用于产量增加的方法中的重组体微生物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及能够产生所需发酵产物、在微生物中功能性表达异源肽的重组体微生 物、和其中利用所述微生物的产生发酵产物的方法。在一种优选的实施方式中，所述微生物 为酵母。本发明进一步涉及CO2在微生物中的应用。
【背景技术】
[0002] 微生物发酵工艺被应用于广泛且迅速扩展范围的来自可回收利用的碳水化合物 进料的化合物的工业生产中。
[0003] 尤其是在厌氧发酵过程中，辅因子组NADH/NAD+的氧化还原平衡能够引起对产量 的重要限制。这一挑战的例证是在例如通过酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)生产 颜料乙醇的工业生产中作为主要副产物形成的甘油，其是需要再氧化在生物合成反应中形 成的NADH的直接后果。
[0004] 通过酿酒酵母生产乙醇目前是工业生物技术中的（以体积计）单次最大发酵工 艺，而其他化合物（包括其他醇类、羧酸、类异戊二烯、氨基酸等）目前是以工业生物技术工 艺生产的。
[0005] 已经提出了多种方法通过基因修饰来改善工业生物技术中生物体的发酵性质。
[0006] WO 2008/028019涉及利用具有至少一个异源的基因序列的微生物来形成发酵产 物的方法，该方法包括使至少一种碳水化合物转化为3-磷酸甘油酯以及固定二氧化碳的 步骤，其中所述步骤中的至少之一是由至少一种外源酶催化的。此外，其还涉及用于通过至 少一种糖的发酵来形成发酵产物的微生物，该微生物包含编码选自由磷酸戊糖表异构酶、 磷酸核酮糖激酶和核酮糖二磷酸羧化酶组成的组中的至少一种酶的至少一个异源基因序 列。
[0007] 在一个实例中提到了其中结合了异源PRK和异源Rubisco基因的酵母。在一种实 施方式中，酵母被用于乙醇生产。结果（图24)示出了转基因对照和经修饰菌株的浓度。在 经修饰的酵母和其相应对照物之间几乎没有可注意到的差异。没有关于产物产量，糖转化， 酵母生长、乙醇的蒸发速率的明显信息。因此，显然结果并不能得出关于乙醇产量得到改善 的结论。
[0008] 此外，WO 2008/028019中没有提到甘油副产物形成的问题。
[0009] 关于基于酵母生产乙醇以及其他化合物的化学计量的主要挑战在于，NADH-依赖 性副产品（尤其是甘油）的实际量通常作为副产物形成，尤其是在厌氧和氧受限条件下或 在呼吸作用受到抑制或不存的条件下。已经估计在常规的工业遗传工艺中，高达约4wt. % 的糖进料被转化为甘油（Nissen等人，Yeast 16(2000)463-474)。在对于厌氧生长是理想 的条件下，向甘油的转化甚至会更高，高达约10%。
[0010] 在厌氧条件下生产甘油主要与氧化还原代谢有关。在酿酒酵母的厌氧生长过程 中，糖异化作用经由酒精发酵而发生。在该过程中，在糖酵解的3-磷酸甘油醛脱氢酶反 应中形成的NADH通过NAD+-依赖性醇脱氢酶将丙酮酸酯脱羧形成的乙醛再氧化为乙醇。 当代谢的其他地方发生NAD+向NADH的净还原时，这种中性条件下氧化还原的异化途径 (redox-neutral dissimilatory pathway)的固定的化学计量导致一些问题。在厌氧条件 下，酿酒酵母中的NADH再次氧化严格依赖于糖还原为甘油。甘油形成是通过糖酵解中间体 磷酸二羟丙酮（DHAP)还原为甘油3-磷酸（甘油-3P)开始的，这个反应由NAD+-依赖性甘 油3-磷酸脱氢酶催化。随后，通过甘油-3-磷酸酶来水解在该反应中形成的甘油3-磷酸 以产生甘油和无机磷酸盐。因此，在通过酿酒酵母厌氧生产乙醇的过程中甘油是主要的副 产物，其是不希望的因为其降低了糖向乙醇的总体转化。此外，乙醇生产车间的废水中甘油 的存在会增加废水处理的成本。
