专利名称：一种rt-pcr法诊断温石棉及人造矿物纤维致肺部病变的引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种引物，尤其涉及一种诊断温石棉及人造矿物纤维所致肺部病变的引物。
背景技术：
石棉是天然纤维状的硅酸盐类矿物质，由于具有耐热、保温、耐磨、电绝缘以及耐化学腐蚀等优良的性能，多年来被广泛应用于石棉水泥、纺织品、绝缘摩擦材料等的制造。石棉种类较多，根据化学组分的不同可分为角闪石石棉(包括青石棉、铁石棉等)和蛇纹石石棉(温石棉)两大类。石棉由于其纤维状的特性，被人体吸入后，附着并沉积在肺部，能够 导致肺纤维化、间皮瘤和胸膜斑等的发生。石棉家族中危害最大的是青石棉，它具有较强的致癌性，在大多数国家已被禁用。而温石棉具有柔软且不耐酸的特性，与坚硬而耐酸碱的角闪石石棉相比，在人体内的持久性较差，易清除出体外，因此其危害相对较小。然而有关温石棉安全性的多项流行病学研究和毒理学研究都提示我们温石棉潜在的生物学危害不容忽视。温石棉接尘工人的肺功能指标(包括FVC、FEVl等)较非接尘人群均有所下降。长时间暴露于低剂量的温石棉可引起胸膜斑的发生，温石棉暴露也可导致胸膜钙化，引起纤维化病变和石棉肺的发生。单纯温石棉暴露能够引起接尘人群肺癌和间皮瘤的高发，温石棉已被认为是间皮瘤发病的主要原因。大量有关哺乳动物的接尘实验证实温石棉能够导致肺部炎症反应、石棉小体的产生以及纤维化病变发生。目前在全世界范围内温石棉的生产和使用已经逐渐遭到限制或禁止，与此同时各国也在积极开展石棉替代品的生产使用、危害及防护措施研究。人造矿物纤维(man-madevitreous fibers, MMVFs)是一类由玻璃、岩石、矿洛或其他经过加工的矿物材料等作为原料生产得到的非晶体结构的纤维状硅酸盐物质，在形态和性能等方面与石棉较为相似，因此也做为石棉替代品广泛应用。人造矿物纤维的生产和应用发展很快，目前常用的包括耐火陶瓷纤维、玻璃纤维、岩棉等，随着近年来的大量生产以及广泛应用，它们对人体健康的危害也引起了人们的广泛关注。早在耐火陶瓷纤维商业化生产后不久就有研究通过体腔注射的方法证实了耐火陶瓷纤维能够引起大鼠体内间皮瘤的发生。长期吸入实验进一步证实耐火陶瓷纤维主要损伤大鼠和仓鼠的肺部组织，吸入3个月后能够观察到巨噬细胞浸润、肺泡外上皮细胞异常增生以及肉芽肿的形成，6个月后可观察到明显的局灶性胸膜纤维化。一些研究小组提供的细胞动力学和生化数据却表明玻璃纤维能够在小鼠和仓鼠体内引起纤维化反应。Takahashi研究小组与Guber等人分别于1996年和2006报道了一例长期吸入玻璃纤维诱发的肺纤维化病变。McConnell等人于1999年进行了一项关于岩棉的致病性研究，通过粉尘吸入实验，观察到仓鼠肺部纤维化现象的出现。呼吸性粉尘可经呼吸道进入肺部引起大量肺泡巨噬细胞游出，这一过程中不仅引发了氧自由基等产生，破坏细胞膜的结构和功能，还可刺激肺泡巨噬细胞、中性粒细胞等分泌各种细胞因子，这些细胞因子可以通过受损的肺泡上皮进入到肺间质，作用于相应的靶细胞从而引起它们的病理改变。当细胞因子作用于成纤维细胞，促使细胞大量增殖，或诱导细胞外基质蛋白表达增强，导致成纤维细胞大量增殖和胶原等细胞外基质蛋白的大量沉积，还可引起肺纤维化的产生。呼吸性粉尘致肺部病变的机制非常复杂，而且潜伏期较长，目前尚无有效的方法对其进行早期评估和早期筛查。近年来microRNA(miRNA)已经成为一类重要基因表达调控分子，具有广泛多样的生物功能。miRNA在线虫中首次被发现，参与幼虫的发育调控。成熟miRNA分子的形成过程包括若干步骤首先通过RNA聚合酶II转录合成原始miRNA (pri-miRNA),经核酸酶Drosha酶切产生具有莖环结构的miRNA前体(pre-miRNA) ；pre-miRNA通过转运子Exportin 5从核内转移到胞质中，经Dicer酶剪切后形成一条成熟的约22个核苷酸组成的小分子RN A，即成熟的miRNA分子。