专利名称：一种菊芋果聚糖外切水解酶基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及ー种菊芋果聚糖外切水解酶基因及其应用。
背景技术：
植物果聚糖主要是由多个果糖基通过糖苷键连接而成的碳水化合物。虽然15%的被子植物中均能发现果聚糖，但植物体中果聚糖的含量一般较低，只有在菊芋(Helianthustuberosus)的块莖；菊苣(Cichorium intybus)、牛蒡(Arctium Iappal)和鸡脚草(Dactylis 区101116作1118)的根；百合(し;[1;[11111 brownii )和洋葱(Allium cepa)的球莖；黑 麦草(Lolium perenne)、大麦(Hordeum vulgare)和小麦(Triticum aestivum)莖叶等少数几种植物的组织中含量相对较高(Ritsema and Smeekens 2003a;Van Laere and Van DenEnde 2002)。鹿糖是果聚糖合成的前体(Van Laere and Van Den Ende 2002)。植物体内主要存在两种酶类合成果聚糖(1)鹿糖鹿糖I-果糖基转移酶(Sucrose:Sucrosel-Fructosyltransferase,简写为 1-SST) (Van den Ende et al. 2006; Van Der Meer et al. 1998;殷桂香et al. 2009)和果聚糖果聚糖I-果糖基转移酶(Fructan:Fructanl-Fructosyltransferase,简写为 I-FFT) (Kawakami and Yoshida 2005;王志敏 2000)。两个鹿糖分子通过I-SST作用产生ー个三糖(Ι-kestose)和ー个单糖。随后I-FFT聚合三糖或者寡聚糖产生更长聚合度的多糖，在ー些植物中聚合度能够达到70之多。其它ー些酶，例如果聚糖果聚糖 6G-果糖基转移酶(Fructan:Fructan 6G_Fructosyltransferase,简写为 6G-FFT)(Lasseur et al. 2006)和鹿糖果聚糖6_果糖基转移酶(Sucrose:Fructan6-fructosyltransferase,简写为 6-SFT)也可參与果聚糖的合成(Gao et al. 2010a; Tamuraet al. 2009)。果聚糖合成途径中的I-FFT同时也在果聚糖的降解中发挥功能，因为该酶可以把高聚合度的果聚糖中的果糖基转移到低聚合度的果聚糖上。除了 1-FFT，植物中负责果聚糖降解的酶主要有果聚糖I-外切水解酶(Fructan Ι-exohydrolases,简写为1-FEH)和果聚糖6-外切水解酶(Fructan 6-exohydrolases,简写为6-FEH)。另外果聚糖6&1-外切水解酶(Fructan6&l_exohydrolases,简写为 6&1-FEH)和 6_ 鹿果三糖外切酶(6-kestoseexohydrolases,简写为 6-KEH)也能水解果聚糖(Kawakami et al. 2005; Van den Ende etal. 2005) 0 1-FEH酶能够水解果聚糖的β (2_1)糖苷键，6-FH1负责水解β (2_6)糖苷键，而6&1-FEH能水解上述两种糖苷键，6-ΚΗ1仅仅水解最简单的蔗果三糖(6-kestose)，但并不是所有这些酶都能在同ー个植物中被发现。目前 Η已经在菊苣、谷类(小麦，大麦等)、甜菜、牛蒡和大蒜等被发现(DeRooveret al. 1999;Kawakami et al. 2005;Ueno et al. 2011;Van den Ende et al. 2000;Van denEnde et al.2003;Van den Ende et al.2003a;Van Laere and Van Den Ende 2002)，并且所有这些FEH都是外切水解酶，通过水解末端的果糖基生成ー个果糖来实现果聚糖的降解。果聚糖的完全降解还需要转化酶(Invertase，简写为INV)的參与，因为FEH酶水解的最终产物部分是鹿糖，而FEH酶活力受鹿糖抑制(Lothier et al. 2010; Verhaest etal. 2007)，蔗糖需通过转化酶的作用水解生成果糖和葡萄糖(Sturm 1999)。