一种专门针对环境样品内分泌干扰效应的测试方法
【专利摘要】本发明涉及一种专门针对环境样品内分泌干扰效应的无代谢活化(-S9)酵母双杂交实验方法，属于环境检测和评价技术范畴。通过优化培养基的组成、浓度，优化培养、暴露条件，解决了测试环境样品内分泌干扰效应时稀释倍数过多的问题，也缓解了环境样品采集量大、样品前处理过程中需要高浓缩倍数的压力。本方法采用锥形瓶为菌液培养容器，采用96孔板为环境样品暴露、测试的容器，采用采用酶标仪作为测定吸光度的工具。实现了对污染物、环境样品内分泌干扰效应的简便、准确检测，也便于方法的推广普及。
【专利说明】一种专门针对环境样品内分泌干扰效应的测试方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种专门针对环境样品内分泌干扰效应的无代谢活化(-S9)双杂交酵母实验方法，属于环境污染检测和评价技术范畴。
【背景技术】
[0002]随着工农业生产的快速发展，环境污染对人类造成的危害远远超过预想的程度，其中，环境污染物的内分泌干扰效应受到越来越广泛的关注。内分泌干扰效应，是指由污染物引起的对生物体内分泌系统或与内分泌相关系统的干扰损害。有关内分泌干扰效应的研究主要是从细胞、亚器官或器官及组织等水平，揭示污染物对生态系统的生物种群、群落或生态系统的影响机制。内分泌干扰效应的测试和评价方法也在不断开发、优化。目前，检测环境雌激素效应的方法多为生物测试法，包括雌激素受体重组酵母实验、子宫增重实验、细胞增殖实验、卵黄蛋白原诱导实验等。其中，重组酵母实验体系是近年研究、应用较多的方法之一。该实验采用聚合酶链反应法扩增人雌激素受体基因hER，通过构建诱饵质粒，提取、纯化含有hER共激活因子基因的靶质粒，将诱饵质粒和靶质粒同时转染酵母细胞构建hER双杂交酵母。当具有雌激素效应的受试物作用于重组酵母时，可与雌激素受体形成复合物，促进报告基因LacZ的表达，产生β -半乳糖苷酶，通过测定β -半乳糖苷酶的活性反映受试物的雌激素效应。
[0003]在传统的无代谢活化(-S9)双杂交酵母实验操作中，待测样品在暴露环节中其浓度被稀释到原始样品浓度的1/200，很难准确测定其内分泌干扰效应。为了得到准确的毒性测试结果，往往需要配置浓度很高的样品储备液。由于很多化学物质的水溶性较差，配制高浓度溶液往往需要添加有毒的助溶剂，如二甲基亚砜DMS0，由于生物毒性实验对助溶剂DMSO的含量要求不能超过0.1%，否则容易引起假阳性结果。对于环境样品而言，一般是通过提高样品浓缩倍数才能进行内分`泌干扰效应测试。为得到高浓缩倍数的待测样品，需要采集大量环境样品，给采样带来困难；另外，环境样品往往需要复杂的固相萃取等浓缩富集操作，如果浓缩倍数过高，往往很难保证其准确性。因此，有必要开发一种专门针对环境样品的简便、准确的内分泌干扰效应测试方法，以降低采样和样品制备的成本，提高测试结果的准确性。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是为克服无代谢活化(-S9)双杂交酵母实验体系中待测样品浓度稀释倍数过大、要求环境样品浓缩倍数过高等缺点，为化学污染物和环境样品无代谢活化(-S9)酵母双杂交实验测试方法的推广开辟一条新途径。
[0005]本发明的目的通过以下方式实现:通过调整培养基的组分及其含量，调整受试重组酵母细胞的培养时间和温度，提高酵母细胞暴露密度，使其悬浊液在600nm处吸光度达0.5-2.5。在此基础上，调整暴露实验过程中酵母细胞悬浊液和待测环境样品的添加体积，在保证测试结果准确的前提下，待测环境样品在暴露环节仅稀释2倍，大大降低了采样体积和样品前处理的成本。
[0006]本发明的优点主要体现在以下几个方面:(I)降低环境样品前处理过程中的浓缩倍数，省去样品高倍浓缩的步骤，减少了采样量，降低了采样和样品前处理的成本。(2)环境样品的暴露浓度稀释为原样品浓度的1/2，使环境样品的检测更方便。