成熟的miRNA与Argonaute蛋白家族的成员组装成核酸蛋白复合体miRNP，通过与靶标mRNA 3’端非翻译区序列结合引起靶标mRNA的降解或翻译抑制。miR-29 家族包括 miR_29a、miR-29b_l、miR-29b_2 和 miR_29c，而大鼠 miR-29b_l和miR-29b-2的序列完全相同，分别位于4号和13号染色体上。miR-29家族成员的靶基因较多，包括与肺纤维化直接相关的I型胶原和III型胶原等多种胶原分子，以及基质金属蛋白酶、血小板衍生生长因子以及骨形态发生蛋白等已证实与肺纤维化密切相关的分子。miR-29已被证实与多种纤维化病变相关，包括肝纤维化、心肌纤维化、肾纤维化以及肺纤维化。体内或体外过表达miR-29能够降低胶原表达量,而抑制miR-29表达则可导致胶原表达量的上升，纤维化病变加剧。miR-29受TGF- β /SMAD信号通路抑制，进一步调控其已知靶基因I型胶原以及其它纤维化相关分子，如整合素、原纤维蛋白等。已有多篇文献指出miR-29可作为纤维化病变潜在的治疗新靶点予以应用。现有研究证实miR-29参与博莱霉素诱导的特发性肺纤维化，将miR-29通过转座子系统导入小鼠体内过表达可减轻其肺组织纤维化程度，同时还可减少炎性细胞的浸润。但是目前有关miR-29与呼吸性粉尘引起的肺部病变之间的关联尚未见报道。随着人们对miRNA认识的不断深入，与之相关的研究手段和技术方法也在不断成熟，日益丰富。在miRNA的定量检测方面，由于成熟miRNA不具备poly (A)尾，且序列很短，常规的oligo d(T)或随机引物不能用于其逆转录反应。日前常用的stem-loop法使用带有茎环结构的逆转录引物合成cDNA，该引物不仅特异性地针对某种miRNA，还能够增加cDNA链的序列长度，便于后续的PCR扩增反应。这种定量检测方法大大简化了各类生物样本中miRNA表达量的检测，降低检测成本，推动了 miRNA在生物医学领域的发展和应用。而miRNA由于其小分子、稳定性强等特点，正逐渐成为临床应用较为理想的生物标志物，而新技术的不断发展也使得miRNA定量检测在特异性和敏感性方面更具优势，因此使用miRNA作为健康危害早期评估和早期筛查的生物标志物具有较好的可行性。
发明内容
本发明提供了一种RT-PCR法诊断温石棉及人造矿物纤维所致肺部病变的引物，利用该引物可以对温石棉致肺部病变进行早期筛查和评估。一种RT-PCR法诊断温石棉及人造矿物纤维所致肺部病变的引物，为引物组A^l物组B或引物组C，每组弓I物包括逆转录弓I物和PCR扩增引物；引物组A:
逆转录弓 I物GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTAACCG ；PCR 扩增引物的上游引物GCGGCGGTAGCACCATCTGAAAT ；引物组B:逆转录引物GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACACT ；PCR 扩增引物的上游引物GCGGCGGTAGCACCATTTGAAATC ；
引物组C:逆转录引物GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTAACCG ；PCR 扩增引物的上游引物GCGGCGGTAGCACCATTTGAAAT ；所有引物组PCR扩增的下游引物为GTGCAGGGTCCGAGGT。miRNA作为一种小分子RNA，在组织及外周血中的表达都具有较好的特异性及稳定性，令其在疾病的诊断和筛查中表现出显著的优势。本发明发现miR-29家族成员在温石棉等纤维粉尘暴露的大鼠肺部表现出显著的表达改变，提出miR-29作为潜在效应生物标志物的可能。本发明通过建立大鼠染尘模型，在大鼠肺组织病理表现的基础上，检测miR-29家族成员在染尘大鼠肺组织中的表达情况。结果表明，miR-29b在6个月的所有纤维粉尘暴露组中都发生表达下调，因此可作为温石棉及人造矿物纤维致肺部病变的潜在效应生物标志物；而miR-29c在3个月和6个月的温石棉暴露组中都表现出表达量显著降低，可用于温石棉致肺部病变的早期筛查。本发明以miRNA定量检测为技术平台，提出扩增小分子RNAmiR-29家族成员的引物，从而实现将miR-29的表达作为温石棉及人造矿物纤维所致肺部病变的效应生物标志物，为温石棉及人造矿物纤维所致肺部病变的诊断和筛查提供了一种有力的检测手段。