除了植物体内的FEH酶外,微生物产生的菊粉酶(Inulinase)也能水解菊芋等植物的果聚糖。菊粉酶一般同时具有水解酶和转化酶的活力，也就是可以水解蔗糖，而植物的FEH—般没有转化酶的功能；同时微生物来源的菊粉酶同时具有外切酶和内切酶的活力，而植物来源的FHl—般只有外切酶的能力；最后ー个差别是微生物来源的菊粉酶主要水解β (2-1)糖苷键而较少能够水解β (2-6)糖苷键(董英et al. 2006;王静and金征宇2002)。目前对于菊粉酶研究较多，而对植物源的FEH酶研究相对较少。转果聚糖合成酶基因的植物除了获得合成果聚糖的功能以外，植物的抗逆性(冷、干旱)也有所增强，表明果聚糖与植物的抗逆有关(Livingston et al. 2009;杨晓红and陈晓阳2006)。最新研究发现果聚糖提高植物的抗逆性主要是通过提高细胞内果聚糖的积累，保护质膜不被冷害和渗透胁迫损伤，如低温胁迫可诱导合成高聚合度的果聚糖，果聚 糖可以插入细胞脂质膜中而防止其渗漏(Livingston III and Henson 1998;Livingstonet al. 2009)。但是,果聚糖与抗逆的相关研究主要集中在耐冷与耐旱方面(Kawakami etal. 2008; Park et al. 1999;张小芸et al. 2011)，而果聚糖与盐胁迫相关的研究报道较少(Livingston et al. 2009;杨晓红 and 陈晓阳 2006)。菊芋中的I-SST基因和I-FFT基因已经被克隆出，初步发现可能是单拷贝基因，其蛋白也被提纯(Liischer et al. 1996;Van Der Meer et al. 1998)。体外生化反应证实菊芋在1-SST和I-FFT共同作用下可以促进果聚糖的合成(Koops and Jonker 1994; 1996)。在矮牵牛花植物体内中过表达菊芋的I-SST基因能导致三糖化合物的堆积；而在同样的植物中单独过表达I-FFT的基因却并没有增加果聚糖，但提取转基因植物中的I-FFT酶，可在体外促进以三糖为底物的多糖合成。这说明，植物体単独过表达1-FFT，由于缺少合适的作用底物而并不能直接表现出酶的作用。研究者通过杂交将这两个基因转到牵牛花体中，发现老叶片中果聚糖的含量増加，这就说明菊芋中的I-SST和I-FFT具有果聚糖合成的功能，也说明菊芋和其它植物一祥存在类似的果聚糖合成途径。至于菊芋中果聚糖的水解途径，Stefan P. Marx在1997通过初步的蛋白提纯已经发现菊芋中几个水解果聚糖的蛋白组分，ー个蛋白组分能够水解β (2-1)糖苷键，而对β (2-6)糖苷键的果聚糖或者蔗糖几乎没有水解能力，说明这个蛋白确实是I-FEH酶，对于其余组分该文作者并没有研究(Marx etal. 1997)，亦没有公开该蛋白的氨基酸或核苷酸序列。菊芋的I-FEH的核苷酸序列或者肽段信息迄今也未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种菊芋果聚糖I-外切水解酶(I-FEH酶)基因。本发明的另一目的是提供该基因的应用。本发明的目的可通过如下技术方案实现一种菊芋果聚糖I-外切水解酶基因Ht 1-FEH，具有如SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列。所述的菊芋果聚糖I-外切水解酶基因Ht I-FEH编码的蛋白质，具有如SEQ IDNO. 2所示的氨基酸序列。ー种重组载体，将菊芋果聚糖I-外切水解酶基因Ht I-FEH插入表达载体pPICZ a C的XhoI和XbaI酶切位点之间。所述的菊芋果聚糖I-外切水解酶基因Ht I-FEH优选以菊芋品种“南芋I号”叶片cDNA为模板，以picFEH-F和picFEH-R为引物，通过PCR扩增得到。ー种含有所述的菊芋果聚糖卜外切水解酶基因Ht I-FEH的毕赤酵母。所述的毕赤酵母优选将上述的重组载体经限制性内切酶PmeI酶切线性化，将该线性化的重组载体DNA电转化Pichiapastoris X-33酵母,使线性化的重组载体DNA与宿主基因组DNA进行同源重组整合而得到的。所述的菊芋果聚糖I-外切水解酶基因Ht I-FHl在水解菊粉生产果糖类物质中的
