专利名称：一种耐高温铁超氧化物歧化酶及其结晶方法
技术领域：
本发明涉及DNA重组技术和蛋白质技术领域，特别是涉及一种耐高温铁超氧化物歧化酶及其结晶方法。
背景技术：
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,简称S0D)作为一种广泛存在于生物体细胞内，具有防御氧化损伤作用的金属酶，与机体衰老、肿瘤发生、自身免疫性疾病和辐射防护等有关，且在医药、保健品、食品添加剂和化妆品等领域均具有重要的应用价值。SOD广泛存在于生物界，最初生产的SOD的原料也是动物血，但是此来源提纯的工艺繁琐，操作困难，且得到的产品活性低，纯度也低。利用基因工程技术，许多热稳定性较好
的SOD成功地在常温宿主内进行了大量表达，从而大幅度降低了生产成本，扩展了生产应用。蛋白质在体外较难保持其生物学活性的完整性，然而以晶体结构存在的蛋白质一般活性都是比较稳定的。收集和分析X射线衍射蛋白质晶体的数据，就能解析出该蛋白质的高级结构。本发明所述的方法是该种耐高温铁超氧化物歧化酶的首次结晶，国内外均无报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种耐高温铁超氧化物歧化酶及其结晶方法。为达到上述目的，本发明提供一种耐高温铁超氧化物歧化酶，其氨基酸序列如SEQID NO 2 所示。为达到上述目的，本发明提供一种上述耐高温铁超氧化物歧化酶的结晶方法，所述方法通过构建重组载体pET-28a-FeS0D并导入大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达获得重组目的蛋白，再利用亲和层析和离子交换层析的方法纯化该重组目的蛋白，然后通过结晶试剂盒筛选重组目的蛋白的结晶条件，即可得到耐高温铁超氧化物歧化酶的蛋白晶体。上述方法包括以下步骤
(a)通过设计引物，以嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus)基因组DNA为模板，由PCR扩增方法获取耐高温FeSOD基因，其碱基序列如SEQ ID NO : I所示；
(b)将步骤(a)所得耐高温FeSOD基因连接到pET28a载体上，构建重组表达载体pET-28a-FeS0D，并导入大肠杆菌BL21 (DE3)中，诱导表达获得大量重组目的蛋白；
(c)将步骤(b)得到的重组目的蛋白上清通过O.45 μ m纤维素膜过滤，然后利用Ni柱亲和层析法和离子交换层析法纯化重组目的蛋白，得到纯度达到95%以上的重组目的蛋白(具有极高的耐热性，耐热温度可达90°C );
(d)将将步骤(c)纯化后的重组目的蛋白进行浓缩，用BCA法蛋白定量试剂盒来测定重组目的蛋白浓度，当浓度达到5-8mg/ml时,用蛋白质结晶试剂盒来筛选结晶条件,得到蛋白晶体；(e)将将步骤(d)形成的蛋白晶体，利用显微镜以及X射线晶体衍射仪进行鉴定。优选地，其中所述步骤(b)的具体操作为将步骤(a)所得耐高温FeSOD基因经Nde I和EcoR I双酶切后，连接到经同样处理的pET28a载体上，构建重组表达载体pET-28a-FeS0D,将重组载体pET-28a_FeS0D导入大肠杆菌BL21 (DE3)，获得基因重组工程菌E. Co I i/pET-28a-FeS0D，将重组基因工程菌于37 °C、220rpm下培养至0D600为O. 6时，力口入诱导剂IPTG至终浓度为ImM，继续培养3-5个小时，收集菌液，获得大量重组目的蛋白。优选地,其中所述步骤(d)的蛋白质结晶试剂盒购自Hampton Research公司，结晶条件为 Index HR2-14461、Index HR2-144 63、Index HR2-144 87、Index HR2-14488、Index HR2-14494、PEG/lon2 Screen HR2-0985、PEG/lon2 Screen HR2-0987、PEG/lon2 Screen HR2-09813、PEG/lon2 Screen HR2-09819、CrystalScreen2 HR2-11248。本发明具有以下有益效果本发明所提供的结晶方法流程简单，且获得的晶体分 辨率高，为研究该种蛋白质的三维结构和功能提供重要的条件。
图I是耐高温铁超氧化物歧化酶的诱导表达图；M :低分子质量蛋白质标准；1 :只含pET28a载体的重组菌诱导；2 :未诱导重组菌；3 ;诱导后重组菌；
图2是耐高铁超氧化物歧化酶纯化后的电泳分析图；M :低分子质量蛋白质标准；1 :诱导表达后的大肠杆囷超声破碎后上清溶液；2 :纯化后的目的蛋白；
图3 A是耐高温铁超氧化物歧化酶的一级鉴定质谱 图3 B是耐高温铁超氧化物歧化酶的二级鉴定质谱 图4是可见光下耐高温铁超氧化物歧化酶的晶体 图5是紫外光照射下耐高温铁超氧化物歧化酶的晶体 图6是耐高温铁超氧化物歧化酶晶体的X射线衍射图。