[0011] 在WO 2011/010923中，通过提供包含编码NAD+-依赖性乙酰化乙醛脱氢酶 (EC1. 2. 1. 10)活性的一种或多种重组体核酸序列的重组酵母细胞在由含碳水化合物进料 (尤其是来自木质纤维素生物质的碳水化合物进料）生产乙醇的过重形成NADH-相关的副 产物（甘油）的甘油副产品问题，所述细胞缺少NADH-依赖性甘油合成所需的酶活或者相 比于野生型酵母细胞该细胞在NADH-依赖性甘油合成方面具有降低的酶活性。细胞被描述 为在实质上降低甘油生产方面是有效的。而且，该细胞使用乙酸盐以再氧化NADH，从而在使 用含乙酸盐进料时能够增加乙醇产量。
[0012] 尽管WO 2011/010923中描述的方法是有利的，但对于其变型仍存在持续的需要， 尤其是也能够生产有用的有机化合物（例如乙醇）而不需要乙酸盐或其他有机电子接受体 分子以消除或至少降低NADH-依赖性副产物合成的变型。尤其是合乎需要的是提供一种微 生物，其中减少了 NADH-依赖性副产物合成并且能够增加产物产量并且不存在乙酸盐。
【发明内容】
[0013] 发明人认识到利用二氧化碳作为底物通过在异养、化养微生物细胞，尤其是酵母 细胞中功能性表达重组体酶来减少或者甚至消除NADH-依赖性副产物合成是可能的。
[0014] 因此，本发明涉及二氧化碳作为电子接受体在重组体化异养微生物，尤其是真核 微生物中的应用。化养、（化）异养和自养和其他分类的微生物在本文中涉及重组前的微 生物，该生物体在本文中也被称为宿主。例如，因为本文中所披露的应用使得重组的生物体 可以同化二氧化碳从而导致（部分）（化）自养作用，因此通过如本文中所披露的重组原来 为（化）异养和非自养的宿主微生物在重组之后可变成自养的。
[0015] 有利的是，发明人已经发现了合并二氧化碳在异养生物微生物的代谢工程中作为 辅助底物以用于改善产物产率和/或减少副产物形成的方式。
[0016] 尤其是，发明人发现，通过功能性表达来自真核微生物（尤其是酵母细胞）的两个 特定组的中至少两种重组体酶来减少或甚至消除NADH-依赖性副产物合成是可能的，其中 的一种酶对话其中利用二氧化碳的反应而另一种酶利用ATP作为辅因子。
[0017] 因此，本发明进一步涉及重组体，尤其是转基因真核微生物，尤其是酵母细胞，所 述微生物功能性表达一种或多种重组体，尤其是编码1，5-二磷酸核酮糖羧化酶加氧酶 (Rubisco)和磷酸核酮糖激酶（PRK)的异源核酸序列。
[0018] 已经发现根据本发明的微生物尤其具有优势，因为在Rubisco和PRK的存在下， NADH-依赖性副产物形成（甘油）显著减少或基本上被完全消除并且期望产物的生产增加。 这被认为是二氧化碳起到了 NADH的电子接受体的作用，从而少量的NADH可用于朝向生成 畐Ij产物（例如甘油）的反应。
[0019] 本发明进一步涉及用于制备有机化合物的方法，尤其是醇、有机酸或氨基酸，该方 法包括利用微生物使碳源，尤其是碳水化合物或另外的有机碳源转化形成有机化合物，其 中该微生物是根据本发明的微生物或其中在重组体化养或化异养微生物中二氧化碳被用 作电子接受体。
[0020] 本发明进一步涉及用于在酵母细胞中功能性表达异源多肽的载体，其中所述载体 包含编码Rubisco和PRK的异源核酸序列，其中所述Rubisco表现出固碳活性，除非另外具 体提及，在本文中使用的术语"一个"或" 一种"被定义为"至少一个/ 一种"。
【具体实施方式】
[0021] 当提到单数形式的名词（例如，化合物、添加剂等）时，意味着复数形式也包括在 内。因此，除非另外具体提及，当提到具体的部分时，例如"化合物"，其意指该部分的"至少 一个/ 一种"，例如"至少一种化合物"。
[0022] 如在本文中使用的术语"或"应被理解为"和/或"。
[0023] 当提到存在若干异构体（例如D和L对映异构体）的化合物时，原则上该化合物 包括可用于本发明的特定方法中的该化合物的所有对映异构体、非对映异构体和顺/反异 构体，尤其是当提到例如化合物时，其包括（一种或多种）天然异构体。
[0024] 出于清楚和简要描述的目的，本文中作为相同或单独实施方式的部分来描述特 征，然而，优选本发明的范围可以包括具有所有或一些所述特征的组合的实施方式。在本文 中，对于本领域技术人员而言，如所提交的权利要求1的变体可与所提交的申请中描述的 其他特征进行组合，尤其是与从属权利要求中的特征进行组合，例如那些通常涉及本发明 的最优选实施方式的权利要求。
