专利名称：一种枯草芽孢杆菌、利用此菌制备的微生物肥料及其制备方法以及此微生物肥料的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于农用微生物制剂领域，具体涉及一种新的枯草芽孢杆菌及利用此菌制备的微生物肥料及其制备方法，以及此微生物肥料的应用。
背景技术：
甜瓜枯萎病(Fusariumwilt)是危害甜瓜生产的重要土传病害，常午发病率为10% -40%，轻者造成植株生长衰弱、结瓜小而少，重者全株枯死。此病是一种世界性的甜瓜病害，遍布整个欧洲以及美洲、亚洲、非洲等地区，危害叶片、茎蔓和果实。发病初期仅有I或2个蔓失水萎蔫，之后根系变褐腐朽，纵剖根茎部可见维管束已褐，引起整株萎 蔫枯死。甜瓜枯萎病由半知菌亚门，丝孢纲，瘤座孢科，镰孢霉属的尖镰孢菌甜瓜专化型(Fusariumaxysporum(Schi.) f. sp. melonisSnyder et Hansen)引起的一种土壤传播，根部侵入,维管束寄生的系统病害。我国新疆是甜瓜(Cucumis melonL.)种植面积最大且品种资源最丰富的地区，但枯萎病的发生严重影响着甜瓜的品质和产量。因枯萎病为土传病害，药剂防治相对困难，并且由于长期用药，病原菌逐渐产生抗药性，且防治效果日益降低，造成土壤的污染。鉴于化学防治对环境的污染和生态平衡，甜瓜枯萎病的生物防治越来越被重视。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtiles)是一类好氧内生芽孢的革兰氏阳性细菌,根据菌落形态生理生化特性以及形成芽孢等特点该菌命名为枯草芽孢杆菌。在自然界中广泛存在，不仅在土壤、植物根际、体表等外界环境中广泛存在，同时还是植物体内常见的内生细菌对人畜无毒无害，不污染环境，具有显著的抗菌活性和极强的抗逆能力。枯草芽孢杆菌生长快、营养、简单，能产生耐热抗逆的芽孢，其芽孢具有抗逆性强、利于保藏的特点，又能忍受极端的外部环境，而长期存活，可以制成粉剂、可湿性粉剂等各种剂型或与化学农药混用而不失活，因此有利于生防菌剂的生产、剂型加工及在环境中的存活定殖与繁殖而且批量生产工艺简单成本也较低，施用方便，储存期长，是一种理想的生防微生物。国内外学者在枯草芽孢杆菌防治植物病害方面进行了大量研究，一些枯草芽孢杆菌优势菌株已经用于防治植物病害应用中。研究认为枯草芽孢杆菌主要通过以下三种方式提高植物对病原菌的抗性(I)可以在植物根际体表或体内及土壤中快速大量繁衍和定殖，有效地排斥阻止和干扰植物病原微生物在植物上的定殖与侵染从而达到抑菌和防病的效果；(2)产生的抗菌物质，对病原菌有一定的杀灭功效；(3)可产生促植物生长的物质，增强植物和根系的生长发育，增强了植物自身的抗病性，从而间接地减少病害发生。如专利号为CN1934241B的中国专利报道了一种具有防治植物病害的拮抗活性的枯草芽孢杆菌菌株，发明人开发了一种可广泛抗植物病害的、具有强抗真菌活性的新微生物杀真菌剂，其枯草芽孢杆菌EB120显示出防治集中植物病害的拮抗活性，包括大麦和黄瓜白粉病、辣椒炭疽病、稻瘟病、番茄灰霉病和小麦叶锈病，显示出良好的应用前景，但对甜瓜枯萎病有无效果尚未报道。又如专利号CN100404664C的专利报道了一株作物青枯病生防枯草芽孢杆菌菌株，该菌株能够抑制青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的生长，并产生拮抗蛋白，可用于作物青枯病防治方面。以上两例主要为枯草芽孢杆菌产生拮抗病菌的物质，拮抗物质直接作用于病菌，达到抗病的功效。而对于枯草芽孢杆菌促生抗病的研究却较少报道。研究内容本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌以及利用此菌制备的微生物肥料及其制备方法，该微生物肥料可用于甜瓜种植，此肥料通过促进甜瓜植株和根系的生长发育，增强甜瓜植株的抗病性，而达到降低甜瓜枯萎病的发病率的目的。