具体实施例方式应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的发明。除非另有说明，本文使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义，本说明书中未注明具体条件的实验方法是按常规实验方法；本说明书中所用的试验材料如无特别说明均为市售购买产品，各种试剂和培养基的成分和配制方法可参见常规实验手册中的操作。下面结合实施例详细阐述本发明的具体内容。实施例I :耐高温FeSOD基因的获得
为了去除基因中的内含子，根据NCBI上P. vivax Sail的序列(基因登录号HM992934. I)设计两对引物。上游引物5’ -TTACATATGCGTGGGGCAAGCACGGA-3 ’
下游引物5’ -GCGAATTCTTAAAACGGCTGCCAACG-3’
以嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus)基因组DNA(中国农业科学院赠送)为模板，进行PCR扩增，具体程序和反应体系如下
权利要求
1.一种耐高温铁超氧化物歧化酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2.—种权利要求I所述耐高温铁超氧化物歧化酶的结晶方法，其特征在于，所述方法通过基因重组技术构建重组载体pET-28a-FeS0D并导入大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达获得重组目的蛋白，再利用亲和层析和离子交换层析的方法纯化该重组目的蛋白，然后通过结晶试剂盒筛选重组目的蛋白的结晶条件，即可得到耐高温铁超氧化物歧化酶的蛋白晶体。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤 (a)通过设计引物，以嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus)基因组DNA为模板，由PCR扩增方法获取耐高温FeSOD基因，其碱基序列如SEQ ID NO : I所示； (b)将步骤(a)所得耐高温FeSOD基因连接到pET28a载体上，构建重组表达载体pET-28a-FeS0D，并导入大肠杆菌BL21 (DE3)中，诱导表达获得大量重组目的蛋白； (c)将步骤(b)得到的重组目的蛋白上清通过O.45 μ m纤维素膜过滤，然后利用Ni柱亲和层析法和离子交换层析法纯化重组目的蛋白，得到纯度达到95%以上的重组目的蛋白； (d)将将步骤(c)纯化后的重组目的蛋白进行浓缩，用BCA法蛋白定量试剂盒来测定重组目的蛋白浓度，当浓度达到5-8mg/ml时,用蛋白质结晶试剂盒来筛选结晶条件,得到蛋白晶体； (e)将将步骤(d)形成的蛋白晶体，利用显微镜以及X射线晶体衍射仪进行鉴定。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)的具体操作为将步骤(a)所得耐高温FeSOD基因经Nde I和EcoR I双酶切后，连接到经同样处理的pET28a载体上，构建重组表达载体pET-28a-FeS0D，将重组载体pET-28a_FeS0D导入大肠杆菌BL21 (DE3)，获得基因重组工程菌E. coli/pET-28a-FeS0D，将重组基因工程菌于37°C、220rpm下培养至0D600为O. 6时，加入诱导剂IPTG至终浓度为ImM，继续培养3_5个小时，收集菌液，获得大量重组目的蛋白。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(d)的蛋白质结晶试剂盒购自Hampton Research 公司，结晶条件为 Index HR2-14461、Index HR2-144 63、Index HR2-144 87、Index HR2-14488、Index HR2_14494、PEG/lon2 Screen HR2_0985、PEG/lon2 Screen HR2_0987、PEG/lon2 Screen HR2_09813、PEG/lon2 Screen HR2-09819、Crystal Screen2 HR2-11248。
全文摘要
本发明涉及一种耐高温铁超氧化物歧化酶及其结晶方法。本发明利用基因重组技术将耐高温FeSOD基因构建到载体pET28a上，通过将重组载体pET-28a-FeSOD导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达，利用亲和层析和离子交换层析的方法纯化重组目的蛋白，得到纯度达到95%以上的目的蛋白，再通过结晶试剂盒筛选目的蛋白的结晶条件，得到蛋白晶体。本发明所提供的结晶方法流程简单，且获得的晶体分辨率高。
文档编号C12N9/02GK102816747SQ20121028497
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月6日 优先权日2012年8月6日
发明者张耀洲, 吴少峰, 张丽, 陈剑清, 舒特俊 申请人:天津耀宇生物技术有限公司