[0025] 本文中使用的术语"发酵""、"发酵的"等具有经典的含义，即，其表示在厌氧条 件下或已经在厌氧条件下进行的工艺。厌氧条件在本文中被定义为不具有任何氧的条件 或在该条件下酵母细胞（尤其是酵母细胞）基本上不消耗氧，并且通常对应于耗氧量小于 5mmol/l. h，尤其是对应于耗氧量小于2. 5mmol/l. h，或更低于lmmol/1. h。更优选地，消耗 Ommol/L/h (即，耗氧量不可检出）。这通常对应于培养物肉汤中的溶解氧浓度小于空气饱 和的5%，尤其是溶解氧浓度小于空气饱和的1%，或更低于空气饱和的0. 2%。
[0026] 术语"酵母"或"酵母细胞"是指系统发生差异较大的一组单细胞真菌，其中的大 多数为子囊菌门（Ascomycota)和担子菌亚门（Basidiomycota)的分支。芽酵母（"真酵 母（true yeasts)"）被分在酵母菌目（Saccharomycetales)，其中酿酒酵母是最为熟知的 物种。
[0027] 如本文中使用术语"重组体（细胞）"或"重组体微生物"是指含有作为利用重组 体DNA技术和/或另外的突变技术的一种或多种基因修饰的结果的核酸的菌株（细胞）。 尤其是重组体细胞可以包含相应的野生型细胞中不存在的核酸，该已利用重组体DNA技术 (转基因细胞）将该核酸被引入到菌株（细胞）中，或所述野生型中不存在的核酸是所述野 生型（例如编码野生型多肽的基因）存在的核酸序列的一种或多种突变的结果（例如利用 重组体DNA技术和/或另外的突变技术），或其中基因的核酸序列已被修饰为使该多肽产 物（编码其）靶向于另外的细胞腔隙。此外，术语"重组体（细胞）"尤其涉及已利用重组 体DNA技术将来自其的DNA序列除去的菌株（细胞）。
[0028] 如本文中使用的术语"转基因（酵母）细胞"是指含有该菌株（细胞）中非天然 存在的核酸，并且其已经利用重组体DNA技术白引入到该菌株（细胞）中的菌株（细胞）， 艮P，重组体细胞。
[0029] 如本文中使用的涉及蛋白质或多肽的术语"突变的"意指野生型或天然存在的 蛋白质或多肽序列中的至少一个氨基酸已经由编码这些氨基酸的核酸的突变发生而被不 同氨基酸替代、插入或从该序列删除。突变发生是本领域公知的方法，并且包括例如，通 过PCR的方式或经由寡核苷酸-介导的突变发生进行的定点突变发生，如Sambrook等 人，Molecular Cloning-A Laboratory Manual,第2版，第 1-3 卷（1989)中所描述的。如 本文中使用的涉及基因的术语"突变的"意指该基因或其常规序列的核酸序列中的至少一 个核苷酸突变发生已被不同的核苷酸替代，或已经从该序列删除，使得蛋白质序列以定性 或定量改变的功能或基因敲除的方式发生转录。
[0030] 如本文中使用的术语"基因"是指含有核酸聚合酶的模板的核酸序列，在真核细胞 中该酶为RNA聚合酶。基因被转录为mRNA，并且然后被翻译成蛋白质。
[0031] 如本文中使用的术语"核酸"包括指代单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖 核苷酸聚合物，即多核苷酸，并且除非另外限制，其包含具有天然核苷酸的必需性质的已知 类似物，因为其以类似于天然存在的核苷酸（即肽核酸）的方式杂交至单链核酸。多核苷 酸可以是全长或天然或异源结构或常规基因的子序列。除非另外说明，该术语包括指代具 体的序列及其互补序列。因此，如该术语在本文中的期望含义，具有出于稳定性目的或其他 目的进行修饰的骨架的DNA或RNA为"多核苷酸"。而且，包含非常规碱基例如次黄嘌呤核 苷（inosine)或修饰的碱基例例如三苯甲基化的碱基（仅仅是两个实例）的DNA或RNA在 本文中也被称作术语多核苷酸。应该理解，已经对DNA和RNA进行了大量不同的修饰以起 到本领域技术人员公知的许多不同目的。如在本文中使用的，术语多核苷酸涵盖多核苷酸 的这些化学、酶促或代谢修饰的形式，以及病毒和细胞的DNA和RNA特征的化学形式，包括 除简单和复杂细胞之外。
