种于青茶原料中、进行普洱茶发酵，尝试了普洱茶生产；其中(黑曲霉+酵母)及(青霉+酵母)的菌种组合的接种、发酵生产的普洱茶主要生化成分及感观指标，接近传统普洱茶亦有、发明专利号为200610010958.4公开了一种茶叶的后发酵生产方法：从自然发酵生产的普洱茶中分离筛选了温特曲霉烟色变种、帚状曲霉、具黄曲霉、埃及曲霉、臭曲霉、日本曲霉原变种、局限灰曲霉等7种曲霉属的微生物，并在其7种曲霉菌中选用一种或者几种曲霉菌、制成“普洱茶曲”、接种于预先灭菌过的青茶原料中，在30-50℃发酵生产普洱茶。(陈可可等，云南植物研究，2008，30(5)：624～628)但是，我国固有的传统普洱茶天然发酵时，至少几十种微生物协同发酵，生产出特有风味的传统普洱茶；上述方法(现有技术)的选用一种或者两种或者几种的、从传统普洱茶筛选的微生物、人工接种于青茶原料，发酵生产普洱茶，均不能代表传统普洱茶天然发酵的微生物菌群的发酵，其生产的普洱茶品质和风味与传统普洱茶相比仍有差距。为了克服上述现有技术的缺点，本发明，从刚发酵生产的优质传统天然普洱茶中分离筛选所有微生物菌群及优势微生物，将分离得到微生物进行鉴定和单菌发酵试验，从而得到优势并且有益的微生物，再根据微生物的作用，以一定的比例加入灭菌的普洱茶中进行发酵，并根据温度和水分的变化来控制工艺过程。技术实现要素：：本发明为了克服现有发酵工艺中所存在的技术问题，通过菌种分离和鉴定，将天然普洱茶发酵过程中不起作用的菌和有害的菌剔除，使普洱茶更具安全性。通过单菌发酵试验，根据其对理化参数以及口感，香气等的影响选择优势微生物加入灭菌后的青茶原料中进行发酵。在发酵过程中以温度检测数据为依据，进行翻堆，和对水分的准确控制，增强了普洱茶发酵的稳定性。本发明的技术解决方案：一种制备普洱茶的方法，其特征在于，经过以下步骤：1)向含水量为30-40％的青茶原料中接入重量百分比为0.08-0.1％的普通青霉，0.08-0.1％的黑曲霉，0.2-0.3％的皱褶假丝酵母进行发酵；2)根据温度的变化进行翻堆，并对水分进行控制，第一次翻堆的依据是底层温度达到52-55℃；以后每次的翻堆依据是底层温度达到60-63℃，翻堆3-6次。每次翻堆时取样检测水分，当水份含量为25-28％时，补充水份含量到33-35％，最后一次翻堆后不补水，通风阴凉处干燥，除湿得到普洱茶熟茶。步骤1中所述分离微生物是从经过天然发酵生产的优质普洱茶(如市场公认的价格昂贵，品质优良的产品，如：永年，大益品牌的产品)中分离其中的所有微生物。根据本发明的研究，优质普洱茶中所有微生物种类大约为100种，微生物的分离方法为现有常规技术，如表面皿培养法。筛选步骤如下：1)提取普洱茶样品总DNA；2)以总DNA为模板，在引物的引导下进行PCR扩增；3)对目的片段进行变性梯度凝胶电泳，sybrgreen染色后得到DGGE指纹图谱；4)回收优势条带，并以此为模板，在引物的引导下进行PCR扩增，对目的片段进行测序；5)对测序结果进行序列比对分析，选出优势微生物，进一步选出最优势微生物。6)将样品进行平板分离，选出纯菌株，鉴定，找去优势微生物菌株。将筛选得到的最优势微生物通过种子培养，使其达到对数期，经平板检测和镜检确定无染菌现象之后，按照最优势微生物在青茶原料中的重量百分比向青茶原料中添加最优势微生物。其中所述优势微生物配比优选为：普通青霉0.08％，黑曲霉0.08％，皱褶假丝酵母0.3％。优选制备方法为：1)向含水量为35％的青茶原料中接入重量百分比为0.08％的普通青霉，0.08％的黑曲霉，0.3％的皱褶假丝酵母进行发酵；2)根据温度的变化进行翻堆，并对水分进行控制，第一次翻堆的依据是底层平均温度达到53℃；以后每次的翻堆依据是底层平均温度达到62℃，共翻堆4次。每次翻堆时取样检测水分，当水份含量为25-28％时，补充水份含量到33-35％，最后一次翻堆后不补水，通风阴凉处干燥，除湿得到普洱茶熟茶。本发明优选的制备方法，步骤如下：1)取刚经过天然发酵生产的优质普洱茶，用无菌水稀释制成10-3～10-8倍微生物稀释液，分别涂布于盛有PDA，YEPD，察氏和肉汤固体培养基的培养皿中，在28～35℃培养2～4天，得到100个左右单菌落的培养皿；将单菌落不断的接到新的培养基中，重复这个过程2-4次，最后将单菌落接到其各自对应的斜面培养基中，保存备用。通过16SrDNA测序法对得到的菌种进行鉴定，确定微生物的种类；2)通过PCR-DGGE方法筛选得到优势微生物，将优势微生物进行单菌发酵试验，种子培养采用察氏，YEPD液体培养基，将霉菌，酵母菌分别培养至各自的对数期，接到装有100g灭菌后青茶的1000mL三角瓶培养20-25天，接菌量为普通青霉和黑曲霉0.08-0.1％，皱褶假丝酵母为0.2-0.3％。