图I为对照组大鼠肺组织(X100)切片电镜图。A :HE 染色；B: VG 染色。图2为染尘后3个月温石棉组大鼠肺组织切片电镜图。A HE 染色 X 100 ；B VG 染色 X 100 ；C :电镜观察 X 10000。图3为染尘后3个月人造矿物纤维组大鼠肺组织(X 100)切片电镜图。A HE 染色；B VG 染色；A1 RWS ；A2 GWF ；A3 RFS ；A4 RF ；B1 RF ；B2 =RFS0图4为染尘后6个月人造矿物纤维组和温石棉组大鼠肺组织(X100)切片电镜图。A HE 染色；B VG 染色；A1 AS 组；B1 AS 组；A2 :RFS、B2 =RffS0图5为温石棉及人造矿物纤维暴露大鼠肺组织miR_29a/b/c的表达情况图。A :染尘3个月；B :染尘6个月。
具体实施方式
I、粉尘制备将玻璃纤维、岩棉、耐火陶瓷纤维工厂材料和温石棉样品在玛瑙研钵中加水研磨成粉状，180度烘2h后继续研磨至极细小粉末状。将标准品粉尘180度烘2h后，称重，玛瑙
研钵中研磨至极细粉末。分散度如下表所示
2-5 nim5-10 mm>10 mm>20 mm
温 Hil 24.23%41.85%20.70%13.22%
玻璃纤维标准品 7.09%26.49%39.93%26.49%
玻璃纤维 4.86%34.82%37.25%23.08%
耐火陶瓷纤维标准品 24.40%46.05%27.49%2.06%
耐火陶瓷纤维 10.05。/。38.28%37.80%13.88%
岩棉标准品 6.90%59.00%31.42%2.68%
Vrf'11 6.41%30.34%43.59%19.66%2、建立染尘大鼠模型将磨好的粉末溶于生理盐水，配成悬液(温石棉悬液为10mg/ml，人造矿物纤维悬液为20mg/ml)。高压灭菌后待用。将90只两周雄性SD大鼠随机分成9组，包括空白对照组(BL)、生理盐水组(NS)、温石棉组(AS)、岩棉标准品组(RWS)、耐火陶瓷纤维标准品组(RFS)、玻璃纤维标准品组(GWS)、岩棉组(RW)、耐火陶瓷纤维组(RF)、玻璃纤维组(GW)。采用非暴露式气管灌注法染尘(灌肺前先对其编号及体重称量)，具体过程如下a)将大鼠用适量乙醚麻醉；b)将麻醉后的大鼠颈部皮肤夹紧，使其嘴部张开，身体自然垂下；c)打开大鼠的嘴部，在聚光灯下找到气管，将针头插入气管；d)用注射器抽取Iml悬液(NS组为等量生理盐水)，与针头接紧后，抽动注射器，有气体抽入则将溶液全部打出至肺中；若不能抽动注射器则表示针头插入大鼠胃中，须拔出重新插入；e)拔出针头，用吸耳球对准大鼠气管处反复吹气，促使溶液更好地进入肺部，减少上呼吸道残留。f)将大鼠放开，拎住颈部上下轻抖，促使溶液进入肺部。g)观察大鼠的生理状况，待大鼠转醒后，继续饲养。3、肺组织病理形态观察每组大鼠分别于染尘后3个月、6个月处死取材。部分肺组织用10%甲醛固定，经脱水、石蜡包埋后，按4 μ m的厚度切片后行苏木精-伊红(HE)染色和Van Gieson (VG)染色(曹书芬等，2007 ;郑集义，2005)。电镜样品经2. 5%戊二醛和I %锇酸双重固定，磷酸缓冲液清洗，50%,80%, 100%丙酮逐级脱水，环氧树脂816包埋、聚合，超薄切片，经O. 5%醋酸双氧铀和枸橼酸铅双重电子染色。分别于光镜和电镜下观察肺组织的病理形态学改变，依据Szapiel法(Szapiel et al. , 1979)对每个肺组织进行肺泡炎及肺纤维化的程度病理分级，对结果进行分析。