[0032] 术语"多肽"、"肽"和"蛋白"在本文中可以互换使用，其是指氨基酸残基的聚合物。 该术语适用于其中的一个或多个氨基酸残基为相应天然存在氨基酸的人工化学类似物的 氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。天然存在的氨基酸的这些类似物的必需性 质是，当结合于蛋白质时，该蛋白质与形成相同蛋白质但全部由天然存在的氨基酸组成的 抗体特异性反应。术语"多肽"、"肽"和"蛋白质"还包括修饰，包括但不限于糖基化、脂粘 附、硫酸化、谷氨酸残基的γ -羧化、羟基化和ADP-核糖基化。
[0033] 当参照酶分类（EC)提到酶时，该酶分类是其中酶基于国际生物化学与分子 生物学联合会命名法学会（Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology， NC-IUBMB)提供的酶命名法（Enzyme Nomenclature)被分类或可以被分类成的类别，该命名法可在http://www. chem. qmul. ac.uk/iubmb/enzyme/找到。意在包括尚未分类在具体类别中但可以这样进行分类的其他 适合的酶。
[0034] 除非另外说明，如果本文中参照登录号提到蛋白或核酸序列，例如基因，则该号码 尤其用于指具有能够通过WWW. ncbi. nlm. nih. gov/(如2009年7月13日可用的）找到的 蛋白质或核酸序列。
[0035] 本文中参照遗传密码编码多肽的每一核酸序列描述了核酸的每一可能沉默变异。 术语"保守修饰变体"应用于氨基酸和核酸序列。对于特定的核酸序列，保守修饰的变体是 指编码相同氨基酸序列或者由于遗传密码的简并而编码氨基酸序列的保守修饰变体的那 些核酸。术语"遗传密码的简并"是指大量功能上相同的核酸编码任意给定蛋白质。例如， 密码子GCA、GCC、GCG和G⑶均编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸被密码子指定的每一位 置，该密码子都能够变成所述的任意相应密码子，而不需改变所编码的多肽。这样的核酸变 化是"沉默变化"并且代表一种类型的保守修饰的变化。
[0036] 如本文中所使用的，术语具有特定序列（例如SEQ ID Ν0:Χ)的多肽的"功能性同 源物"（或短"同源物"）是指包含所述特定序列的多肽，条件是一个或多个氨基酸被取代、 缺失、添加和/或插入，并且该多肽对于底物转化具有（质量上）相同的酶促功能性。这种 功能性可通过利用包含重组酵母细胞的测试系统来进行测试，其中该重组酵母细胞包含用 于在酵母中表达同源物的表达载体，所述表达载体包含可操作地连接于在酵母中是功能性 的启动子的异源核酸序列，并且所述异源核酸序列编码该同系物多肽，对其在酵母细胞中 使乙酰基-辅酶A转化为乙醛的酶活性进行测试，并且测定在所述细胞中是否发生该转化。 可通过利用计算机辅助类似性分来来鉴定候选同源物。W02009/013159的实施例2中描述 了这样的分析的具体实例。本领域技术人员能够从中知晓可以发现多么适合的候选同源物 并且，可选地在密码子（对）最后化之能够如上文所述利用适合的测定系统来测试这样的 候选同源物的所需功能性。适合的同源物代表具有类似于具体多肽50%，优选60%或更 多，尤其是至少70 %，，更加尤其是至少80 %，至少90 %，至少95 %，至少97 %，至少98 %或 至少99%的氨基酸序列，并且具有所需酶促功能性的多肽。对于核酸序列，术语功能性同源 物意在包括不同于由于遗传密码的简并获得的另一核酸序列并编码相同多肽序列的核酸 序列。
[0037] 序列同一性在本文中被定义为如通过比较序列确定的两种或更多种氨基酸（多 肽或蛋白）序列或两种或更多种核酸（多核苷酸）序列之间的关系。通常，序列同一性或类 似性是在所比较的序列的全长上进行比较。在本领域中，"同一性"还意指氨基酸或核酸序 列之间序列联系的程度，例如情况可以是如通过这样的序列的字串自检的匹配来确定的。
[0038] 当氨基酸或核苷酸序列表现出一定程度的相似性时被称为同源物。被称为同源 物的两个序列表示相同的进化来源。不论两个同源序列是否紧密相关或者关系较远都分 别比或高或低的以"百分比同一性"或"百