应用。 所述的菊芋果聚糖I-外切水解酶基因Ht I-FEH在培育转基因耐盐植物中的应用。有益效果本发明设计特异引物，在菊芋中成功克隆了一个果聚糖外切水解酶基因，命名为Ht 1-FEH，该基因的⑶S全长为1683bp，编码560个氨基酸，等电点为6.24。通过对该基因的序列分析表明，Ht I-FFH是ー个果聚糖外切水解酶，具有糖苷水解酶32 (GH32)家族相同的三个保守基序(NDPN、RDP和EC)。氨基酸序列的信号肽和糖基化位点预测结果表明，Ht I-FEH可能有一条包括25个氨基酸残基的信号肽序列和7个糖基化位点。基因表达模式分析结果表明，Htl-FHl主要在发芽的块茎中表达，參与菊芋块茎萌发过程中果聚糖降解代谢的转录调控。Stefan P. Marx在1997年通过蛋白纯化的手段，初步提纯了 ー个菊芋 I-FEH 酶(Marx SP, N&berger J, Frehner M (1997) Seasonal variation ofiructan - β - fructosidase(FEH) activity and characterization of aβ -(2-1) - linkage specific FEH from tubers of Jerusalem artichoke(Helianthustuberosus). New Phytol 135:267-277)，但该研究存在一下三个问题1.该研究并没有获得该I-FEH的蛋白或者核苷酸序列，缺少关键的核苷酸序列将不可能将该基因运用到农业生产实践和エ业化中。2.根据Stefan P. Marx和申请者本人的推測，目前菊芋中应该有2 3个I-FHl基因家族成员，各成员间核苷酸序列和蛋白基本性质不尽相同。虽然目前缺少Stefan P. Marx研究中I-FEH的酶的核苷酸序列，但申请者推断Stefan P. Marx提纯的I-FEH酶不是本研究中发现的Ht I-FEH酶，因为被Stefan P. Marx提纯的I-FEH酶的分子量为79kDa，但本研究中所发现该酶的分子量在10(Tl30kDa之间。3.该作者并没有对提纯的I-FEH在植物盐分反应中的功能进行探讨。本发明利用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris X_33)表达系统对菊芋果聚糖外切水解酶基因Ht I-FEH进行异源表达和功能的初步验证。Ht I-FEH表达产物重组蛋白具有果聚糖水解酶活性，而对蔗糖没有水解活性。因此，初歩推断Ht I-FEH为果聚糖外切水解酶基因，与预测的结果相符。本发明研究盐逆境下果聚糖代谢相关基因的表达调控机制，结果表明在地上部快速生长期(50-90d)，盐胁迫诱导Ht I-FEH在茎和叶中的表达量上升，叶片中总糖和还原糖含量明显高于对照，茎中的非还原糖含量高于对照，由此说明，盐胁迫下果聚糖水解酶HtI-FHl基因在地上部快速生长期的转录正调控可以增加叶片和茎中的单糖或非还原糖含量，而这些渗透调节物质的增加则有利于菊芋在盐胁迫下的生理防卫。因此，该基因可用于培育转基因耐盐植物。
图I、菊芋果聚糖外切水解酶基因的⑶S全长扩增结果；1 =PCR結果，M =Marker0图2、Ht I-FEH氨基酸序列的信号肽预测。图3、Ht I-FEH基因在菊芋不同器官中的时空表达模式。图4、菊芋果聚糖外切水解酶基因表达载体的构建A l-picFEH 高保真扩增片段，2-pEASY-B-picFEH 双酶切，3-pPICZ a C 双酶切，M-MarkerB :表达载体 pPICZ a C-picFEH 双酶切验证，I 5 pPICZ a C-picFEH，M-Marker0图5、pPICZ a C-picFEH质粒的线性化(A)和阳性转化子的PCR验证(B)A M-Marker, I-pPICZ a C-picFEH 线性化前，2-pPICZ a C-picFEH 线性化后；B =M-Marker, CKl-未转化对照，CK2-转空载对照，CK3-阳性对照，I 4 :转化子。图6、Ht I-FEH重组蛋白的SDS-PAGE分析胶中CKl代表培养的空白毕赤酵母X-33的上清液；CK2 :培养的带有pPICZ a C质粒的毕赤酵母Χ-33的上清液(无1-FEH) ；Α和B :浓缩的酶液；1_4 :培养的带有菊芋I-FEH的毕赤酵母Χ-33的上清液；Μ :蛋白分子量标记。图7盐胁迫下菊芋果聚糖代谢关键酶基因的时空表达调控DAP表示种植时间。图8盐胁迫对叶片可溶性总糖(A)和还原糖(B)含量的影响，CK :代表正常生长的南芋一号，T :代表经盐胁迫处理的南芋一号。图9盐胁迫对茎基部可溶性总糖(Α)、还原糖(B)含量的影响CK :代表正常生长的南芋一号，T :代表经盐胁迫处理的南芋一号。