本发明通过以下技术方案实现。本发明涉及一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis G_l),于2012年7月16日在湖北武汉武昌路珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC M 2012287。本发明还涉及一种枯草芽孢杆菌微生物肥料，该微生物肥料由枯草芽孢杆菌CCTCC M 2012287经培养发酵后与硅藻土混合、干燥、粉碎而得。本发明还涉及所述枯草芽孢杆菌微生物肥料的制备方法，其特征在于，由如下方法制备而成I)菌种固体斜面培养将枯草芽孢杆菌CCTCC M 2012287菌种接入固体斜面，在斜面培养基中培养，温度为30-35°C，培养时间16-24小时；2) 一级种子液扩大培养将步骤I)的枯草芽孢杆菌接种到盛有IOOOml-级种子液培养基中摇瓶培养16-24小时，培养温度30-35°C，转速200-300转/分；3) 二级种子液发酵培养按I %接种量将步骤2)种子液接种到200升种子发酵罐中，培养基采用优化培养基，在30-35°C保温培养16-20个小时，同时辅以转速200-300转/分，通气量O. 5-0. 8立方米/分钟，进行发酵培养；4)三级种子液发酵培养按10%的接种量将步骤3)的种子液接种到2000升的大发酵罐中，培养基同步骤3)，进行变温变通气量条件下培养，当菌体芽孢形成率达到75%并有20%形成独立芽孢后，发酵过程结束；5)微生物肥料的制备发酵液与硅藻土按质量比5 2-5 3混合，将混合物置入隧道式干燥设备内，在70°C干热空气下进行3-4小时干燥，当混合物水分小于5%时烘干结束，粉碎后过100目筛并包装，微生物肥料制备完成。本制备方法的优选方案是，所述制备步骤1-4中的培养基均采用以下条件灭菌，灭菌温度121-125°C，15-20分钟。本制备方法的优选方案是，制备步骤4中所述变温变通气量的培养条件为，先30-35°C、通气量O. 5-0. 8立方米/分钟、培养20小时，再升温到37°C、通气量加大到I. O立方米/分钟、再培养10-12小时，辅以转速200-300转/分进行培养。本制备方法的优选方案是，所述制备步骤I)中斜面培养基配方为蛋白胨10g，酵母粉5g,氯化钠IOg,琼脂20g,蒸懼水1000ml,自然pH值。本制备方法的优选方案是，所述制备步骤2)中一级种子液培养基配方为蛋白胨10g，酵母粉5g,氯化钠IOg,蒸懼水1000ml,自然pH值。本制备方法的优选方案是，所述制备步骤3)或4)中，培养基采用优化培养基，培养基配方如下，玉米粉I. 0-2.0%，麸皮O. 1-0. 5 %，酵母粉O. 1-0. 5 %，磷酸氢二铵O. 01-0. 05%，磷酸氢二钠 O. 02-0. 08%，磷酸二氢钾 O. 05-0. 08%，硫酸钠 O. 03-0. 05%，硝酸钠 O. 01-0. 05%，硫酸镁 O. 01-0. 05%，硫酸亚铁 O. 0001-0. 0003%,PH 值调至 7. 0-7. 2。本发明还涉及一种枯草芽孢杆菌微生物肥料的应用，其特征在于，在种植甜瓜过程中，使用上述枯草芽孢杆菌微生物肥料对降低甜瓜枯萎病发病率方面的应用。制备得到的微生物肥料含菌数检测方法为，按照常规的稀释平板法检测微生物肥料中的活芽孢菌数，称取干微生物肥料I. O克，加入99毫升无菌水中，进一步稀释，稀释到每毫升中仅有200-1000个，然后取O. I毫升稀释菌液到无菌的固体培养基平板上，进行涂布，在37°C恒温箱内培养24小时，计算培养皿平板上的菌落数，计数平板重复3次，取计数平板上生长的菌落数的平均值，按以下公式计算微生物肥料中的活菌数
微生物肥料活芽孢数(个/克)=平均每个平板菌落数(个)X IOX样品稀释倍数微生物肥料成品质量要求枯草芽孢杆菌芽孢总含量> 30 X IO8个微生物肥料含水量< 5. 0%微生物肥料细度95%以上可过100目筛孔本发明与现有技术相比的有益效果是，提供了一种新的枯草芽孢杆菌，利用其制备的微生物肥料可促进甜瓜植株和根系的生长发育，其中甜瓜植株的株高、茎粗以及成品甜瓜的瓜宽、瓜长、单重均有明显增加；并且甜瓜的品质有明显提升、营养成分更高；从而增强了甜瓜植株的抗病性，甜瓜枯萎病的发病率降低50-70%，提高了甜瓜产量、种植效益。
