一种以水葫芦和木屑为主要原料固态发酵产漆酶的方法
【专利摘要】本发明提供了一种以水葫芦和木屑为主要原料固态发酵产漆酶的方法，采用的发酵菌株是2010年9月15日保存于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为：CCTCC?M?2010235的高产漆酶的密孔菌属的Pycnoporus?sp.SYBC-L3菌株，该发明的特点是以被列为世界十大害草之一的水葫芦和木屑为主要原料固态发酵生产制备漆酶，用DMP法测酶活，漆酶活力为73.61U/g干基，成本低廉且可变废为宝，简便易行。所产漆酶可广泛应用于纺织印染、造纸、草坪修复、能源再生、饲料、食品、废水处理等领域，属于生物【技术领域】。
【专利说明】一种以水葫芦和木屑为主要原料固态发酵产漆酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明提供了一种以水葫芦和木屑为主要原料固态发酵产漆酶的方法，采用的发酵菌株是2010年9月15日保存于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为:CCTCC M2010235的Pycnoporus sp.SYBC-L3高产漆酶的密孔菌属菌株，该发明的特点是以被列为世界十大害草之一的水葫芦和木屑为主要原料固态发酵生产制备漆酶，用DMP法测酶活，漆酶活力为73.61U/g干基，成本低廉且可变废为宝，简便易行。所产漆酶可广泛应用于纺织印染、造纸、草坪修复、能源再生、饲料、废水处理等领域，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]漆酶是ー种木质素降解酶，它能够催化木质素或与木质素结构类似的芳烃类和酚类化合物的降解，因此在木质素类环境污染物的降解与利用方面具有一定的应用潜カ和价值。
[0003]凤眼莲俗称水葫芦，原产南美，1901年被引入中国，因其叶下有ー个直立的葫芦状茎而得名。水葫芦繁殖能力很强，其大規模化生长直接影响其它水生植物和动物的生长，破坏水体的生态平衡，因此已被列为世界十大害草之一。由于近几十年我国エ业化的快速发展，使得江河湖水严重富营养化，造成水葫芦泛滥成灾，其中最严重的地区有滇池，还有太湖流域等。据统计，毎年为了治理水葫芦的污染，政府要花费数亿元的捕捞费。因此，如何有效地治理水葫芦，成为亟待解决的问题。目前解决水葫芦问题的途径主要有化学、物理和生物防治以及综合利用。综合利用被认为是其中最好的解决方法，其出发点是提高水葫芦的综合利用价值，只有资源的利用率提高，污染才会随之降低。这促使我们去探索研究怎样变废为宝、产生附加值更高的产物，既达到水葫芦综合利用的目的，又带来更高的经济价值，本发明就是在这样的指导思想下，经过试验获得成功的。
【发明内容】
[0004]本发明用2010年9月15日保存于中国典型培养物保藏中心(地址:中国武汉武汉大学)的保藏编号为=CCTCC M2010235的Pycnoporus sp.SYBC-L3产漆酶的密孔菌属的野生菌株为生产出发菌株，研究出以水葫芦和木屑为主要原料固态发酵产漆酶的方法，既达到水葫芦综合利用的目的，又创造出更高的经济价值产品漆酶，并且生产制备成本低廉且可变废为宝，简便易行。所产漆酶可广泛应用于纺织印染、造纸、草坪修复、能源再生、饲料、废水处理等领域，属于生物【技术领域】。
[0005]本发明的技术方案:用2010年9月15日保存于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为:CCTCC M 2010235的Pycnoporus sp.SYBC-L3产漆酶的密孔菌属的野生菌株为生产出发菌株，经种子培养和是以水葫芦和木屑为主要原料固态发酵生产制备漆酶，エ艺为:
[0006](I)种子培养
[0007]种子培养基:20g/L葡萄糖，200g/L马铃薯。[0008]马铃薯需切成片或块，加水煮20-30分钟，用纱布过滤取其汁。
[0009]接种エ艺:取斜面菌种ー环在PDA平板上点接菌丝，30°C培养7天，切取3块直径大小为0.5CM的菌落接入装有50ml种子培养基的500ml规格的三角瓶中，再加入玻璃珠10-20粒，准备若干份，置于摇床，培养条件:转速200rpm，温度30°C，恒温培养2天，即为发酵产酶的种子液。
[0010](2)发酵产酶培养基
[0011]将木屑也60°C烘箱中烘干至恒重；水葫芦晾晒，60°C烘箱中烘干至恒重，粉碎成丝状；称水葫芦20g，木屑I Ig放入500ml的三角瓶中，加入用盐酸及氢氧化钠调PH = 3.5的水60ml，再加入CuSO4 ? 5H20 1.5mmol/L,没食子酸40 u mol/L, 121°C灭菌20分钟，冷却后待用O
[0012](3)发酵产酶及酶液提取
[0013]灭菌冷却后在发酵产酶培养基中加入20ml种子培养液并充分与木屑和水葫芦混合，并用8层纱布封ロ置于30°环境中静止培养8天后，首先再加入400ml水，将结成团的菌块搅散后进行搅拌或置于摇床在30°C、200rpm条件下继续培养2小时，然后在30°环境中静止15小时，最后用离心机离心或用抽滤方法或用纱布进行过滤除去固型物和菌体即得到漆酶粗酶液，用DMP法测酶活，并计算总酶活除木屑和水葫芦的重量，得到干物质产漆酶的单位U/g.[0014](4)酶活的测定方法
[0015]3mL 反应体系中包括:0.5mll0mmol/L 的 2,6-二甲氧基酹；2.4ml pH = 3.0 的
0.lmol/L磷酸氢二钠-柠檬素缓冲液；0.1ml粗酶液——发酵液经冷冻高速离心机1000Og离心10分钟得到上清液并视酶活力稀释，以去离子水替代粗酶液溶液作为空白对照，在469nm处测吸光值每隔5s读取一次吸光度值，一般持续进行Imin后停止測定，以反应的线性范围计算酶活。
[0016]酶活力定义:以每分钟氧化Iiimol的DMP即2，6-二甲氧基酚转化成3，5，3'，5/ -四甲氧基二苯醌所需要的酶量，系数e =9.6L/(mmol*Cm)，定义为I个酶活力単位，酶活性以U ?じ1表示。
[0017]本发明的有益效果:
[0018]本发明的发酵产酶方法与其它制备漆酶的方法相比较，具有如下特点:
[0019]1、发酵原材料价格低廉，且可变废为宝，绿色环保，没有废弃物。因为菌种为药用真菌，故漆酶过滤后的剰余残存物可用于动物饲料、造纸和生物肥料。
[0020]2、发酵生产设备简单，资金投入少。
[0021]3、粗酶性质稳定，以DMP为底物时,在酸性环境下能发挥最大催化功效,最适温度为65度,较耐热。
[0022]4、作用底物广泛，有广阔的应用前景.[0023]5、生产制备成本低，十分有利于全面展开，符合国家政策。
[0024]由于本发明所生产制备出来的漆酶成本低且可广泛应用于纺织印染、造纸、草坪修复、能源再生、饲料、食品、废水处理等方面。因此本发明有广泛的エ业使用价值和显著的经济效益前景。【具体实施方式】
[0025]实施例1
[0026]取斜面菌种ー环在PDA平板上点接菌丝，30°C培养7天，切取3块直径大小为
0.5CM的菌落接入装有50ml种子培养基的250ml规格的三角瓶中，再加入玻璃珠10粒，准备若干份，置于摇床，培养条件:转速200rpm，温度30°C，恒温培养2天，即为发酵产酶的种子液。
