专利名称：一种快速启动铁氧化菌活性的细胞培养方法
技术领域：
本发明涉及一种快速启动铁氧化菌活性的细胞培养方法。
背景技术：
铁氧化菌是具有重要工业应用价值的微生物，能够通过氧化酸性环境中的Fe2+、各种还原性硫化物等获得维持其生长的能量，常见的铁氧化菌有氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、氧化亚铁钩端螺旋菌(Leptospirillumferrooxidans)、嗜铁钩端螺旋菌(Leptospirillumfer riphium)、嗜热氧化亚铁钩端螺旋菌(Leptospirillumthermoferrooxidans)、固氮氧化亚铁钩端螺旋菌(Leptospirillumferrodiazotrophum)等,在湿法冶金、脱硫、重金属污染的治理、酸性矿坑废水的处理等领域有着重要的应用价值。在实验室培养和工程应用过程中，铁氧化菌以菌液的形式接种到新的培养基或反应堆等环境后，往往存在适应时间长，细胞活性恢复慢等问题，特别是工程应用过程中，细胞活性恢复的速度，直接影响到生产的效率和质量。对此，常规的方法是通过改善微生物的外部生长条件，调控保持适宜的温度、pH、通气量、接种量等来获得最佳的细胞活性启动速度和培养效果。例如，Acidithiobacillusferrooxidans菌液通常以10%的体积比接种到新的9K培养基,在适宜的初始pH(2. O左右)、温度(30° C左右)下，通气或震荡培养。在这种适宜的pH值和温度下，细菌能正常生长，在一定程度上可缩短细胞的迟缓期，提高生产效率。尽管改善微生物的外部生长条件，能在一定程度上缩短细胞的迟缓期，但其铁氧化活性启动速度仍受到一定的限制。Acidithiobacillusferrooxidans菌以10%的体积比接种到新的培养基，在初始pH 2. O、温度30° C下培养，一般仍需要15-30h的迟缓期，其氧化活性仍然无法较好地满足工业应用，特别是生物脱硫、生物湿法冶金等应用过程中，由于细胞活性较慢的启动速度，极大地影响了反应效率和效果。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术缺陷，提出一种快速启动铁氧化菌活性的细胞培
养方法。本发明通过以下技术方案实现其技术目的菌液中的Fe3+离子对铁氧化菌具有强烈的抑制作用，本技术发明，利用还原剂将铁氧化菌菌液中对微生物有抑制作用的Fe3+离子还原，然后再接种到新鲜的培养基或反应堆，或者将菌液接种到新鲜的培养基、反应堆以后，利用还原剂将铁氧化菌菌液中对微生物有抑制作用的Fe3+离子还原，调节反应体系的酸碱度至合适数值，再在5-35° C温度下通空气或摇床进行细胞培养。本发明提供一种快速启动铁氧化菌活性的细胞培养方法，该方法为利用还原剂将具有亚铁氧化活性的铁氧化菌菌液中对微生物有抑制作用的Fe3+离子还原，调整培养体系的离子构成，然后再在5-35° C温度下通空气进行细胞培养或摇床进行细胞培养。
上述方法中，所述的具有亚铁氧化活性的铁氧化菌优选为氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)> 氧化亚铁钩端螺旋菌(Leptospirillumferrooxidans)、嗜铁钩端螺旋菌(Leptospirillumferriphium)、嗜热氧化亚铁钩端螺旋菌(Leptospirillumthermoferrooxidans)或固氮氧化亚铁钩端螺旋菌(Leptospirillumferrodiazotrophum)。上述提及的菌种,可以在中国工业微生物菌种保藏管理中心(ChinaCenter of Industrial Culture Collection, CICC)、中国典型培养物保藏中心(ChinaCenter of Type Culture Collection, CCTCC)等菌种保藏中心购得。