具体实施例方式实施例I Htl-FEH基因的克隆取菊芋品种“南芋I号” 4叶期幼嫩的叶片，參照OMEGA plant RNA提取试剂盒说明书提取植物总RNA,用TaKaRa反转录试剂盒两步法反转录得到cDNA模板。利用其它物种已有的I-FEH基因编码序列(coding sequence,⑶S)序列到菊芋(NCBI)和向日葵 EST 数据库(http://compbio. dfci. harvard, edu/tgi/plant. html)中Blast，筛选相似性高的EST序列用DNAstar软件进行拼接，得到一条全长为1792bp的EST序列(TC4077)，将该EST序列与已有的I-FEH基因⑶S序列比对发现，该EST序列与菊苣的Cil-FEH I (AJ242538)⑶S序列相似性达78. 3%，而且还有起始密码子ATG和终止密码子TGA。于是，以TC4077 EST序列为模板，用Primer Premier 5· O设计特异引物用于扩增HtI-FEH⑶S全长序列，引物序列如下FEH-F: 5，~CGTTGATGGTAAAGGAGATG~3，(SEQ ID NO. 3)FEH-R:5，~CCATAGTTTCTCAATCCATAGG~3，(SEQ ID NO. 4)以上步得到的“南芋I号” cDNA为模板，FEH-F和FEH-R为引物PCR扩增目的基因片段，反应体系如下10 X PCR Buffer 2 μ L, IOmM dNTP O. 4 μ L, FEH-F (IOyM)IyL, FEH-R(10 μ Μ) I μ L，cDNA 模板 I μ L，Taq 酶 O. 2 μ L, ddH20 14. 4 μ L，总体积 20 μ し反应程序
95°CI min
95 O30 s
55*C30 s30 cycles
685C2 min
68eC5 min 取2 μ L扩增产物跑1%的琼脂糖凝胶电泳，检测扩增結果。得到约1700bp左右的特异条带，如图I所示。将扩增片段回收，TA克隆后测序结果显示，得到长度为1698bp的DNA序列，序列分析发现其中有ー个SEQ ID No. I所示的1683bp的开放阅读框(ORF)，ORF编码560个氨基酸，序列如SEQ ID No. 2所示。因此，该ORF序列即为预测的⑶S全长序列，将该基因命名为Ht I-FEH0将获得的cDNA序列利用DNAstar软件翻译成氨基酸序列，利用NCBI GenBank数据库进行Blast同源性比较，调出相关同源基因的CDS序列和氨基酸序列，用DNAstar软件中MegAlign进行序列比对并构建系统发育进化树。蛋白质序列性质分析信号妝预测http: //www. cbs. dtu. dk/serics/SignalP/糖基化位点分析http: //cbs. dtu. dk/servies/NetGlyc分子量及等电点预测http: //www. expasy. ch/tools/pi tool, html用Ht I-FEHCDS核酸序列在NCBI Blast比对分析结果显示，Ht FHl与向日葵细胞壁转化酶基因(Helianthus annuus cwINVl, DQ012383)同源性最高，相似性(Identities)达97%，但NCBI数据库中仅有该基因序列，对该基因序列的功能研究目前还没有；其次与菊苣果聚糖外切水解酶基因(Cichorium intybus I-FEH I，AJ242538)相似性为81%，但通过菊苣的核苷酸的序列不能够获得菊芋的I-FHl核苷酸序列，主要由于虽然菊芋和菊苣是同一个科的植物，但属于不同的属的植物，基因序列差别较大。氨基酸序列Blast比对分析显示，Ht I-FEH与向日葵细胞壁转化酶(Ha cwINVl, AAY85659)相似性达96%，与菊苣果聚糖外切水解酶(CiI-FEH I，CAC19366)相似性为75%。