光学显微镜下观察，空白对照组、生理盐水组在这两个时间点均未见明显病变，肺组织结构清晰，肺泡间隔未见增厚，无炎症、水肿及纤维化表现，肺泡腔内无明显炎性渗出物及脱落上皮(图I)。温石棉组大鼠肺组织光镜下可见肺间质纤维化，从细支气管、周围血管及邻近肺泡壁至整个肺叶弥漫性改变程度不等，VG染色显示呈深红色的胶原纤维，电镜下可见巨噬细胞胞浆内有大量空泡，肿胀变性明显，肺泡间隔有较多纤维，6个月温石棉组大鼠肺组织在上述病变的基础上局部伴有蜂窝状改变及肺泡结构破坏(图2)。岩棉标准品组、耐火陶瓷纤维标准品组、玻璃纤维标准品组、岩棉组、耐火陶瓷纤维组、玻璃纤维组大鼠肺组织均未见明显纤维化，VG染色未见明显胶原纤维，主要表现为肺泡腔内可见巨噬细胞、脱落的上皮细胞及少量渗出液等炎症性反应以及肺泡壁增厚，以耐火陶瓷纤维标准品组和耐火陶瓷纤维组尤为明显(图3)。6个月各人造矿物纤维组上述病变有所加重，但未见明显纤维化(图4)。人造矿物纤维具有致炎症反应能力，表现为明显的炎症侵犯肺泡壁和邻近的肺泡 腔，II型肺泡上皮细胞替代I型上皮细胞。人造矿物纤维暴露引起的大鼠肺组织形态学改变主要是巨噬细胞肺泡炎，不产生纤维化病变。提示这些粉尘的致肺纤维化能力较石棉组弱，或不具有致肺纤维化能力。4、miR_29 表达检测首先查询miRBase 数据库(http://www. mirbase. org/),获取大鼠 miR-29 家族成员的成熟序列，分别为Rno-miR-29a :5，-uagcaccaucugaaaucgguua-3 Rno-miR-29b_l/-2 :5， -uagcaccauuugaaaucaguguu-3，Rna-miR-29c :5，-uagcaccauuugaaaucgguua-3J根据stem-loop法原理,分别设计miR_29a、miR_29b和miR_29c的逆转录引物及
PCR扩增引物。PCR扩增引物的上游为特异引物，下游为通用引物。引物序列见下表
权利要求
1. 一种RT-PCR法诊断温石棉及人造矿物纤维所致肺部病变的引物，为引物组A、引物组B或引物组C，每组引物包括逆转录引物和PCR扩增引物；其特征在于 引物组A : 逆转录弓 I物GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT ATTCGCACTGGATACGACTAACCG ； PCR 扩增引物的上游引物GCGGCGGTAGCACCATCTGAAAT ； 引物组B : 逆转录弓 I物GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGG TATTCGCACTGGATACGACAACACT ； PCR 扩增引物的上游引物GCGGCGGTAGCACCAITTGAAATC ； 引物组C : 逆转录弓 I物GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGG TATTCGCACTGGATACGACTAACCG ； PCR 扩增引物的上游引物GCGGCGGTAGCACCAITTGAAAT ； 所有引物组PCR扩增的下游引物为GTGCAGGGTCCGAGGT。
全文摘要
本发明涉及一种RT-PCR法诊断温石棉及人造矿物纤维致肺部病变的引物，包括引物对1、引物对2或引物对3，分别用于扩增miR-29a、miR-29b和miR-29c，碱基序列如SEQ ID NO.4～9所示。本发明通过建立大鼠染尘模型，在大鼠肺组织病理表现的基础上，设计miRNA扩增引物，检测miR-29家族成员在染尘大鼠肺组织中的表达情况，为温石棉及人造矿物纤维暴露引起的健康危害提供了早期诊断和筛查的有效工具。
文档编号C12Q1/68GK102827938SQ20121032842
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月7日 优先权日2012年9月7日
发明者张幸, 武为, 肖芸, 朱丽瑾, 冯玲芳, 张敏 申请人:浙江省医学科学院