专利名称：一种促进2-酮基- l-古龙酸高效生产的方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵工程领域，具体涉及ー种在发酵过程中通过连续添加D-核糖母液来促进2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法。
背景技术：
维生素C (V。)是ー种水溶性维生素，又名L-抗坏血酸，能參与体内多种羟化反应和氧化还原反应，是ー类重要的细胞代谢氧化还原化合物，在生物体中起着必不可少的生理作用。20世纪70年代初，尹光琳等筛选出了可以直接将L-山梨糖转化为合成维生素C的重要前体2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)的混合菌种一巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和普通生酮古龙酸菌(Ketogulonigenium sp.),发明了维生素C ニ步发酵法。该方法通过两步发酵大大筒化了莱氏法生产维生素C的合成路线，具有糖酸转化率高的突出优势，目前国内生产厂家生产维生素C都采用ニ步发酵法。第二步混菌发酵的发酵水平决定了ニ步发酵法的发酵水平。在目前维生素C的生产企业中，发酵的エ艺路线和反应器的改造研究没有大的突破，因此为了提高发酵水平和产能，需要促进菌系高产。D-核糖是ー种五碳糖，存在于所有活细胞中，通过影响代谢起作用，是生物体内遗传物质核糖核酸(mRNA、tRNA、rRNA和5 SRNA等各种RNA)的碳水化合物组成部分，它也是若干辅酶和维生素的组成部分，在生物体内通常与磷酸共同转运，具有十分重要的生理作用。D-核糖是ー种单糖，具备一般单糖的化学性质，极易被细胞所利用。
发明内容
本发明目的在于提供一种促进2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，该方法产率高，且发酵周期短，可显著促进2-KLG的高效生产。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案
一种促进2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，包括发酵培养，其以L-山梨糖为发酵培养基的碳源进行发酵培养，在发酵过程中添加O. 5 一 10% (重量体积百分比，下同)D-核糖母液，优选的添加量为5%。本发明所用D-核糖母液来自郑州拓洋生物工程有限公司，编号为DR10701。该D-核糖母液是生产D-核糖的副产品，是ー种粘稠、红褐色、呈半流动的物体，其主要成分为D-核糖。采用D-核糖母液作为添加物使用，可充分利用它所含的主要成分D-核糖促进生产菌产酸，价格低廉，其二次循环再利用可进ー步提升其产品附加值。菌株普通生酮古龙酸菌(KetoguLonicigenium vuLgare)和巨大芽孢杆菌(BaciLLus megaterium)采用市售普通产品即可,本发明所用菌株购自中原制药厂，产品编号分别为TY92002和TY92003。具体的，所述发酵培养基中含有如下重量体积百分比的物质L-山梨糖8 一13. 5%、玉米浆 O. 5 - 2%、尿素 O. 02 — 2%, KH2PO4 O. 05 — I. 5%, MgSO4 · 7H20 O. 01 — I. 0%、泡敌O. 02 一 O. 08% ;灭菌前培养基的pH为6. O — 7. 5。
较好的，在发酵5 — 10小时开始连续添加D-核糖母液。发酵培养的温度为27 — 32°C，优选为29. 5°C。发酵培养的pH为5. 0 一 8. 0，优选为7. O。可通过流加碱来调控pH，常用的碱有氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾等。发酵培养的通气量为0. 2 — I. 5v/v/m，优选为0. 8 v/v/m。为避免污染，本发明发酵方法中发酵容器的压カ以維持在0. 02MPa以上为宜。本发明发酵培养基中，所用玉米浆中干物质质量百分含量为40%左右。若使用其它浓度的玉米浆，可进行相应计算后确定其培养基的组成。泡敌的量只要控制培养基中的泡沫量适宜即可。在发酵过程中，比较优选的技术方案为将D-核糖母液与部分L-山梨糖配成溶液，先进行灭菌(灭菌温度为80 — 110°C，优选100°C)，然后一起流加。 本发明中所指的质量体积百分比都是指每100毫升溶液中所含溶质的克数。具体的，本发明采用连续流加含D-核糖母液的L-山梨糖溶液的エ艺。用混菌斜面(普通生酮古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌斜面)接种摇瓶培养基中，29. 5°C、200rpm摇床振荡培养18 — 24小吋。将混菌摇瓶种液按10%接种量接入5L种子罐，在温度29. 5°C、转速400rpm、通气量0. 5v/v/m的条件下进行培养，当其产酸彡5g じ1时，将种子培养液按5 — 10%接种量通过预先灭菌并冷却的无菌接种管道用压カ差接入50L发酵罐中培养。初始L-山梨糖的浓度为15 — 30g じ1，发酵5 — 10小时后开始流加由D-核糖母液与补糖L-山梨糖组成的混合液(经低灭)，控制发酵液中L-山梨糖的浓度为10 — 30g じ1，当发酵液残糖彡0. 6 g じ1时，ニ步发酵结束。本发明エ艺包括在发酵容器中培养能够利用L-山梨糖发酵转化2-酮基-L-古龙酸的微生物，向发酵容器中一次性或连续加入含有D-核糖母液的L-山梨糖溶液，在相应的温度、pH、通气量等条件下培养，发酵液达到相应的指标后从所述的容器中放出并从中回收2-酮基-L-古龙酸。本发明通过在第二步混菌发酵中连续添加D-核糖母液来促进普通生酮古龙酸菌(KetoguLonicigenium vuLgare)和巨大芽抱杆菌(BaciLLus megaterium)混合菌系的菌体生长，刺激菌体各种酶的活性，提高糖酸转化率，从而促进2-酮基-L-古龙酸的高效生产，缩短发酵周期。该方法可显著促进2-KLG高效生产，产率高，且发酵周期短。
