专利名称：一种检测斑翅果蝇的方法
技术领域：
本发明属于昆虫检疫技术领域，具体涉及检测斑翅果蝇的方法。
背景技术：
斑翅果蚬suzukii Matsumura, 1931)为楼桃、葡萄等水果上的重要害虫，美国、加拿大、法国、意大利、斯洛文尼亚、西班牙、瑞士、日本、韩国等国均有其发生为害的报道[1]。该果蝇主要通过寄主植物以及寄主植物的果实传播，其为害近年来备受世界广泛关注，美国、澳大利亚、新西兰以及EPPO等国(地区)政府部门先后针对其发布预警或将其列入检疫性有害生物名单。有关斑翅果蝇检疫鉴定目前主要依靠雄虫的有关形态学进行，而其雌虫和其它虫 态的检疫鉴定常常较为困难，需要配合开展交配试验、饲养观察。在检疫工作中，发现的果 蝇多为幼虫或蛹，单从形态难以区分，给检疫带来了不便。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测斑翅果蝇的方法，该方法操作简单、方便、准确、灵敏。本发明提供一种检测斑翅果蝇的方法，包括下述步骤
(1)提取样品基因组DNA；
(2)扩增线粒体COI基因序列、回收扩增片段以样品基因组DNA为模板，采用上游引物CO I -F和下游引物CO I -R扩增线粒体CO I基因序列，回收扩增片段；所述CO I -F的序列为5' -GGAACATCTCTAAGAATTTTAATT-3'，所述 CO I -R 的序列为5' -CTCCAGCTAGTACTGGTAATGATAATAA-3'；
(3)将所述扩增片段分别采用限制性内切酶如aI和/ / I进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳；
(4)判断当所述扩增片段采用限制性内切酶I酶切时，能够得到长度为160-190bp和340-360 bp的两条酶切片段；当所述扩增片段采用限制性内切酶I酶切时，所述扩增片段不能被切开；此时，样品为斑翅果蝇。步骤(2)中扩增线粒体CO I基因序列的反应体系为5 yL 10XPCR buffer, 4μ L 2. 5mmol/L的dNTP，I UTaq酶，上、下游引物各I μ L，I μ L的样品基因组DNA，灭菌超纯水补足反应体系至50 μ L ;反应程序为95°C预变性5 min ;进入循环95°C变性45 s,52°C退火45 s，72°C延伸I min，共30个循环；最后72°C延伸10 min。采用限制性内切酶如a I細inf I分别酶切扩增片段的反应体系为扩增片段8μ L，酶切缓冲液2 μ L，IOU限制性内切酶如a I iHinf I，加灭菌超纯水至20 μ L ;反应条件将所述反应体系在37°C条件下反应6-10 h。有益效果
本发明通过设计果蝇mtDNA-CO I的通用引物，扩增相关基因序列并测序，利用针对果蝇CO I基因PCR-RFLP技术，建立了斑翅果蝇分子检测方法。该方法操作简单、方便、准确、灵敏。
图I是样品基因组DNA扩增产物的电泳图，各泳道对应的样品名称如下=M-IKbmarker, 1-SU1, 2-SU2, 3-SU3, 4-SU4, 5-SU5, 6-PU, 7-BIA ， 8-LU, 9-MI, 10-BIP,II-EL, 12-EU, 13-FI, 14—ME, 15—BU, 16—BD 0, 17—BSU。图2是各样品基因组DNA扩增片段的如a I酶切图，各泳道对应的样品名称如下 M-IKb marker, 1-SU1, 2-SU2, 3-SU3, 4-SU4, 5-SU5, 6- PU, 7-BIA，8-LU,9-MI, 10-BIP, 11-EL, 12-EU, 13-FI, 14—ME, 15—BU。图3是各样品基因组DNA扩增片段的/ / I酶切图，各泳道对应的样品名称如下 M-IKb marker,1-SU1, 2-SU2, 3-SU3, 4-SU4, 5-SU5, 6- PU, 7-BIA ， 8-LU,9-MI, 10-BIP, 11-EL, 12-EU, 13-FI, 14—ME, 15—BU。
具体实施例方式实施例I采用本发明方法检测斑翅果蝇 I材料、试剂和仪器
(I)试验材料
供试虫样及相关特性见表1，-20°C冰冻保存备用。表I供试虫样
权利要求
1.一种检测斑翅果蝇的方法，包括下述步骤 (1)提取样品基因组DNA； (2)扩增线粒体COI基因序列、回收扩增片段以样品基因组DNA为模板，采用上游引物CO I -F和下游引物CO I -R扩增线粒体CO I基因序列，回收扩增片段；所述CO I -F的序列为5' -GGAACATCTCTAAGAATTTTAATT-3'，所述 CO I -R 的序列为5' -CTCCAGCTAGTACTGGTAATGATAATAA-3'； (3)将所述扩增片段分别采用限制性内切酶如aI和/ / I进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳； (4)判断当所述扩增片段采用限制性内切酶如aI酶切时，能够得到长度为160-190bp和340-360 bp的两条酶切片段；当所述扩增片段采用限制性内切酶I酶切时，所述扩增片段不能被切开；此时，样品为斑翅果蝇。
2.根据权利要求I所述检测斑翅果蝇的方法，其特征在于步骤(2)中扩增线粒体CO I 基因序列的反应体系为5 iiL 10XPCR buffer,4 u L 2. 5mmol/L 的 dNTP，I UTaq酶，上、下游引物各IuL, I U L的样品基因组DNA,灭菌超纯水补足反应体系至50 ii L ;反应程序为95°C预变性5 min ;进入循环95°C变性45 s，52°C退火45 s，72°C延伸I min，共30个循环；最后72°C延伸10 min。
3.根据权利要求2所述检测斑翅果蝇的方法，其特征在于采用限制性内切酶如aI和/ / I分别酶切扩增片段的反应体系为扩增片段8 UL，酶切缓冲液2 uL, IOU限制性内切酶如a I iHinf I，加灭菌超纯水至20 y L ;反应条件将所述反应体系在37°C条件下反应6-10 h。
全文摘要
本发明提供一种检测斑翅果蝇的方法，属于昆虫检疫技术领域，具体涉及检测斑翅果蝇的方法。该方法为提取样品基因组DNA；扩增线粒体COⅠ基因序列、回收扩增片段以样品基因组DNA为模板，采用COⅠ-F和COⅠ-R扩增线粒体COⅠ基因序列，回收扩增产物；将扩增片段分别采用限制性内切酶ApaⅠ和HinfⅠ进行酶切，酶切产物并进行琼脂糖凝胶电泳；当扩增片段采用限制性内切酶ApaⅠ酶切时，能够得到长度分别为150-200和330-370的两条酶切片段；当扩增产物采用限制性内切酶HinfⅠ酶切时，所述扩增片段不能被切开；此时，样品为斑翅果蝇。该方法操作简单、方便、准确、灵敏。
文档编号C12Q1/68GK102758015SQ201210235428
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月9日 优先权日2012年7月9日
发明者吴军, 周锐, 孙鹏, 崔平福, 师振华, 廖太林, 纪睿, 袁克, 陈集翰 申请人:中华人民共和国昆山出入境检验检疫局