专利名称：一种微生物转化生产α-熊果苷的工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于生物、医药技术领域，涉及一种以黑曲霉菌株转化生产α-熊果苷的方法。特别提供一株人工驯化的黑曲霉菌株，以及用该菌株在发酵罐中发酵转化α-熊果苷的工艺。
背景技术：
熊果苷(arbutin)是从多种属植物中可分离得到的天然活性物质，天然提取物中含的是β -熊果苷。Kazuhisa等人研究发现α -熊果苷的美白效果是β _熊果苷的10倍以上，并且强于目前其他美白活成分，有效性和安全性均较熊果苷高。熊果苷已基本上实现了化学合成生产，由于α -熊果苷的化学合成具有较大难度，易形成α -熊果苷和 β -熊果苷混合物，难以分离，因此α -熊果苷更倾向用微生物或酶合成，而现在世界范围内只有日本江琦糖业公司实现了 α-熊果苷的酶合成。在国内刘春巧尝试进行α-熊果苷生物合成研究，但效率不高，难以实现工业化生产。随着人们对于α -熊果苷的研究的不断深入，α _熊果苷作为安全高效美白剂必将在国际化妆品中占有极其重要的地位，有着广阔的应用前景。而本课题的研究正是从酶合成的角度开展α -熊果苷的生产工艺研究，为我国生产医药化妆品市场所需的生物源的高纯度α-熊果苷提供较好的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种以黑曲霉菌株转化生产α-熊果苷的方法。为了简便、 高效、规模化发酵制备α -熊果苷，本发明提供的转化微生物是一株人工驯化的黑曲霉菌株。在本发明生物转化生产α -熊果苷的方法中，黑曲霉菌株经过长时间的驯化培养后，可在PDA培养基、察氏培养基、虎红培养基上生长。在本发明生物转化生产α-熊果苷的方法中，对苯二酚的投料量比例为0. 1 2% (w/v)，麦芽糖的投料量比例为2 5% (w/v)发酵温度25 40°C，通气比0. 1 10 (ν/ν)， 搅拌速率120 500r/min，发酵时间IOOh 200h。产物提取过程中添加1 5% (w/v)的 Amberlite XAD 16大孔吸附树脂，25 40°C处理2h。在本发明黑曲霉菌株发酵生物转化生产α-熊果苷的方法中，可以通过全自动发酵罐发酵生物转化生产α-熊果苷，经过柱层析分离后得到α-熊果苷的单体。本发明中采用的黑曲霉菌株转化效率更高，并易于大规模生产，将具有很好的工业化应用价值。
具体实施例方式在本发明实施例中所用的黑曲霉菌株发酵生物转化生产α-熊果苷的方法中发酵步骤是在发酵罐中接种培养IOh后，调整通气比0.1 2% (ν/ν)；之后根据对苯二酚的动态监测，将发酵温度调整为25 40°C，pH 4 6，搅拌速率250r/min。产物收集步骤为 在发酵罐中添加1 5% (w/v)的Amberlite XAD 16大孔吸附树脂，25 40°C、250r/ min处理2h。发酵液经过固液分离所得菌丝体和大孔吸附树脂在乙醇中超声提取6h。提取液减压蒸去乙醇，经正相与反相硅胶色谱分离、减压浓缩、结晶、干燥后获得纯度大于98% α-熊果苷产品。实施例1将黑曲霉从PDA斜面转接到PDA种子培养基中，28°C培养12h ；然后接种到含有 200g对苯二酚(98%含量)的20LPDA培养基中，在30L发酵罐中28°C进行发酵。36h后调整提高通气比为1 3卜八)，搅拌速率调整为4001·/!^!!。48h后调整发酵温度至42°C，5% (w/v)氨水动态调整pH = 5.0。60h发酵结束，按5% (w/v)加入Amberlite XAD 16大孔吸附树脂，搅拌处理2h后放罐。发酵液经滤布过滤得湿重429g沉淀物，用30L乙醇(95% ) 超声提取2h并滤布过滤，滤渣再用IL乙醇(95% )洗涤5次。乙醇提取液减压浓缩干后得粗提取物1416. 6g，经过硅胶与反相硅胶柱层析分离、减压浓缩、结晶、干燥后获得α -熊果苷白色粉末143. 28g，经过HPLC检测纯度为98.01%,摩尔转化率78. 11 %。实施例2将黑曲霉菌株从察氏培养基斜面转接到察氏种子培养基中，28°C培养12h;然后接种到含有200g对苯二酚(98%含量)的察氏培养基中，在30L发酵罐中28°C进行发酵。 36h后调整提高通气比为1 2，搅拌速率调整为350r/min。48h后调整发酵温度至38°C， 5% (w/v)氨水动态调整pH = 5. 0。60h发酵结束，按(w/v)加入Amberlite XAD 16 大孔吸附树脂，搅拌处理4h后放罐。发酵液经滤布过滤得湿重1623g沉淀物，用20L乙醇 (95%)超声提取2h并滤布过滤，滤渣再用IL乙醇(95%)洗涤3次。乙醇提取液减压浓缩干后得粗提取758. 4g，经过硅胶与反相硅胶柱层析分离、减压浓缩、真空干燥后获得α -熊果苷白色粉末152. 39g，经过HPLC检测睾酮纯度为98. 32%，摩尔转化率83. 34%。
权利要求
1.一种黑曲霉生物转化生产α-熊果苷的方法。
2.一种用权利要求1所述菌株发酵生物转化生产α-熊果苷的方法。 其特征在于(1)所述培养基为PDA或察氏液体培养基。(2)培养基中黄体酮投料量比例为0.1 2% (w/v)；发酵温度18 50°C，0. 1 35% (w/v)氨水动态调节pH= 2 8，通气比0. 1 10卜八)，搅拌速率10 90017/!^11，发酵时间 20h 240h。(3)在产物提取过程中添加0.1 30% (w/v)的Amberlite XAD-16或DlOl大孔吸附树脂，18-50°C处理Ih 10h。发酵液经过固液分离所得菌丝体和大孔吸附树脂在乙醇中超声提取Ih 24h。(4)黑曲霉菌株发酵对苯二酚，得到α-熊果苷。
全文摘要
一种以黑曲霉菌株转化生产α-熊果苷的方法。培养基选用PDA和察氏培养基。对苯二酚的投料量比例为0.1～2％(w/v)，麦芽糖的投料量比例为2～5％(w/v)；发酵温度25～40℃，通气比0.1～10(v/v)，搅拌速率120～500r/min，发酵时间100h～200h。产物提取过程中添加1～5％(w/v)的Amberlite XAD～16大孔吸附树脂，25～40℃处理2h。本发明为规模化发酵生产α-熊果苷提供一株性状稳定、培养基简单、生长良好的黑曲霉菌株、实用简便的发酵罐发酵及分离提取工艺。用该菌株及该工艺来规模制α-熊果苷，生产成本低、杂质少，产物得率高。
文档编号C12R1/685GK102329838SQ201110336430
公开日2012年1月25日 申请日期2011年10月31日 优先权日2011年10月31日
发明者杜刚, 杨海英 申请人:杜刚