[0027]将木屑也60°C烘箱中烘干至恒重；水葫芦晾晒，60°C烘箱中烘干至恒重，粉碎成丝状；称水葫芦20g，木屑Ilg放入500ml的三角瓶中，加入用盐酸及氢氧化钠调PH = 3.5的水60ml，再加入CuSO4 ? 5H20 1.5mmol/L,没食子酸40 u mol/L, 121°C灭菌20分钟，冷却后待用O
[0028]在发酵产酶培养基中加入20ml种子培养液并充分与木屑和水葫芦混合，并用8层纱布封ロ置于30°环境中静止培养8天后，首先再加入400ml水，将结成团的菌块搅散后进行搅拌或置于摇床在30°C、200rpm条件下继续培养2小时，然后在30°环境中静止15小时，最后用离心机离心或用抽滤方法或用纱布进行过滤除去固型物和菌体即得到漆酶粗酶液，用DMP法测酶活，并计算总酶活除木屑和水葫芦的重量，得到干物质产漆酶的酶活力为73.61U/g。·
【权利要求】
1.一种以水葫芦和木屑为主要原料固态发酵产漆酶的方法，其特征是以2010年9月15日保存于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为:CCTCC M 2010235的Pycnoporussp.SYBC-L3高产漆酶的密孔菌属菌株为出发菌株；以水葫芦和木屑为主要原料固态发酵制备漆酶；エ艺为: (1)种子培养 种子培养基:以质量体积浓度计:2%葡萄糖和20%马铃薯； 马铃薯需切成片或块，加水煮20-30分钟，用纱布过滤取其汁； 接种エ艺:取斜面菌种ー环在PDA平板上点接菌丝，30°C培养7天，切取3块直径大小为0.7CM左右的菌落接入装有50ml种子培养基的250ml规格的三角瓶中，再加入玻璃珠10粒，准备若干份，置于摇床，培养条件:转速200rpm，温度30°C，恒温培养2天，即为发酵产酶的种子液； (2)发酵产酶培养基 将木屑也60°C烘箱中烘干至恒重；水葫芦晾晒，60°C烘箱中烘干至恒重，粉碎成丝状；称水葫芦20g，木屑Ilg放入500ml的三角瓶中，加入用盐酸及氢氧化钠调PH = 3.5的水60ml，再加入CuSO4 ? 5H20 1.5mmol/L，没食子酸40 y mol/L，121°C灭菌20分钟，冷却后待用； (3)发酵产酶及酶液提取 灭菌冷却后在发酵产酶培养基中加入20ml种子培养液并充分与木屑和水葫芦混合，并用8层纱布封ロ置于30°环境中静止培养8天后，首先再加入400ml水，将结成团的菌块搅散后进行搅拌或置于摇床在30°C、200rpm条件下继续培养2小时，然后在30°环境中静止15小时，最后用离心机离心或用抽滤方法或用纱布进行过滤除去固型物和菌体即得到漆酶粗酶液，用DMP法测酶活，并计算总酶活除木屑和水葫芦的重量，得到干物质产漆酶的单位U/g ； (4)酶活的測定方法
3mL 反应体系中包括:0.5ml 10mmol /I,的 2,6_ 二甲氧基酌' ；2.4mI pH = 3.0 的0.1moI/L磷酸氢二钠-柠檬素缓冲液；0.1ml粗酶液——发酵液经冷冻高速离心机1000Og离心10分钟得到上清液并视酶活力稀释，以去离子水替代粗酶液溶液作为空白对照，在469nm处测吸光值每隔5s读取一次吸光度值，一般持续进行Imin后停止測定，以反应的线性范围计算酶活； 酶活力定义:以每分钟氧化Iymol的DMP即2，6_ 二甲氧基酚转化成3，5，3'，5'-四甲氧基二苯醌所需要的酶量，系数e =9.6lV(mm0l*Cm)，定义为I个酶活力単位，酶活性以U ?じ1表示。
【文档编号】C12R1/645GK103571802SQ201210278065
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年8月7日 优先权日:2012年8月7日
【发明者】张明, 李洪兵, 张峰 申请人:湖南鸿鹰生物科技有限公司