具体实施例方式以下以通过优选实施例对本发明エ艺作进ー步的详细说明，但本发明的保护范围并不局限于此。下述各实施例中用到的相关培养基组成如下
种子/摇瓶培养基L-山梨糖2. 0%(重量体积百分比，下同)，玉米浆0. 3%，牛肉膏0. 2%，酵母膏 0. 5%，蛋白胨 I. 0%，尿素 0. 1%，KH2PO4 0. 1%，MgSO4 7H20 0. 01%, CaCO3 0. 1%，泡敌
0.05% ;灭菌前培养基 pH 6.8。118 — 120°C，灭菌 20 — 30min。发酵培养基L_山梨糖8 — 13. 5% (其中15%作为底料，85%作为补料)，玉米浆
1.0%，尿素 0. 1%, KH2PO4 0. 1%, MgSO4 *7H20 0. 04%，泡敌 0. 05% ;灭菌前培养基 pH6. 5。118 —120°C，灭菌30min。作为底料的L-山梨糖在发酵罐内90°C低灭，并与冷却的玉米浆于38°C混合。作为补料的L-山梨糖与D-核糖母液混合后装入补料瓶90°C低灭，D-核糖母液的添加量控制在0. 5 - 10%。
对照例I
一种促进2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，其包括如下步骤
I)将混菌斜面(普通生酮古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌斜面)接种摇瓶培养基中，于29. 5°C、200rpm摇床振荡培养18小吋。将混菌摇瓶种液按10%接种量接入5L种子罐，在温度29. 5°C、转速400rpm、通气量0. 5v/v/m的条件下进行培养，当其产酸量彡5g じ1时(古龙酸含量測定采用碘量法，该法为本领域的常规方法)，将种子培养液按5%的接种量通过预先灭菌并冷却的无菌接种管道用压カ差接入50L发酵罐中进行发酵培养。2)发酵培养在50L自控发酵罐中进行，L-山梨糖的总浓度为10%。将前述培养好的种液接入约20L发酵培养基中，初始L-山梨糖的浓度为20. 5 g じ1，发酵5h后开始流加L-山梨糖，控制流加速度以维持发酵液中L-山梨糖含量在20 g じ1左右。发酵液pH采用流加碱的方式控制在6. 8左右，发酵38h流加L-山梨糖结束。发酵终点2-KLG浓度达到90. 15g じ1，发酵周期49h，发酵转化率(mol/mol)达90. 22%。 对照例2
一种促进2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，其包括如下步骤
I)将混菌斜面(普通生酮古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌斜面)接种摇瓶培养基中，于29. 5°C>200rpm摇床振荡培养24小吋。将混菌摇瓶种液按10%接种量接入5L种子罐，在温度29. 5°C、转速400rpm、通气量0. 5v/v/m的条件下进行培养，当其产酸量彡5g じ1时，将种子培养液按10%的接种量通过预先灭菌并冷却的无菌接种管道用压カ差接入50L发酵罐中进行发酵培养。2)发酵培养在50L自控发酵罐中进行，L-山梨糖的总浓度为13. 5%。将前述培养好的种液接入约20L发酵培养基中，初始L-山梨糖的浓度为20. 5 g じ1，发酵5h后开始流加L-山梨糖，控制流加速度以维持发酵液中山梨糖含量在20 g じ1左右。发酵液pH采用流加碱的方式控制在7. 0左右，发酵47h流加糖结束。发酵终点2-KLG浓度达到122. 15g じ1，发酵周期60h,发酵转化率(mol/mol)达90. 48%。实施例I
一种促进2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，其包括如下步骤
1)步骤I同对照例I;
2)发酵培养在50L自控发酵罐中进行，L-山梨糖的总浓度为10%。将前述培养好的种液接入约20L发酵培养基中，初始L-山梨糖的浓度为20. 5 g じ1，D-核糖母液添加量为0.5%。将D-核糖母液与作为补料的L-山梨糖配成溶液并消好后，采用流加方式加入。于发酵5h开始流加由L-山梨糖与D-核糖母液组成的混合液，控制流加速度以维持发酵液中L-山梨糖含量在20 g じ1左右。发酵液pH采用流加碱的方式控制在6. 8左右，发酵35h流加糖结束。发酵终点2-KLG浓度达到92. 07 g じ1，发酵周期45h，发酵转化率(mol/mol)达 92. 15%。实施例2
一种促进2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，其包括如下步骤