然后干燥，检测理化数据，并进行品评，根据品评结果选出最优势微生物。3)将确定的最优势微生物经过种子培养后接到青茶原料中进行发酵，添加比例为普通青霉0.08-0.1％，黑曲霉0.08-0.1％，皱褶假丝酵母0.2-0.3％。4)第一次翻堆的依据是底层温度有6个点的温度达到52-55℃以上；以后每次的翻堆依据底层温度有6个点的温度达到60-63℃，翻堆4-5次。每次翻堆时取样，取样点3个，再混为1个点之后检测水分，当水分达到25-28％左右时，再进行补水到33％-35％，最后一次翻堆后不再进行补水，接到发酵21-25天结束。通风阴凉处干燥，除湿得到普洱茶熟茶。发明筛选得到的最优势微生物是现有技术，描述在人工接种真菌发酵普洱茶的化学成分变化研究文献中，其主要特点如下：无害，可以快速转化茶多酚，易于培养。经检测其茶多酚含量达到6-10％，水浸出物含量达到35-45％，经感官品评其干茶呈深褐色，汤色透亮红褐，滋味醇厚，略带甜味，陈香味道浓厚。本发明同现有技术相比，最大的特点是“传统普洱茶微生物群种子”中传统普洱茶发酵所需的优势微生物菌群俱全，剔出了无用微生物的参与，由它发酵的普洱茶质量优于传统普洱茶，生产好控制，每批质量相同、稳定，缩短传统普洱茶发酵时间等；克服了传统普洱茶发酵中发酵周期长，产品质量不稳定，杂菌多，安全性差等缺点。具体实施方式：以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。实验例：菌种比例确定1)原料：云南天士力公司晒青毛茶2)接种量1：0.08％；2：0.08％；3：0.3％(根据茶叶湿重计算)3)种子：将本发明最优势微生物普通青霉，黑曲霉，皱褶假丝酵母，从斜面培养基上分别接到液体察氏和YEPD培养基中，在28℃下静置培养3天，得到菌液。4)接种：根据茶叶含水量计算出含水量达到35％所需的水量。500mL三角瓶装含水量35％的青茶100g。5)培养：根据普洱茶自然发酵温度变化的特点，采用逐渐升温的方式进行培养。6)试验结果理化结果：实验茶多酚茶褐素水浸咖啡碱J121.712.7540.233.74J27.7715.4539.014.43J36.4516.3539.094.28J48.0013.9241.644.08J57.1921.0945.264.64J66.7217.3443.254.46J77.9516.9745.034.28J87.0916.7239.424.25J95.4216.3142.004.38评审结果：(根据GBT23776-2009茶叶感官审评方法指标进行)的理化和评审结果可以看出J5号试验的茶褐素和水浸出物最多，所以选用J5号的菌种比例为最佳组合。实施例1：1)样品：大益普洱茶饼2)分离菌种：取1g茶饼放入装有100mL无菌水的250mL三角瓶中，用无菌水稀释制成10-3～10-8倍微生物稀释液，分别涂布于盛有PDA，YEPD，察氏和肉汤固体培养基的培养皿中，在28～35℃培养24天，得到100个左右单菌落的培养皿；将单菌落不断的接到新的培养基中，重复这个过程2～4次，最后将单菌落接到其各自对应的斜面培养基中，保存备用。3)菌种鉴定：提取样品的总DNA；以待测样品的总DNA为模板，在专用引物——第一步扩增采用的引物为GeoA2：5′-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3′和Geo11：5′-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3′；第二步扩增采用的引物为：NS31-GC：5’-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3’和Glol：5’-GCCTGCTTTAAACACTCTA-3’的引导下进行PCR扩增，扩增结束后，对目的片段进行回收及纯化；PCR扩增条件为巢式PCR扩增：先加入扩增18SrDNA全长的引物和反应体系进行第一步扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4min，然后在94℃变性45s，50℃-55℃引物复性45s，72℃引物延伸1.5min，循环30次，72℃终延伸10min，取其产物进行100倍稀释后作为模板，以18SrDNA为目标进行扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4min，然后在94℃变性45s，50-55℃引物复性45s，72℃引物延伸1min，循环30-35次，72℃终延伸10min。