专利名称：桂圆与牛甘果、橄榄、山楂、百香果的养生非蒸馏酒及其工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于发酵技术和酿酒技术领域，具体而言，本发明涉及用桂圆与牛甘果、橄榄、山楂、百香果的养生非蒸馏酒及其工艺。
背景技术：
本申请是中国专利申请201210027412和201210027411的部分继续申请。以果品为原料发酵酿酒，会带来浓郁的果香等各种私人有好感的香气。例如，本发明人的中国专利200910114150公开了以桂圆和甘蔗汁为原料生产白酒的方法，该酒可以带有桂圆和甘蔗的清香。又如，本发明人的中国专利200910114151公开了以桂圆和甘蔗汁 为原料生产白兰地酒的方法，该酒也可以带有桂圆和甘蔗的清香。然而，这些酒使用的原料较粮食昂贵，造成成本较高。尽管有些酿酒酵母本身能够给酒带来一些独特的风味，但是这类酵母往往却失酿酒产业中所需的一些优良工艺特性，如絮凝性。以这些酵母出发进行诱变筛选，尽管可以改善工艺特性，但是风味特性往往会在诱变中失去。为此，本发明人经过长期而艰苦的研究，开发了新的用粮食和桂圆为原料发酵蒸馏酒的工艺。该工艺制备的酒不但能够保持酿酒酵母所带来的独特风味，从而减少甚至无需较为昂贵的原料的使用，而且具有优良的工艺特性，方便酿造过程，进一步节约了成本。更为令人意外的是，该工艺中所使用的酵母的絮凝性随着发酵酒液中含糖量的变化而变化，而且在含糖量高的时候絮凝率低，有益于充分发酵，而在含糖量低的时候絮凝率高，便于发酵结束后酒液的分离。另外，现有技术多是将各种果肉直接打浆或者榨汁后，作为原料来发酵，然而本发明人进一步研究发现，有些果肉，如牛甘果、橄榄、山楂、百香果的果肉，直接制浆作为原料，经过发酵步骤，不容易将其风味带入最后发酵制成的酒中，往往需要大量的果肉来打浆，成本较高。本发明人直接在用粮食和桂圆发酵制酒后，直接加入这些果肉的果汁，制备成的酒品不但带有桂圆和酵母所具有风味，更能保持上述果肉的风味。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供新的制备桂圆与牛甘果、橄榄和/或山楂的养生酒的工艺。另外，本发明还提供了用该工艺生产的养生酒。具体而言，在第一方面，本发明提供了发酵制备桂圆与牛甘果、橄榄、山楂和/或百香果的养生酒的方法，其包括(I)取大米粉碎后，加水浸泡并煮熟，然后加入α淀粉酶进行液化，得到液化料；(2)取桂圆粉碎后，加水和纤维素酶在酸性条件下处理，得桂圆汁；(3)将步骤⑴获得的液化料和步骤(2)获得的桂圆汁混合，调节成酸性，加入糖化酶进行糖化，得到糖化液；
(4)向步骤(2)获得的糖化液加入具有絮凝优化特性的酵母和发酵助剂进行发酵，得到发酵液；(5)过滤步骤(4)获得的酒液的上清液，得桂圆风味酒；和(6)向步骤(5)获得的桂圆风味酒加入牛甘果果汁、橄榄果汁、山楂果汁和/或百香果果汁，得到养生酒。在本文中，桂圆与牛甘果、橄榄、山楂和/或百香果的养生酒是以桂圆为原料、同时以选自牛甘果、橄榄、山楂和百香果中一种或多种为原料，制备得到的养生酒。在本文中，絮凝优化特性指的是酵母在含糖环境下絮凝率低，而在无糖环境下絮凝率高。这种特性对于酿酒过程是尤其有益的。因为，在发酵初期，发酵液中含糖量高，此时不具有絮凝性质或絮凝率低的酵母，将尽量使其在发酵液中保持悬浮状态，从而使得发酵更为充分，提高发酵效率；在发酵结束时，发酵液中含糖量低，此时具有絮凝性质或絮凝率高的酵母，将容易沉淀到发酵罐底部，便于发酵终止后收集酒体。 优选在本发明第一方面的方法中，大米和桂圆的重量比为I 10 : O. 5 5,优选为3 8 O. 8 I. 2，更优选为5 I。在本发明中，桂圆可以直接榨汁，但优选加水稀释后用纤维素酶处理，更优选纤维素酶的加入量为I IOU/克桂圆原料。优选在本发明第一方面的方法中，在步骤(2)中，酸性的pH为4. 5 6. 5，优选为5. O 6. O，更优选为5. 5。酸性的调节可以用乳酸进行。在本发明中，液化和糖化可以按照本领域常规的粮食液化和糖化过程进行。其中所用的试剂，如淀粉酶和糖化酶都已经是很成熟的商品了。优选在本发明第一方面的方法中，液化的条件是α淀粉酶用量为5 15U/克大米原料，于50 60°C搅拌15 60分钟，然后升温至85 97°C继续搅拌20 60分钟。也优选在本发明第一方面的方法中，糖化的条件是于50 65°C加入糖化酶100 300U/克大米原料，保温45 120分钟。优选在本发明第一方面的方法中，在步骤(3)中，调节成酸性是乳酸调节pH至4. O 4. 8,优选调节pH至4. I 4. 5,更优选调节pH至4. 2。