1)步骤I同对照例2；
2)发酵培养在50L自控发酵罐中进行，L-山梨糖的总浓度为13.5%。将前述培养好的种液接入约20L发酵培养基中，初始L-山梨糖的浓度为20. 5 g じ1，D-核糖母液添加量为5%。将D-核糖母液与作为补料的L-山梨糖配成溶液并消好后，采用流加方式加入。于发酵5h开始流加由L-山梨糖与D-核糖母液组成的混合液，控制流加速度以维持发酵液中L-山梨糖含量在20 g じ1左右。发酵液pH采用流加碱的方式控制在7.0左右，发酵42h流加糖结束。发酵终点2-KLG浓度达到131.2 g じ1，发酵周期52h，发酵转化率(mol/mol)达 97. 18%。实施例3
一种促进2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，其包括如下步骤
1)步骤I同对照例2；
2)发酵培养在50L自控发酵罐中进行，L-山梨糖的总浓度为13.5%。将前述培养好的 种液接入约20L发酵培养基中，初始L-山梨糖的浓度为20. 5 g じ1，D-核糖母液添加量为10%。将D-核糖母液与作为补料的L-山梨糖配成溶液并消好后，采用流加方式加入。于发酵5h开始流加由L-山梨糖与D-核糖母液组成的混合液，控制流加速度以维持发酵液中L-山梨糖含量在20 g じ1左右。发酵液pH采用流加碱的方式控制在7.0左右，发酵41h流加糖结束。发酵终点2-KLG浓度达到131. 15g じ1 ，发酵周期51h，发酵转化率(mol/mol)达 97. 14%。
权利要求
1.一种促进2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，包括发酵培养，其特征在于，以L-山梨糖为发酵培养基的碳源进行发酵培养，在发酵过程中添加O. 5 - 10% D-核糖母液。
2.如权利要求I所述促进2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，其特征在于，所述发酵培养基中含有如下重量体积百分比的物质=L-山梨糖8 - 13. 5%、玉米浆O. 5 - 2%、尿素O.02 — 2%, KH2PO4 O. 05 — I. 5%, MgSO4 · 7H20 O. 01 — I. 0%、泡敌 O. 02 — O. 08% ;灭菌前培养基的pH为6. O - 7.5。
3.如权利要求I或2所述促进2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，其特征在于，在发酵5 — 10小时开始连续添加D-核糖母液。
4.如权利要求3所述促进2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，其特征在于，D-核糖母液的添加量为5%。
5.如权利要求3所述促进2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，其特征在于，发酵培养的温度为27 — 32°C。
6.如权利要求5所述促进2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，其特征在于，发酵培养的温度为29. 5°C。
7.如权利要求3所述促进2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，其特征在于，发酵培养的 pH 为 5. O — 8. O。
8.如权利要求7所述促进2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，其特征在于，发酵培养的pH为7. O。
9.如权利要求3所述促进2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，其特征在于，发酵培养的通气量为O. 2 — I. 5v/v/m。
10.如权利要求9所述促进2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，其特征在于，发酵培养的通气量为O. 8 v/v/m。
全文摘要
本发明属于微生物发酵工程领域，具体涉及一种促进2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，其以L-山梨糖为发酵培养基的碳源进行发酵培养，通过在发酵过程中添加0.5－10%D-核糖母液来实现。该方法利用普通生酮古龙酸菌(KetoguLonicigeniumvuLgare)和巨大芽孢杆菌(BaciLLusmegaterium)混合菌系为生产菌株，通过在发酵过程中添加D-核糖母液促进菌体生长，进而促进2-酮基-L-古龙酸高效生产，缩短发酵周期。试验结果表明，在二步发酵过程中流加5%的D-核糖母液，发酵周期从60h缩短至52h，发酵终点2-KLG浓度由122.15g·L-1提高到131.2·L-1，发酵转化率(mol/mol)从90.48%提高到97.18%。
文档编号C12P39/00GK102851348SQ20121031474
公开日2013年1月2日 申请日期2012年8月30日 优先权日2012年8月30日
发明者王敬臣, 史小利, 仲平, 崔凤霞, 黄惠英, 闫世梁, 史立军, 肖媛, 张生克, 宋向军, 刘银霞, 朱腾跃, 王新华, 秦天苍 申请人:郑州拓洋实业有限公司