对目的片段进行变性梯度凝胶电泳，sybrgreen染色后得到DGGE指纹图谱；回收优势条带，并以此为模板，用上游引物GeoA2：5′-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3′和；下游引物Geo11：5′-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3′，组成的专用引物的引导下进行PCR扩增，扩增结束后，对目的片段进行回收、纯化及测序；对测序结果进行序列比对分析，选出优势微生物，进一步选出最优势微生物，然后将样品平板分离，鉴定，确定优势菌株。4)原料：采用云南大叶种晒青毛茶5)种子：将本发明最优势微生物普通青霉，黑曲霉，皱褶假丝酵母，从斜面培养基上分别接到液体察氏和YEPD培养基中，在28℃下静置培养3天，得到菌液。6)接种：根据茶叶含水量计算出35％的所需水量，将培养好的菌液和水混合后，以最优势微生物在青茶原料中的重量百分比为普通青霉0.08％，黑曲霉0.08％，皱褶假丝酵母0.3％向青茶原料中添加最优势微生物，均匀的喷淋到茶叶表面，喷淋过程中不断搅拌茶叶，使接种均匀，湿度均匀。7)入堆：接种后将其装入带有透气孔的箱体中，堆高达1m。放置到通风良好的操作间内进行发酵。将温度计查到距箱体底部10～15cm处，进行温度监控。8)翻堆：第一次翻堆的依据是底层温度有3个点的温度达到53℃，2个点54℃，1个点55℃，翻堆时间为发酵第6天，含水量为32％，不进行补水；第二次翻堆的依据是底层温度有3个点的温度达到61℃，2个点63℃，1个点64℃，翻堆时间为发酵第11天，含水量为27％，进行补水；第三次翻堆的依据是底层温度有3个点的温度达到62℃，2个点63℃，1个点66℃，翻堆时间为发酵第16天，含水量为26％，进行补水；第四次翻堆的依据是底层温度有3个点的温度达到60℃，2个点62℃，1个点64℃，翻堆时间为发酵第20天；共翻堆四次。最后一次翻堆后不再进行补水，直到发酵23天结束。9)出堆：将出堆后的茶叶散开，平铺到无菌袋上进行干燥。然后取样进行理化参数的检测和品评。10)理化参数：茶多酚达7.2％，水浸出物达38.6％。11)品评结果：汤色红褐透亮，滋味醇厚回甘，有陈香味。叶底呈生褐色且颜色均匀。实施例2：1)样品：云南天士力发酵茶2)分离菌种：取1g茶饼放入装有100mL无菌水的250mL三角瓶中，用无菌水稀释制成10-3～10-8倍微生物稀释液，分别涂布于盛有PDA，YEPD，察氏和肉汤固体培养基的培养皿中，在28～35℃培养24天，得到100个左右单菌落的培养皿；将单菌落不断的接到新的培养基中，重复这个过程2～4次，最后将单菌落接到其各自对应的斜面培养基中，保存备用。12)菌种鉴定：提取样品的总DNA；以待测样品的总DNA为模板，在专用引物——第一步扩增采用的引物为GeoA2：5′-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3′和Geo11：5′-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3′；第二步扩增采用的引物为：NS31-GC：5’-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3’和Glol：5’-GCCTGCTTTAAACACTCTA-3’的引导下进行PCR扩增，扩增结束后，对目的片段进行回收及纯化；PCR扩增条件为巢式PCR扩增：先加入扩增18SrDNA全长的引物和反应体系进行第一步扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4min，然后在94℃变性45s，50℃-55℃引物复性45s，72℃引物延伸1.5min，循环30次，72℃终延伸10min，取其产物进行100倍稀释后作为模板，以18SrDNA为目标进行扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4min，然后在94℃变性45s，50-55℃引物复性45s，72℃引物延伸1min，循环30-35次，72℃终延伸10min。