专利名称：交替假单胞菌b3及其在生物氧化l-氨基酸中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种产L-氨基酸氧化酶的新菌株，特别涉及交替假单胞菌B3及其在生物氧化L-氨基酸中的应用。
背景技术：
L-氨基酸氧化酶(L-amino acid oxidase，简称 LAA0，酶学编号为EC1. 4. 3. 2)是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅基的黄素蛋白酶。此酶能够特异性催化L-氨基酸的氧化脱氨生成α-酮酸、氨和过氧化氢。因此，它能被应用于生物氧化L-氨基酸。近年来有文献报道了 LAAO具有与血小板相互作用、细胞毒性及诱导细胞凋亡的作用。还报道它具有出血或溶血活性、引起水肿及抗菌、抗艾滋病病毒(张云等.蛇毒L-氨基酸氧化酶在制备艾滋病治疗药物中的应用.申请号03117417. 5.申请日2004-09-08.)等特性。LAAO 在抗菌、杀病原虫、抗肿瘤及抗艾滋病病毒等领域具有极其广阔的应用前景。LAAO被发现广泛存在于微生物、蛇毒、鱼的表皮粘液、老鼠、海兔子等多种生物体中。到目前为止，来源于不同物种的一些LAAO已经被成功分离、纯化及鉴定，酶活性、底物特性、酶稳定性等理化性质被研究，一些LAAO的基因序列已被测定和公布。相关研究表明， 来源于不同物种的目前已知的LAAO在细胞内均是由两个非共价的亚基组成的二聚体，分子量大约为120kDa，每个亚基的分子量约为60kDa，是一种需要FAD为辅基的含糖基化位点的蛋白；LAAO的抗菌等生物活性中大部分与LAAO催化产生过氧化氢具有直接或间接的联系，过氧化氢酶能抑制LAAO的抗菌等生物活性，不过，研究表明，LAAO是被分泌到细胞外， 这就便于将LAAO分离纯化。已有来源于鱼的表皮粘液的LAAO被成功在大肠杆菌中克隆表达，并且，已有来源于蛇毒的LAAO被初步结晶。这些都给深入开展LMO的相关研究提供了坚实基础和理论指导。同时，国内外的研究表明，不同物种来源的LAAO的底物特异性和最适性差异较大。有些LAAO能作用于几种甚至几十种氨基酸，像国外文献报道的浑浊红球菌 LAA0，它不仅能催化二十种L-氨基酸，而且也能催化它们的一些衍生物；但有些只能作用于一种氨基酸，像海默氏菌LAAO仅能严格地作用于L-赖氨酸。某些物种既含有底物特异性宽的LAA0，同时还含有底物特异性窄的LAA0。许多LAAO对疏水性和中性氨基酸的催化活性比较高，而有些LAAO对其他类型的氨基酸活性较高。L-氨基酸被LAAO催化氧化后生成对应的α-酮酸是重要的有机合成与生物合成的中间体，在食品、医药和化工等行业有重要应用前景。虽然，国外对LAAO已有三、四十年的研究，对来源于微生物、蛇毒、鱼的表皮粘液等不同LAAO均有涉猎，但相关报道还不是特别多，研究主要集中在蛇毒来源的LAA0。 国内对LAAO的研究只有十多年的时间，仅有对来源于蛇毒的LAAO有所研究，对来源于其它物种的未见报道，而且，国内对利用微生物源LAAO进行生物氧化L-氨基酸也未见报道。
发明内容
本发明目的是提供一种产L-氨基酸氧化酶的新菌株一一交替假单胞菌Β3，以及所述菌株在氧化L-氨基酸中的应用，具有底物光谱，反应温和，环境友好等特点。
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本发明采用的技术方案是交替假单胞菌B3 (Pseudoalteromonas sp. B3)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为=CGMCC NO. 5353，保藏日期为2011年10月17日。本发明所述交替假单胞菌B3菌种的筛选与鉴定a)菌种筛选(1)菌种来源从浙江宁波定海海域(30.03° N，122. 11° E)的海泥中分离筛选
获得；(2)菌种筛选从宁波定海海域(30.03° Ν，122.1Γ Ε)海平面50cm以下收集海泥，置于无菌的样品瓶中带至实验室，然后称取IOg海泥样品，加入到90mL的无菌海水中，混勻后即是浓度为KT1的样品，然后按常规方法分别梯度稀释成浓度为10_2、10_3、10_4、 10_5、10_6的样品；分别取不同浓度的样品100 μ L涂布于匪固体培养基(酵母膏3g/L，蛋白胨5g/L，海盐30g/L，琼脂20g/L;pH 7. 2，溶剂为水)平板上，于下培养4d，获得单菌落；然后将初筛获得的单菌落在MM固体培养基(酵母膏3g/L，蛋白胨5g/L，海盐30g/L，琼脂20g/L ；pH 7. 2，溶剂为水)平板上进行两次划线复筛；然后将复筛后获得的单菌落分别接种于5mL的匪液体培养基(酵母膏3g/L，蛋白胨5g/L，海盐30g/L ；pH 7. 2，溶剂为水) 中，于，200rpm转速下摇床培养4d，8000rpm离心5min收集发酵上清液；取3mL发酵上清液作为酶液，与150mmol/L的L-苯丙氨酸(L-Phe)反应，用过氧化氢检测试剂盒(Amplex Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay kit, Invitrogen, USA)检测过氧化氧产生情况，发现交替假单胞菌B3能使过氧化氢检测试剂发生颜色反应，说明交替假单胞菌B3能催化氧化L-苯丙氨酸而释放出过氧化氢，从而说明交替假单胞菌B3能产生L-氨基酸氧化酶 (LAAO)。(3)菌株形态特征和生理生化特征所述的交替假单胞菌B3形态特征为短小杆菌，直径Ι.Ομπι，长培养 24h后，菌落为点状、圆形、湿润；革兰氏阴性，生理生化特征见表1所示表1菌株B3的生理生化特性(表中“ + ”为阳性，“-”为阴性)
权利要求
1.交替假单胞菌B3(Pseudoalteromonas sp. B3)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所， 菌种保藏号为=CGMCC NO. 5353，保藏日期为2011年10月17日。