具体实施例方式本发明涉及的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis G-1)，已于2012年7月16日在湖北武汉武昌路珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC M 2012287。实施例I通过以下的方法制备本发明降低甜瓜枯萎病发病率的微生物肥料I、菌种固体斜面培养斜面培养基配方为蛋白胨IOg,酵母粉5g,氯化钠IOg,琼脂20g，蒸馏水1000ml，自然pH值，灭菌条件为125 °C、15分钟；将枯草芽孢杆菌CCTCC M2012287菌种接入固体斜面，培养温度为35°C，培养时间16h ；2、一级种子液扩大培养将枯草芽孢杆菌接种到盛有IOOOml —级种子液培养基中摇瓶培养16小时，培养温度35°C，转速250转/分；一级种子液培养基配方为蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，自然pH值，灭菌条件为125°C、15分钟；3、二级种子液发酵培养按1%接种量接种到200升种子发酵罐中，培养基采用优化培养基，培养基配方如下玉米粉I. O %，麸皮O. I %，酵母粉O. I %，磷酸氢二铵O. 01 %，磷酸氢二钠O. 02 %，磷酸二氢钾O. 08 %，硫酸钠O. 03 %，硝酸钠O. 01 %，硫酸镁O. 01 %，硫酸亚铁O. 0001%，PH值调至7. O，灭菌条件为125°C、15分钟；在30°C保温培养20个小时，同时辅以转速250转/分，通气量O. 5立方米/分钟，进行发酵培养；4、三级种子液发酵培养按10%的接种量接种到2000升的大发酵罐中，三级培养基配方同二级培养基配方，培养条件同二级种子液发酵培养，培养时间为20个小时后，升温到37°C、通气量加大到I. O立方米/分钟，再培养12小时，当菌体芽孢形成率达到75%并有20%形成独立芽孢后，发酵过程结束；5、微生物肥料的制备三级种子液与硅藻土按质量比5 3混合，将混合物置入隧道式干燥设备内，在70°C干热空气下进行3-4小时干燥，当混合物水分小于5%时烘干结束，粉碎后过100目筛并包装，微生物肥料制备完成。实施例2通过以下的方法制备本发明降低甜瓜枯萎病发病率的微生物肥料I.菌种固体斜面培养斜面培养基配方为蛋白胨IOg,酵母粉5g,氯化钠IOg,琼脂20g，蒸馏水1000ml，自然pH值，灭菌条件为123 °C、18分钟；将枯草芽孢杆菌CCTCC M2012287菌种接入固体斜面，培养温度为35°C，培养时间16h ； 2. 一级种子液扩大培养将枯草芽孢杆菌接种到盛有IOOOml —级种子液培养基中摇瓶培养20小时，培养温度30°C，300转/分；一级种子液培养基配方为蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，自然pH值，灭菌条件为123°C、18分钟；3. 二级种子液发酵培养按I %接种量接种到200升种子发酵罐中，培养基采用优化培养基，培养基配方如下玉米粉1.5%，麸皮0.5%，酵母粉0.3%，磷酸氢二铵0.05%，磷酸氢二钠O. 05 %，磷酸二氢钾O. 05 %，硫酸钠O. 03 %，硝酸钠O. 01 %，硫酸镁O. 03 %，硫酸亚铁O. 0003%, PH值调至7. 0，灭菌条件为123°C、18分钟；在30°C保温培养20个小时，同时辅以转速200转/分，通气量O. 6立方米/分钟，进行发酵培养；4.三级种子液发酵培养按10%的接种量接种到2000升的大发酵罐中，三级培养基配方同二级培养基配方，培养条件同二级种子液发酵培养，培养时间为20个小时后，升温到37°C、通气量加大到I. O立方米/分钟，再培养10小时，当菌体芽孢形成率达到75%并有20%形成独立芽孢后，发酵过程结束；5.微生物肥料的制备发酵液与硅藻土按质量比2 I混合，将混合物置入隧道式干燥设备内，在70°C干热空气下进行3-4小时干燥，当混合物水分小于5%时烘干结束，粉碎后过100目筛并包装，微生物肥料制备完成。