优选在本发明第一方面的方法中，具有絮凝优化特性的酵母是包含絮凝蛋白变体基因的酵母，所述絮凝蛋白变体基因的核苷酸序列如SEQ ID No :1所示，其编码的蛋白变体的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。野生型絮凝蛋白的氨基酸序列如GenBank登录号CAA55024. I所示，其能赋予不具有絮凝性质的酵母以絮凝性质。尽管野生型絮凝蛋白给酵母赋予的絮凝性质较强，但是这种性质在含糖环境下也很强，这样造成了发酵过程中酵母也容易沉淀在发酵罐底部，造成发酵效率低下，因此实践中并没有得到推广。本发明人经过长期研究，偶然在我们的发酵中发现了一株具有絮凝优化特性的酵母，经过委托研究，发现其是絮凝蛋白相对于野生型絮凝蛋白发生了至少三处氨基酸位点的突变。将该絮凝蛋白变体基因导入其他现有酵母，如不具有絮凝性质的酵母，能够赋予该酵母絮凝优化特性，而且不改变该酵母原有发酵风味。因此，使得具有发酵风味但不具有絮凝优化特性的现有酵母能够得以重新利用。优选在本发明第一方面的方法中，发酵助剂是Fermaid K。这是对酵母发酵很有益的发酵助剂，目前已经商品化。在本发明第一方面的方法中，发酵过程可以按照常规的发酵方法进行。通常发酵结束的判断指标是发酵至残糖含量< 4克/L。优选在本发明第一方面的方法中，发酵分两步进行，其中第一步的发酵温度比第二步的发酵温度高。更优选其中第一步的发酵温度为23 35°C，和第二步的发酵温度为18 22°C。另外更优选其中第一步的发酵时间为6 48小时，和第二步的发酵时间为9 12天。在本发明第一方面的方法中，过滤步骤(4)获得的酒液的上清液可以直接作为酒品，其带有桂圆风味；也可以在过滤步骤(4)获得的酒液的上清液后，进行蒸馏。除了用牛甘果果汁、橄榄果汁、山楂果汁和/或百香果果汁勾兑外，本发明第一方面的方法还可以包括过滤和/或陈酿的步骤。在本发明第一方面的方法中，牛甘果果汁、橄榄果汁、山楂果汁和/或百香果果汁可以使用常规的果汁榨取技术制备，但是由于这些果肉中含水量较低，因此优选将粉碎的果肉加水混匀来制取果汁。在第二方面，本发明提供了本发明第一方面的方法制备的养生酒。这种酒能够保留原有酵母的发酵风味，并带有牛甘果、橄榄、山楂和/或百香果等不容易发酵引入酒中的 风味，而且便于酒液的后期纯化，由于酵母主要沉积在发酵罐底部，只需要取酒液的上清，经过简单的过滤即可获得澄清的酒体。本发明具有下列优点和效果在发酵初期发酵液中含糖量高时，酵母将尽量使其在发酵液中保持悬浮状态，从而使得发酵更为充分，提高发酵效率；在发酵结束发酵液中含糖量低时，酵母将容易沉淀到发酵罐底部，便于发酵终止后收集酒体；能够赋予酵母以絮凝优化特性，从而可以利用原有发酵特性优良而絮凝性质不佳的酵母，充分利用目前发酵厂和酒厂的酵母资源；本发明的酒带有甘蔗清香并能继承原有发酵特性优良的酵母的特性，香味吸引人，能够达到与加入成本昂贵的原料相似的效果；本发明的酒使用了粮食作为发酵原料，降低了生产成本；酒品进一步带有牛甘果、橄榄、山楂和/或百香果等不容易发酵引入酒中的风味。为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例仅是为了说明，并不构成对本发明范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。另外，本发明引用了公开文献，这些文献也是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本发明进行参考，就好像它们的全文已经在本发明说明书中重复叙述过一样。
具体实施例方式以下本文将通过具体的实施例来描述发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的酿酒技术和基因重组技术手册以及本文所引用的参考文献中所列的方法来实施。另外，实施例中所使用的材料和设备均可从市场上购买。实施例I絮凝性质优化的酵母的获得根据我们设计的基因序列(SEQ ID No :1，其编码的蛋白变体的氨基酸序列为SEQID No :2)，通过商业途径委托广东暨大基因药物工程研究中心有限公司合成我们发现的絮凝蛋白变体基因并构建入酿酒酵母中。克隆过程参照《分子克隆实验指南》以及所用商品化试剂的操作指南进行，简要过程如下通过DNA自动合成仪，合成絮凝蛋白变体基因的核酸片段，用T4多核苷酸激酶(购自TaKaRa公司)将这些核酸片段的5’端进行磷酸化，然后等摩尔比混合这些核酸片段后于75°C变性5分钟，然后退火降温至12°C，加入T4 DNA连接酶(购自TaKaRa公司)连接12小时。然后，取I μ L上述连接产物在50μ L反应体积中进行PCR扩增，其中正向引物如序列表的SEQ IDNo 3所示(引入了 EcoR I内切酶位点)、反向引物如序列表的SEQ IDNo :4所示(引入了 Xba I内切酶位点)，反应条件为以94°C变性2分钟，然后以94°C变性30秒、63°C退火60秒并72°C延伸90秒进行30个循环，最后以72°C延伸12分钟并降温至