还原剂优选为亚硫酸铵、亚硫酸钾、硫化钠、铁粉、硫化氢、亚硫酸钠中的任何一种；还原剂的用量优选为O. 02-0. 5mol/L，最优选的加入量为略高于菌液中Fe3+离子摩尔浓度的二分之一。 菌液的接种量优选为体积比1%-50%。具体地，本发明解决其技术问题所采用的具体方法步骤是 (I)取O. 1-50L的具有亚铁氧化活性的铁氧化菌菌液，按照O. 02-0. 5mol/L量加入亚硫酸铵、亚硫酸钾、硫化钠、铁粉、硫化氢、亚硫酸钠中的任何一种还原剂，最佳加入量为略高于菌液中Fe3+离子摩尔浓度的二分之一。(2)轻轻震荡,使还原剂反应完全,用稀硫酸、氢氧化钠、氨水等调酸碱性,使其恢复到 pH I. 0-3. O。(3)将步骤(2)得到的菌液按照体积比1%_50%接种到新的液体培养基或反应堆中，5-35° C温度下，通空气进行细胞培养或摇床进行细胞培养。另外，本发明解决其技术问题也可采用以下具体方法步骤(I)取O. 1-50L的具有亚铁氧化活性的铁氧化菌菌液，按照体积比1%_50%接种到新的液体培养基或反应堆中。(2)按照O. 02-0. 5mol/L量加入亚硫酸铵、亚硫酸钾、硫化钠、铁粉、硫化氢、亚硫酸钠中的任何一种还原剂，最佳加入量为反应体系中Fe3+离子摩尔浓度的二分之一。(3)使还原剂反应完全,用稀硫酸、氢氧化钠或氨水等调酸碱性,使其恢复到pH
I.0-3. 0，然后5-35° C温度下，通空气进行细胞培养或摇床进行细胞培养。本发明方法中涉及的新的液体培养基为(NH4)2S043g/l，KCl O. lg/1，K2HPO4O. 5g/1，MgSO4 · 7H20 0. 5g/l，Ca(NO3)2 · 4H20 0. 01g/l，10_90g/lFeS04 · 7H20，用稀硫酸、氢氧化钠、氨水等调酸碱性，使其PH I. 0-3. O。本发明的有益效果是利用还原剂，将反应启动伊始体系中对微生物有抑制作用的Fe3+离子还原，使其还原成可为细胞生长提供能量的Fe2+，解决了反应体系，特别是新接种的反应体系中Fe3+对微生物的抑制作用，从而更快地启动铁氧化菌的反应活性，实现了连续、高效地细胞培养和反应过程，大大提高了生产效率，进一步推动了铁氧化菌实验室培养以及生物脱硫、湿法冶金、污染治理等工业领域的规模生产和应用。
具体实施例方式以下结合实施例详细地说明本发明。实施方案为便于更好的理解本发明，但并非对本发明的限制。实施例I :
配制新的液体培养基(NH4)2S043g/l，KCl O. lg/1，K2HPO4O. 5g/l，MgSO4 · 7H200. 5g/l，Ca (NO3) 2 ·4Η20 0. Olg/1,44. 5g/l FeSO4 · 7H20，用稀硫酸调节 pH 到 2. 0。取 100ml已用培养基培养好的Acidithiobacillusferrooxidans菌液,加入铁粉O. 45g左右,轻轻震荡，使菌液中的Fe3+离子全部还原成Fe2+，用稀硫酸调节pH到2. 0，然后将该菌液按照10%体积比，即IOOml菌液接种到900ml新配制的液体培养基中，在30° C左右通空气或恒温摇床培养，6-10小时，细胞显示出较明显的氧化活性，并开始生长。实施例2 配制新的液体培养基(NH4)2S043g/l，KCl O. lg/1，K2HPO4O. 5g/l，MgSO4 · 7H200. 5g/l, Ca(NO3)2 · 4H20 0. 01g/l，40g/l FeSO4 · 7H20，用稀硫酸调节 pH 到 I. 7。取 200ml已培养好的Leptospirillum ferrooxidans菌液，将菌液接种到1800ml新配制的液体培 养基中，加入亚硫Ife纳2g左右，轻轻震汤，使之反应完全，用稀硫Ife调节pH到1.7,然后，在35° C左右通气或恒温摇床培养，5-10小时，细胞显示出较明显的氧化活性，40-50小时，Fe2+离子几乎全部被氧化。