对目的片段进行变性梯度凝胶电泳，sybrgreen染色后得到DGGE指纹图谱；回收优势条带，并以此为模板，用上游引物GeoA2：5′-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3′和；下游引物Geo11：5′-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3′，组成的专用引物的引导下进行PCR扩增，扩增结束后，对目的片段进行回收、纯化及测序；对测序结果进行序列比对分析，选出优势微生物，进一步选出最优势微生物，然后将样品平板分离，鉴定，确定优势菌株。3)原料：采用云南大叶种晒青毛茶4)种子：将本发明最优势微生物普通青霉，黑曲霉，皱褶假丝酵母，从斜面培养基上分别接到液体察氏和YEPD培养基中，在28℃下静置培养3天，得到菌液。5)接种：根据茶叶含水量计算出35％的所需水量，将培养好的菌液和水混合后，以最优势微生物在青茶原料中的重量百分比为普通青霉0.08％，黑曲霉0.08％，皱褶假丝酵母0.3％向青茶原料中添加最优势微生物，均匀的喷淋到茶叶表面，喷淋过程中不断搅拌茶叶，使接种均匀，湿度均匀。6)入堆：接种后将其装入带有透气孔的箱体中，堆高达1m。放置到通风良好的操作间内进行发酵。将温度计查到距箱体底部10～15cm处，进行温度监控。7)翻堆：第一次翻堆的依据是底层温度有3个点的温度达到53℃，2个点54℃，1个点55℃，翻堆时间为发酵第6天，含水量为32％，不进行补水；第二次翻堆的依据是底层温度有3个点的温度达到61℃，2个点63℃，1个点64℃，翻堆时间为发酵第11天，含水量为27％，进行补水；第三次翻堆的依据是底层温度有3个点的温度达到62℃，2个点63℃，1个点66℃，翻堆时间为发酵第16天，含水量为26％，进行补水；第四次翻堆的依据是底层温度有3个点的温度达到60℃，2个点62℃，1个点64℃，翻堆时间为发酵第20天；共翻堆四次。最后一次翻堆后不再进行补水，直到发酵23天结束。8)出堆：将出堆后的茶叶散开，平铺到无菌袋上进行干燥。然后取样进行理化参数的检测和品评。9)理化参数：茶多酚达8.3％，水浸出物达41.5％。品评结果：汤色红褐透亮，滋味醇厚回甘，有陈香味。叶底呈生褐色且颜色均匀。13)试剂来源：分子引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。其余所用试剂均来自天津联星生物科技有限公司。实施例31))向含水量为30％的青茶原料中接入重量百分比为0.1％的普通青霉，0.08％的黑曲霉，0.2％的皱褶假丝酵母进行发酵；2)根据温度的变化进行翻堆，并对水分进行控制，第一次翻堆的依据是底层温度达到55℃；以后每次的翻堆依据是底层温度达到63℃，翻堆6次。每次翻堆时取样检测水分，当水份含量为25％时，补充水份含量到35％，最后一次翻堆后不补水，通风阴凉处干燥，除湿得到普洱茶熟茶。实施例41))向含水量为40％的青茶原料中接入重量百分比为0.08％的普通青霉，0.1％的黑曲霉，0.2-％的皱褶假丝酵母进行发酵；2)根据温度的变化进行翻堆，并对水分进行控制，第一次翻堆的依据是底层温度达到52℃；以后每次的翻堆依据是底层温度达到60℃，翻堆3次。每次翻堆时取样检测水分，当水份含量28％时，补充水份含量到33％，最后一次翻堆后不补水，通风阴凉处干燥，除湿得到普洱茶熟茶。实施例51))向含水量为35％的青茶原料中接入重量百分比为0.09％的普通青霉，0.09％的黑曲霉，0.25％的皱褶假丝酵母进行发酵；2)根据温度的变化进行翻堆，并对水分进行控制，第一次翻堆的依据是底层温度达到53℃；以后每次的翻堆依据是底层温度达到62℃，翻堆4次。每次翻堆时取样检测水分，当水份含量为26％时，补充水份含量到34％，最后一次翻堆后不补水，通风阴凉处干燥，除湿得到普洱茶熟茶。实施例61)向含水量为35％的青茶原料中接入重量百分比为0.08％的普通青霉，0.08％的黑曲霉，0.3％的皱褶假丝酵母进行发酵；2)根据温度的变化进行翻堆，并对水分进行控制，第一次翻堆的依据是底层平均温度达到53℃；以后每次的翻堆依据是底层平均温度达到62℃，共翻堆4次。每次翻堆时取样检测水分，当水份含量为25-28％时，补充水份含量到33％-35％，最后一次翻堆后不补水，通风阴凉处干燥，除湿得到普洱茶熟茶。当前第1页1 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