实际上，核苷酸的相似性高低仅仅作为植物FEH功能的ー个參考，因为在FEH的研究中发现，仅仅通过改变一个核苷酸，也能将拟南芥的INV转变为FEH，而这两个酶是功能几乎完全不同的酶(Le Roy, K. Lammens, W.Verhaest, M. De Coninck, B. RaDijns, A. Van Laere, A. Van den Ende, W(2007). Unravelingthe difference between mvertases and fructan exohydrolases:Asmgle aminoacid(Asp-239)substitution transforms Arabidopsis cell wall invertase linto afructan 1-exohydrolase. Plant Physiology 145 (3):616-625)。用Ht 1-FEH 氨基酸序列到 NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure)保守结构域数据库(Conserved Domain Database, Q)D)中进行保守结构域预测，结果显示,从N端的45 225个氨基酸序列中，有3个活性位点，5个底物结合区，Ht I-FEH与糖苷水解酶32 (Glycosyl hydrolase family 32,GH32)家族匹配性最高。GH32家族成员包括水解Sllcell w&ll invert&ses、fruct&n exohydrol&ses、v&cuolar invert&ses)矛ロ移酶(fruct osyltransferases),这些酶在分子结构上非常相似但功能各异,该家族的显著特征是有NDPN、RDP和EC三个高度保守的基序(motif)。另外，转化酶(INV)还有ー个特异的SLD保守基序，而果聚糖外切水解酶(FEH)—般没有这个保守基序，SLD是区分 Η和INV的主要特征(Lammens et al. 2009; Van den Ende et al. 2009)。将 Ht I-FEH 与相关基因的氨基酸序列多重比对发现，Ht I-FEH有NDPN、RDP和EC三个保守基序，而没有SLD这个保守基序。由以上结果表明，我们推测Ht I-FHl可能为果聚糖外切水解酶。信号肽是分泌蛋白新生肽链N端的一段20 30氨基酸残基组成的肽段，信号肽序列可使正在翻译的核糖体附着到粗面内质网(RER)膜上并合成分泌蛋白，带有信号肽的蛋白可通过分泌途径分泌到胞外，因此，信号肽对蛋白质的正确合成与转运起重要作用，并使功能蛋白能分泌到特定的部位行使具体的功能(朱玉贤et al. 2007) 0通过信号肽分析软件预测显示(图2)，Ht I-FEH的氨基酸序列在N端第25和26个氨基酸之间有ー个较大可能的切割位点(VHA-SE)，那么可以推测在Ht I-FEH氨基酸序列的N端有一条包括25个氨基酸残基的信号肽序列，因此该基因所编码的蛋白有可能是分泌蛋白。实施例2根据克隆得到的Ht I-FEH⑶S序列，用Primer Premier 5· O设计半定量表达引物qFEH，以18S核糖体编码基因作为内參，分析Ht I-FEH在菊芋中的表达模式。PCR反应体系和程序同实施例1，循环数为25。引物序列如下qFEH_F:5， -TGCGTCAAAGTCATTCTA-3， (SEQ ID NO.5)qFEH_R:5’ -CCATAACTCCCACTCGTA-3’ (SEQ ID NO.6)18S-F:5，-TACCGTCCTAGTCTCAACCA-3’ (SEQ ID NO. 7)18S-R:5’-AACATCTAAGGGCATCACAG-3’ (SEQ ID NO. 8)通过半定量RT-PCR检测了 Ht 1_FEH在菊芋不同器官和以及块茎发育、萌发过程中的转录水平(图3)。Ht I-FEH在发芽块茎中表达量最高，块茎发芽后，随着时间的延长，表达量呈增加趋势；Ht I-FEH在成熟叶片中表达，但弱于发芽后的块茎。Ht I-FEH在根和茎中只有少量表达，在块茎发育膨大过程中，Ht I-FEH的表达水平很低。以上结果表明，HtI-FEH主要在块茎萌发过程中提高转录水平的表达量。基因序列同源性和保守功能域分析结果表明Htl-FEH可能是果聚糖外切水解酶的编码基因，Ht I-FEH在转录水平的时空表达调控可能与果聚糖外切水解酶在菊芋生长发育中所起的作用有夫。