权利要求
1.一种快速启动铁氧化菌活性的细胞培养方法，其特征在于，该方法包括利用还原剂将具有亚铁氧化活性的铁氧化菌菌液中对微生物有抑制作用的Fe3+离子还原，调整培养体系的离子构成，然后再在5-35° C温度下通空气进行细胞培养或摇床进行细胞培养。
2.根据权利要求I所述的一种快速启动铁氧化菌活性的细胞培养方法，其特征在于，所述的具有亚铁氧化活性的铁氧化菌优选为氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans)、氧化亚铁钩端螺旋菌(Leptospirillum ferrooxidans)、嗜铁钩端螺旋菌(Leptospirillumferriphium)、嗜热氧化亚铁钩端螺方定菌(Leptospirillumthermoferrooxidans)或固氮氧化亚铁钩端螺旋菌(Leptospirillumferrodiazotrophum)。
3.根据权利要求I所述的一种快速启动铁氧化菌活性的细胞培养方法，其特征在于，所述的还原剂优选为亚硫酸铵、亚硫酸钾、硫化钠、铁粉、硫化氢、亚硫酸钠中的任何一种。
4.根据权利要求I或3所述的一种快速启动铁氧化菌活性的细胞培养方法，其特征在于，所述的还原剂的用量优选为O. 02-0. 5mol/L。
5.根据权利要求I或3所述的一种快速启动铁氧化菌活性的细胞培养方法，其特征在于，所述的还原剂的加入量为略高于菌液中Fe3+离子摩尔浓度的二分之一。
6.根据权利要求I所述的一种快速启动铁氧化菌活性的细胞培养方法，其特征在于，所述的菌液的接种量优选为体积比1%_50%。
7.根据权利要求I所述的一种快速启动铁氧化菌活性的细胞培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤 (1)取O.1-50L的具有亚铁氧化活性的铁氧化菌菌液，按照O. 02-0. 5mol/L量加入亚硫酸铵、亚硫酸钾、硫化钠、铁粉、硫化氢、亚硫酸钠中的任何一种还原剂； (2)轻轻震荡，使还原剂反应完全，用稀硫酸、氢氧化钠或氨水等调酸碱性，使其恢复到pH I. 0-3. O ； (3)将步骤(2)得到的菌液按照体积比1%_50%接种到新的液体培养基或反应堆中，5-35° C温度条件下通空气进行细胞培养或摇床进行细胞培养。
8.根据权利要求I所述的一种快速启动铁氧化菌活性的细胞培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤 (1)取O.1-50L的具有亚铁氧化活性的铁氧化菌菌液，按照体积比1%_50%接种到新的液体培养基或反应堆中； (2)按照O.02-0. 5mol/L量加入亚硫酸铵、亚硫酸钾、硫化钠、铁粉、硫化氢、亚硫酸钠中的任何一种还原剂； (3)使还原剂反应完全,用稀硫酸、氢氧化钠或氨水调酸碱性,使其恢复pHI. 0-3. O,然后5-35° C温度条件下通空气进行细胞培养或摇床进行细胞培养。
全文摘要
本发明涉及一种快速启动铁氧化菌活性的细胞培养方法。该方法是将铁氧化菌接种到新鲜的培养基后，利用还原剂将培养基中对微生物有抑制作用的离子全部还原，调整接种菌株后培养基的离子构成，然后再在一定温度下通空气或摇床进行细胞培养，该方法技术操作简单，可有效缩短接种细胞后的延滞期，快速启动铁氧化菌的活性，便于实验室操作及工业连续生产，提高生产效率。
文档编号C12N1/20GK102796689SQ20121032223
公开日2012年11月28日 申请日期2012年9月4日 优先权日2012年9月4日
发明者王玉建, 李大平, 陶勇, 何晓红, 王晓梅, 张礼霞 申请人:中国科学院成都生物研究所