[0007]附图附表说明
[0008]图1.本发明实施例雌二醇剂量-效应曲线
【具体实施方式】
[0009]实施例:
[0010]将0.02毫升冻存的酵母细胞株转接入盛有20毫升培养基的锥形瓶中，于30°C振荡培养12小时，稀释悬浊液，至600nm处吸光度(OD6J为2.5。移取稀释后的酵母悬浊液
0.90毫升、培养基0.10毫升、不同浓度的雌二醇溶液1.00毫升，至容积为5毫升的玻璃离心管中，混匀。从离心管中移取0.20毫升溶液至96孔板中，500转/分、30°C培养4小时，之后立即测定600nm处的吸光度值(OD6tltl)。从96孔板中吸走0.15毫升溶液，再加入0.12毫升缓冲溶液、0.02毫升氯仿，800转/分、30°C培养10分钟。随后加入邻硝基苯-β -D-吡喃半乳糖苷(ONPG)溶液0.04毫升，800转/分培养I小时。再加入0.10毫升碳酸钠(Na2CO3)溶液，30°C,800转/分培养10分钟。测定420nm处吸光度(OD420)。
[0011]用以下公式计算β -半乳糖苷酶活性U:
[0012]f/= 1000x 6.6X (^420-Q^o)
{txVxOD6J
[0013]待测物浓度-酶活性 作图。
[0014]t:与ONPG反应的时间；
[0015]V:测定OD42tl时菌液的体积；
[0016]OD420:样品在420nm处的吸光度；
[0017]OD420?:空白对照样品在420nm处的吸光度值。
【权利要求】
1.一种专门针对环境样品内分泌干扰效应的测试方法，属于环境检测和评价技术范畴。利用无代谢活化(-S9)双杂交酵母实验体系，通过优化受试生物酵母细胞的培养基、培养条件和暴露条件，弥补了传统方法暴露环节中因待测样品稀释倍数较大而要求样品前处理必须达到很高的浓缩倍数等不足，降低了环境样品前处理过程中的浓缩倍数，实现了利用少量环境样品、简单前处理即可检测内分泌干扰效应的目标。该方法简便、准确，对实验操作技术水平要求不高，便于推广应用。
2.权利要求1所述的环境样品内分泌干扰效应的测试方法，其特征还在于:对传统细胞培养基的组成和浓度进行了调整，培养基组分主要包括无氮源氮碱、葡萄糖、硫酸腺嘌呤、混合氨基酸、氯化钾、氯化镁等，其浓度为传统方法浓度的0.1-50倍。
3.权利要求1所述的环境样品内分泌干扰效应的测试方法，其特征还在于:所有细胞培养、暴露、显色等过程中的实验温度在5-40°C之间。
4.权利要求1所述的环境样品内分泌干扰效应的测试方法，其特征还在于:在检测过程中，受试生物酵母细胞的暴露密度(以600nm处的吸光度值表示)在0.5-2.5之间。
5.权利要求1所述的一种环境样品内分泌干扰效应的测试方法，其特征在于:用无代谢活化(-S9)双杂交酵母实验体系进行测试，确定了受试生物的培养条件和暴露条件，避免了待测样品在暴露环节中稀释倍数过大等问题。
6.权利要求1所述的一种环境样品内分泌干扰效应的测试方法，其特征在于:减少了环境样品的采样量，降低了环境样品的浓缩倍数，简化了环境样品浓缩等前处理步骤。
7.权利要求1所述的环境 样品内分泌干扰效应的测试方法，其特征还在于:不仅适用于单一化学污染物、复合化学污染物的内分泌干扰效应检测，也适用于液态、固态、气态环境样品的内分泌干扰效应检测，包括河流、湖泊、水库、工业废水、市政污水、家庭废水、再生水、农田排水、矿山尾水等液体样品，底泥、污泥、土壤、垃圾、生物质等其他固体样品，工厂、居室、办公室等气体样品。
【文档编号】C12Q1/02GK103509849SQ201210199433
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年6月18日 优先权日:2012年6月18日
【发明者】魏东斌, 赵慧敏, 杜宇国 申请人:中国科学院生态环境研究中心