实施例3表达载体的构建根据果聚糖外切水解酶基因Ht I-FEH的序列分析結果，上游引物去除预测的N端信号肽序列MVKEMAGWVLSFCILLVVNGVGVHA，共25个氨基酸，从第26个氨基酸开始设计上游引物，并加上Xho I酶切位点C I TCGAG,加上Kex2 signal cleavage序列AAGAGA,カロ上保护碱基CCG，将载体中自带的酵母α因子前导肽序列作为信号肽，构建分泌型表达载体，以使重组的果聚糖外切水解酶能分泌到毕赤酵母的细胞外。下游引物去除序列自身的終止密码子，在表达框后加入融合6 XHis标签，使重组蛋白为融合蛋白，方便蛋白表达后的纯化和检测，再加上Xba I酶切位点T I CTAGA，加上保护碱基GCCG。设计引物如下，酶切位点如下划线所示
picFEH-F :5’-CCGCTCGAGAAGAGATCAGAAGATTTGCAGCCTT-3’ (SEQ ID NO. 9)picFEH-R :5’ -GCCGTCTAGA ATCCATAGGAACTATTTGAG-3’ (SEQ ID NO. 10)以实施例I中的cDNA为模板，用高保真酶进行PCR扩增，由于以cDNA为模板进行高保真扩增效率低，本实验中进行了两次PCR，第一次以cDNA为模板先扩增一次，然后以第一次PCR产物为模板，再扩增一次。反应体系5X PrimerSTARTM Buffer (Mg2+plus) 10 μ L, dNTP Mixture (2. 5mM)4 μ L, picFEH-F (10 μ M) I μ L, picFEH-R (IOyM)IyL, DNA 模板 2 μ L，HS DNA polymerase(2. 5U/ μ L) 0. 5μ L, ddH20 31. 5 μ L,总体积 50 μ し*反应程序
权利要求
1.一种菊芋果聚糖I-外切水解酶基因Ht 1-FEH，其特征在于具有如SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列。
2.权利要求I所述的菊芋果聚糖I-外切水解酶基因HtI-FHl编码的蛋白质，其特征在于具有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
3.—种重组载体，其特征在于将菊芋果聚糖I-外切水解酶基因Ht I-FHl插入表达载体pPICZ a C的XhoI和XbaI酶切位点之间。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于所述的菊芋果聚糖I-外切水解酶基因Ht I-FEH是以菊芋品种“南芋I号”叶片cDNA为模板，以picFEH_F和picFEH-R为引物，通过PCR扩增得到。
5.ー种含有权利要求I所述的菊芋果聚糖I-外切水解酶基因Ht I-FEH的毕赤酵母。
6.根据权利要求5所述的毕赤酵母，其特征在于所述的毕赤酵母是将权利要求3所述的重组载体经限制性内切酶Pmel酶切线性化，在将该线性化的重组载体DNA电转化PichiapastorisX-33酵母，使线性化的重组载体DNA与宿主基因组DNA进行同源重组整合而得到的。
7.权利要求I所述的菊芋果聚糖I-外切水解酶基因Htl-FEH在水解菊粉生产果糖类物质中的应用。
8.权利要求I所述的菊芋果聚糖I-外切水解酶基因HtI-FHl在培育转基因耐盐植物中的应用。
全文摘要
本发明属于基因工程领域，公开了一种菊芋果聚糖外切水解酶基因及其应用。该菊芋果聚糖1-外切水解酶基因Ht 1-FEH，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，编码具有如SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列的菊芋果聚糖1-外切水解酶。所述的菊芋果聚糖1-外切水解酶基因Ht1-FEH可在水解菊粉生产果糖类物质中应用，也可在培育转基因耐盐植物中应用。
文档编号C12R1/84GK102653769SQ201210141758
公开日2012年9月5日 申请日期2012年5月9日 优先权日2012年5月9日
发明者刘兆普, 康健, 梁明祥, 隆小华 申请人:南京农业大学