4。。。琼脂糖凝胶电泳上述PCR产物，回收约4. 5kb大小的片段，用EcoR I和Xba I双酶切该片段，并与经这两个内切酶酶切的PYESS2/CT质粒(可购自Invitrogen公司)用T4 DNA连接酶进行连接，电转化法将pYESS-fln质粒转入酿酒酵母(SaccharomycesCereViSiae)QN732株(购自广西易多收生物科技有限公司，其为非凝絮性酵母，但是发酵产生的酒中有淡淡巧克力香味)中，涂布在选择性培养基上培养，取生长出的酵母提取总DNA后，用上述正向引物和反向引物PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳发现有约4. 5kb大小的片段，表明已经将如序列表的SEQ ID No :1所示的基因导入了酿酒酵母中了。同时，将pYESS2/CT空质粒和克隆有野生型絮凝蛋白基因的PYESS2/CT质粒电转化入该非凝絮性酵母，分别作为阴性对照和阳性对照。我们将20mL 絮凝检测液(50mmol/L 朽1 樣酸纳,5mmol/L EDTA, 20mmol/L CaCl2, pH
4.5 ;并分别加入以下终浓度的物质不加入(无糖)，1M葡萄糖)置于50mL摇瓶中，分别加入上述各酵母细胞I克(湿重)，以30°C、100r/min振荡培养2小时。然后，取5mL细胞悬浮液至IOmL试管中，立刻在液面取样200 μ L，垂直静置5分钟，然后在液面取样200 μ L，分别测定垂直静置前后的0D600值，计算絮凝率(絮凝率=(I-垂直静置后的0D600值/垂直静置前的0D600值)*100% )。结果如表I所示，酿酒酵母QN732基本不具有絮凝性质；克隆了野生型絮凝蛋白基因后，无论在无糖还是在含糖环境下，酵母都将具有絮凝性质；本发明的絮凝蛋白变体基因转入的酵母在含糖环境下不具有絮凝性质，将保持悬浮状态发酵，而在无糖环境下将具有絮凝性质，容易沉淀到发酵罐底部，便于发酵终止后收集。表I各酵母在含糖或不含糖条件下的絮凝率
权利要求
1.发酵制备桂圆与牛甘果、橄榄、山楂和/或百香果的养生酒的方法，其包括 (1)取大米粉碎后，加水浸泡并煮熟，然后加入a淀粉酶进行液化，得到液化料； (2)取桂圆粉碎后，加水和纤维素酶在酸性条件下处理，得桂圆汁； (3)将步骤(I)获得的液化料和步骤(2)获得的桂圆汁混合，调节成酸性，加入糖化酶进行糖化，得到糖化液； (4)向步骤(2)获得的糖化液加入具有絮凝优化特性的酵母和发酵助剂进行发酵，得到发酵液； (5)过滤步骤(4)获得的酒液的上清液，得桂圆风味酒；和 (6)向步骤(5)获得的桂圆风味酒加入牛甘果果汁、橄榄果汁、山楂果汁和/或百香果果汁，得到养生酒。
2.权利要求I所述的方法，其中大米和桂圆的重量比为I 10 0.5 5，优选为3 8 0. 8 I. 2，更优选为 5:1。
3.权利要求I或2所述的方法，其中步骤(2)中酸性的pH为4.5 6. 5，优选为5.0 6.0，更优选为5.5。
4.权利要求I所述的方法,其中步骤(3)中酸性的pH为4.0 4. 8，优选为4. I 4. 5，更优选为4.2。
5.权利要求I所述的方法，其中具有絮凝优化特性的酵母是包含絮凝蛋白变体基因的酵母，所述絮凝蛋白变体基因的核苷酸序列如SEQ ID No:l所示。
6.权利要求I所述的方法，其中发酵助剂是FermaidK。
7.权利要求I所述的方法，其中发酵分两步进行，其中第一步的发酵温度比第二步的发酵温度高。
8.权利要求7所述的方法，其中第一步的发酵温度为23 35°C，和第二步的发酵温度为 18 22°C。
9.权利要求7所述的方法，其中第一步的发酵时间为6 48小时，和第二步的发酵时间为9 12天。
10.权利要求I 9之任一所述的方法制备的养生酒。
全文摘要
本发明提供了制备桂圆与牛甘果、橄榄、山楂和/或百香果的养生酒的方法，其包括向桂圆汁加入具有絮凝优化特性的酵母和发酵助剂进行发酵，然后加入牛甘果果汁、橄榄果汁和/或山楂果汁，得到养生酒。
文档编号C12G3/04GK102807940SQ20121031505
公开日2012年12月5日 申请日期2012年8月31日 优先权日2012年8月31日
发明者叶长东 申请人:叶长东