2.如权利要求1所述的交替假单胞菌B3，其特征在于所述的交替假单胞菌B3的16S rDNA序列为AGTCGAGCGGTAACATTTCTAGCTTGCTAGAAGATGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTGGGAACAT GCCTTTAGGTGGGGGACAACCATTGGAAACGATGGCTAATACCGCATAATGTCTACGGACCAAAGGGGGCTTCGGCT CTCGCCTTTAGATTGGCCCAAGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGG TTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGC ACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTCAGG AGGAAAGGTTAGTAGTTAATACCTGCTAGCTGTGACGTTACTGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAG CCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTACGCAGGCGGTTGATTAAGCGAG ATGTGAAAGCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTTCGAACTGGTCAACTAGAGTGTGATAGAGGGTGGTAGAATT TCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAACACTGACG CTCATGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTAGGAG CTGGGGTCTTCGGACAACTTTTCCAAAGCTAACGCATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAAC TCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTA CACTTGACATACAGAGAACTTACCAGAGATGGTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCG TCAGCTCGTGTTGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTAGTTGCCAGCGATTCGGTC GGGAACTCTAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGTGT AGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAGAGTGCTGCGAACTAGCGATAGTAAGCGAATCACTTAAAGTATGT CGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGT GAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTGGATAGCTTAACC TTCGGGAGGGCGTCA。
3.如权利要求1所述的交替假单胞菌B3在生物氧化L-氨基酸中的应用。
4.如权利要求3所述的交替假单胞菌B3在生物氧化L-氨基酸中的应用，其特征在于所述的应用为以交替假单胞菌B3发酵培养获得的酶为酶源，以L-氨基酸为底物，25 50°C，pH 6 8，反应0.5 池，使L-氨基酸氧化，释放出过氧化氢。
5.如权利要求4所述的交替假单胞菌B3在生物氧化L-氨基酸中的应用，其特征在于所述酶源为交替假单胞菌B3发酵培养后获得的含湿菌体发酵液离心弃去沉淀后获得的上清液，所述L-氨基酸浓度为30 300mmol/L，所述上清液用量以含湿菌体发酵液中湿菌体质量计为0. 04 0. 8mg湿菌体/mmol底物。
6 如权利要求4所述的交替假单胞菌B3在生物氧化L-氨基酸中的应用，其特征在于所述的L-氨基酸为L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-酪氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-甲硫氨酸、L-胱氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸或L-半胱氨酸。
7.如权利要求4所述的交替假单胞菌B3在生物氧化L-氨基酸中的应用，其特征在于所述的酶源按如下步骤制备(1)斜面培养将交替假单胞菌B3接种于斜面培养基，20 37°C培养12 Mh，获得斜面菌体，所述斜面培养基终浓度组成为酵母膏1. 5 6g/L，蛋白胨2. 5 10g/L，海盐15 45g/L，琼脂15 25g/L，pH 7 8，溶剂为水；(2)种子培养从斜面菌体挑取一接种环菌株接种至种子培养基，20 37°C培养18 Mh，获得种子液，所述种子培养基终浓度组成为酵母膏1. 5 6g/L，蛋白胨2. 5 10g/L，海盐15 45g/L， PH 7 8，溶剂为水；(3)发酵培养将种子液以1 10%的接种量接种至发酵培养基，20 37°C培养48 120h，获得发酵液，将发酵液离心，弃去沉淀，收集上清液，获得所述酶源，所述发酵培养基终浓度组成为酵母膏1. 5 6g/L，蛋白胨2. 5 10g/L，海盐15 45g/L， PH 7 8，溶剂为水。
8.如权利要求4所述的交替假单胞菌B3在生物氧化L-氨基酸中的应用，其特征在于所述的应用为以交替假单胞菌B3发酵培养后的含湿菌体发酵液离心获得的上清液为酶源，以L-氨基酸为底物，30°C，pH 7.0，反应0. ，使L-氨基酸氧化释放出过氧化氢；所述交替假单胞菌B3发酵液中湿菌体浓度为10 25mg/L，所述L-氨基酸底物浓度为30 300mmol/L,所述上清液用量以含湿菌体发酵液中湿菌体质量计为0. 08 0. Smg湿菌体/ mmol底物。
全文摘要
本发明公开了一种交替假单胞菌B3(Pseudoalteromonas sp.B3)及其在生物氧化L-氨基酸中的应用，所述应用为以交替假单胞菌B3发酵培养获得的酶为酶源，以L-氨基酸为底物，25～50℃，pH 6～8，反应0.5～2h，使L-氨基酸氧化，释放出过氧化氢，本发明提供了一株新的产L-氨基酸氧化酶的微生物菌种，该菌种能生物氧化L-氨基酸，并具有底物广谱、反应温和、对环境友好等特点，在L-氨基酸的定量分析、DL-氨基酸拆分等方面具有广阔的应用前景。
文档编号C12Q1/26GK102367430SQ201110336029
公开日2012年3月7日 申请日期2011年10月28日 优先权日2011年10月28日
发明者乔华, 余志良, 裘娟萍 申请人:浙江工业大学