实施例3通过以下的方法制备本发明降低甜瓜枯萎病发病率的微生物肥料I、菌种固体斜面培养斜面培养基配方为蛋白胨IOg,酵母粉5g,氯化钠IOg,琼脂20g，蒸馏水1000ml，自然pH值，灭菌条件为121°C、20分钟；将枯草芽孢杆菌CCTCC M2012287菌种接入固体斜面，培养温度为30°C，培养时间24h ；2、一级种子液扩大培养将枯草芽孢杆菌接种到盛有IOOOml —级种子液培养基中摇瓶培养16小时，培养温度35°C，转速300转/分；一级种子液培养基配方为蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，自然pH值，灭菌条件为121°C、20分钟；3、二级种子液发酵培养按1%接种量接种到200升种子发酵罐中，培养基采用优化培养基，培养基配方如下玉米粉2.0%，麸皮O. 1%，酵母粉O. I%，磷酸氢二铵O. 05%,磷酸氢二钠O. 08 %，磷酸二氢钾0.05%，硫酸钠0.05%，硝酸钠0.05%，硫酸镁0.05%，硫酸亚铁O. 0001%，PH值调至7. 2，灭菌条件为121°C、20分钟；在35°C保温培养16个小时，同时辅以转速300转/分，通气量O. 8立方米/分钟，进行发酵培养；4、三级种子液发酵培养按8%的接种量接种到2000升的大发酵罐中，三级培养基配方同二级培养基配方，培养条件同二级种子液发酵培养，培养时间为20个小时后，升温到37°C、通气量加大到I. O立方米/分钟，再培养10小时，当菌体芽孢形成率达到75%并有20%形成独立芽孢后，发酵过程结束；5、微生物肥料的制备发酵液与硅藻土按质量比2 I混合，将混合物置入隧道式干燥设备内，在70°C干热空气下进行3-4小时干燥，当混合物水分小于5%时烘干结束，粉碎后过100目筛并包装，微生物肥料制备完成。实施例4通过以下的方法制备本发明降低甜瓜枯萎病发病率的微生物肥料I、菌种固体斜面培养斜面培养基配方为蛋白胨IOg,酵母粉5g,氯化钠IOg,琼脂20g，蒸馏水1000ml，自然pH值；将枯草芽孢杆菌CCTCC M 2012287菌种接入固体斜面，培养温度为35°C，培养时间20h ； 2、一级种子液扩大培养将枯草芽孢杆菌接种到盛有IOOOml —级种子液培养基中摇瓶培养24小时，培养温度30°C，转速200转/分；一级种子液培养基配方为蛋白胨10g，酵母粉5g,氯化钠IOg,蒸懼水IOOOml,自然pH值；3、二级种子液发酵培养按1%接种量接种到200升种子发酵罐中，培养基采用优化培养基，培养基配方如下玉米粉1.0%，麸皮0.3%，酵母粉0.5%，磷酸氢二铵0.05%，磷酸氢二钠O. 05 %，磷酸二氢钾O. 05 %，硫酸钠O. 03 %，硝酸钠O. 01 %，硫酸镁O. 03 %，硫酸亚铁O. 0003%，PH值调至7. O ;在30°C保温培养20个小时，同时辅以转速300转/分，通气量O. 8立方米/分钟，进行发酵培养；4、三级种子液发酵培养按10%的接种量接种到2000升的大发酵罐中，三级培养基配方同二级培养基配方，培养条件同二级种子液发酵培养，培养时间为20个小时后，升温到37°C、通气量加大到I. O立方米/分钟，再培养12小时，当菌体芽孢形成率达到75%并有20%形成独立芽孢后，发酵过程结束；5、微生物肥料的制备发酵液与硅藻土按质量比5 2混合，将混合物置入隧道式干燥设备内，在70°C干热空气下进行3-4小时干燥，当混合物水分小于5%时烘干结束，粉碎后过100目筛并包装，微生物肥料制备完成。实施例5盆栽试验与田间试验验证I、盆栽试验设置盆栽试验，种植甜瓜，设置2个处理，处理I为在甜瓜植株双叶期将本发明制备的枯草芽孢杆菌肥料稀释100倍，采用罐根方式，每株苗施入稀释液30ml ;处理2为施入30ml清水对照，盆栽培养15天，测定甜瓜苗的株高、根长、茎粗、根干物质量、地上部分干物质量。如表I所示，试验结果表明稀释100倍的枯草芽孢杆菌肥料能明显提高根长，增加幅度16. 03%，与对照比较达到极显著差异(P<0.01);茎粗增加幅度6. 54%，与对照比较达到显著性差异(P < O. 05);根干重增幅达36. 4%，达到极显著性差异(P < O. 01);枯草芽孢杆菌肥料处理的冠根比远小于对照，这说明枯草芽孢杆菌肥料处理能促进甜瓜根系的生长。表I枯草芽孢杆菌肥料对甜瓜植株苗期生长的影响
权利要求
1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis G-I)，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌于2012年7月16日在湖北武汉武昌路珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC M 2012287。
2.一种枯草芽孢杆菌微生物肥料，其特征在于，该微生物肥料由枯草芽孢杆菌CCTCC M2012287经培养发酵后与硅藻上混合、干燥、粉碎而得。
3.权利要求2所述枯草芽孢杆菌微生物肥料的制备方法，其特征在于，由如下方法制备而成 1)菌种固体斜面培养将枯草芽孢杆菌CCTCCM 2012287菌种接入固体斜面，在斜面培养基中培养，温度为30-35°C，培养时间16-24小时； 2)一级种子液扩大培养将步骤I)的枯草芽孢杆菌接种到盛有IOOOml-级种子液培养基中摇瓶培养16-24小时，培养温度30-35°C，转速200-300转/分； 3)二级种子液发酵培养按I %接种量将步骤2)种子液接种到200升种子发酵罐中，培养基采用优化培养基，在30-35°C保温培养16-20个小时，同时辅以转速200-300转/分，通气量O. 5-0. 8立方米/分钟，进行发酵培养； 4)三级种子液发酵培养按10%的接种量将步骤3)的种子液接种到2000升的大发酵罐中，培养基同步骤3)，进行变温变通气量条件下培养，当菌体芽孢形成率达到75 %并有20%形成独立芽孢后，发酵过程结束； 5)微生物肥料的制备发酵液与硅藻土按质量比5 2-5 3混合，将混合物置入隧道式干燥设备内，在70°C干热空气下进行3-4小时干燥，当混合物水分小于5%时烘干结束，粉碎后过100目筛并包装，微生物肥料制备完成。
4.根据权利要求3枯草芽孢杆菌微生物肥料的制备方法，其特征在于，所述制备步骤1-4中的培养基均采用以下条件灭菌，灭菌温度121-125°C，15-20分钟。
5.根据权利要求3枯草芽孢杆菌微生物肥料的制备方法，其特征在于，制备步骤4中所述变温变通气量的培养条件为，先30-35°C、通气量O. 5-0. 8立方米/分钟、培养20小时，再升温到37°C、通气量加大到I. O立方米/分钟、再培养10-12小时，辅以转速200-300转/分进行培养。
6.根据权利要求3枯草芽孢杆菌微生物肥料的制备方法，其特征在于，制备步骤I)中斜面培养基配方为蛋白胨IOg,酵母粉5g,氯化钠IOg,琼脂20g,蒸懼水1000ml,自然pH值。
7.根据权利要求3枯草芽孢杆菌微生物肥料的制备方法，其特征在于，制备步骤2)中一级种子液培养基配方为蛋白胨IOg,酵母粉5g,氯化钠IOg,蒸懼水1000ml,自然pH值。
8.根据权利要求3枯草芽孢杆菌微生物肥料的制备方法，其特征在于，制备步骤3)或4)中，所述优化培养基配方如下，玉米粉1.0-2. 0%，麸皮O. 1-0. 5%，酵母粉O. 1-0. 5%,磷酸氢二铵O. 01-0. 05 %，磷酸氢二钠O. 02-0. 08 %，磷酸二氢钾O. 05-0. 08 %，硫酸钠O.03-0. 05%，硝酸钠 O. 01-0. 05%，硫酸镁 O. 01-0. 05%，硫酸亚铁 O. 0001-0. 0003%，PH 值调至 7. 0-7. 2。
9.一种枯草芽孢杆菌微生物肥料的应用，其特征在于，在种植甜瓜过程中，使用权利要求2所述的微生物肥料对降低甜瓜枯萎病发病率方面的应用。
全文摘要
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，于2012年7月16日在湖北武汉武昌路珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCCM2012287。本发明同时公开了利用此菌制备的微生物肥料及其制备方法以及此微生物肥料在甜瓜种植方面的应用，所述微生物肥料通过促进甜瓜植株和根系的生长发育，增强甜瓜植株的抗病性，而达到降低甜瓜枯萎病的发病率的目的；并且提高了甜瓜的商品瓜产量，且品质有一定的改善。
文档编号C12R1/125GK102888356SQ201210322029
公开日2013年1月23日 申请日期2012年9月3日 优先权日2012年9月3日
发明者葛春辉, 孙九胜, 王新勇, 杨新华, 冯耀祖, 朱莉, 徐万里, 唐光木, 孟凤轩 申请人:新疆农业科学院土壤肥料与农业节水研究所