专利名称：一种标准攻击毒株cvs-11的重组病毒及其制备方法
技术领域：
本发明公开一种标准攻击毒株CVS-Il的重组病毒(缩写为rCVS-ll-eGFP)同时还提供了该重组病毒的制备方法，用于动物和人血清中抗狂犬病病毒中和抗体的检测抗原，属于生物技术领域。
背景技术：
狂犬病(Rabies)即疯狗病，又称恐水病，是由狂犬病病毒(Rabies Virus)感染温血动物和人而引起、主要侵害中枢神经系统的一种人畜共患性传染病。我国人类狂犬病的传染源中，犬猫占85%-95%，WHO研究表明，70%左右的犬群免疫率能高效阻断狂犬病的传播链。因此，建立完善的动物狂犬病预防体系，时地监测动物机体抗体水平非常重要。
目前，狂犬病病毒中和抗体检测方法主要有快速荧光灶抑制试验(RFFIT)和荧光抗体病毒中和试验(FAVN)。RFFIT主要用于人疫苗接种后血清样品抗体水平的测定，RFFIT用于检测动物血清样品抗体水平时，尤其当抗体水平较低时，存在一定比例的假阳性；并且在结果判定时受主观因素影响大(需人工准确计算出病毒增殖时形成的荧光灶数量)。OIE推荐采用FAVN对动物血清效价进行测定，检测结果一致性好外，在结果判定时，FAVN受主观因素影响较小，且适合于大规模样品的检测。两种方法均应用标准攻击毒株CVS-11，对实验室条件、操作人员素质要求较高；荧光抗体价格高昂、荧光发光持续时间短，检测成本高；需要丙酮固定，操作步骤繁多，对操作人员有微神经毒性和粘膜刺激。反向遗传学(Reverse Genetics)是从生物的遗传物质入手,通过有目的、精确地改造基因结构以观察这些改变对表型和性状的直接影响。RNA病毒的反向遗传学技术是指由病毒cDNA克隆获得RNA病毒的一项技术，通过人为操作cDNA，从而实现对RNA病毒基因组的人工操作。反向遗传系统为RNA病毒的分子生物学研究提供了强大的工具。自20世纪70年代后期第一例RNA病毒感染性克隆构建成功以来，RNA病毒的分子生物学研究取得了快速进展，这很大程度应归功于各种RNA病毒反向遗传系统的建立。目前，国内外尚未有国际标准攻击毒株CVS-Il反向遗传操作系统的报道。国内外尚没有一种真正意义上快速、经济、高效的狂犬病病毒中和抗体的检测方法。
发明内容
本发明提供了一种国际标准攻击毒株CVS-II的重组病毒，用于检测动物和人抗狂犬病病毒中和抗体效价，建立的一种快速、特异、方便的新型狂犬病病毒中和抗体检测方法。本发明还公开了国际标准攻击毒株CVS-Il的重组病毒的制备方法，适用于工业
化生产。本发明进一步建立了国际标准攻击毒株CVS-Il反向遗传操作系统。本发明公开的基于国际标准攻击毒株CVS-Il的重组病毒rCVS-11-eGFP，其特征在于
以国际标准攻击毒株CVS-Il反向遗传操作系统为基础,在CVS-Il基因组G-L处插入eGFP基因，构建获得表达eGFP的重组病毒rCVS_ll_eGFP。本发明所述重组病毒rCVS-11-eGFP的制备方法，包括以下步骤1)国际标准攻击毒株CVS-Il反向遗传操作系统的建立，具体包括全长质粒pcDNA3. I-CVS-11 及辅助质粒系统 pcDNA3. l_N、pcDNA3. l_P、pcDNA3. I-G 和 pcDNA3. 1_L，4个辅助质粒分别表达CVS-II株的核蛋白N、磷酸蛋白P、糖蛋白G和大转录蛋白L，以及应用此系统拯救的重组病毒rCVS-11 ；
2)在CVS-Il反向遗传操作系统基础上，构建CVS-Il绿色荧光蛋白重组病毒载体pCVS-11-eGFP，拯救获得重组病毒 rCVS_ll_eGFP ；
3)rCVS-11-eGFP按MOI=O. I接种于BHK-21细胞，经扩大培养，rCVS-11-eGFP病毒滴度可达到IO9 TCID5(l/mL，一 70°C保存备用。根据权利要求I所述重组病毒rCVS-11-eGFP的制备方法，包括以下步骤
O建立国际标准攻击毒株CVS-Il反向遗传操作系统
提取CVS-Il细胞毒的总RNA，反转录获得cDNA ;分4段扩增CVS-Il全基因组cDNA， 通过引物添加酶切位点，将CVS-Il基因组的G-L处替换为BssH II ,BsiwI和Sac II 3个限制性内切酶序列；4个扩增片段经多步酶切连接插入到pcDNA3. I的Kpn I和Not I处；在cDNA两端加入锤头状核酶和丁型肝炎核酶序列；通过单链合成锤头状核酶和丁型肝炎核酶的部分序列，变性退火后形成双链锤头状核酶序列和丁型肝炎核酶序列，并分别插入到pcDNA3. I 的 Nhe I -Kpn I 处和 Not I -Pme I 处，获得全长质粒 pcDNA3. I-CVS-11 ;构建辅助质粒，克隆CVS-Il的核蛋白(N)、磷酸蛋白(P)、糖蛋白(G)和聚合酶蛋白(L)基因的开放阅读框(0RF)，分别定向克隆至 pcDNA3. 1，分别得到 pcDNA3. 1_N、pcDNA3. 1_P、pcDNA3. I-G和 pcDNA3. I-L ；pcDNA3. I-CVS-11 和 pcDNA3. 1_N、pcDNA3. 1_P、pcDNA3. I-G 和 pcDNA3. I-L共转染NA细胞，经免疫荧光染色鉴定，确定成功拯救到重组病毒rCVS-11 ；
2) rCVS-11-eGFP的构建及拯救
从pIRES2-eGFP载体上扩增eGFP基因，上下游引物分别添加BsiW I和Sac II酶切位点；在CVS-11反向遗传操作系统基础上，经酶切连接，将eGFP基因定向克隆至pcDNA3. I-CVS-11 的 BsiwI-Sac II 处，得到重组质粒 pCVS-ll-eGFP ；pCVS-ll-eGFP 和pcDNA3. l-N、pcDNA3. l_P、pcDNA3. I-G 和 pcDNA3. I-L 共转染 BHK-21 细胞，培养后在荧光显微镜下观察到有绿色荧光蛋白的表达，重组病毒rCVS-11-eGFP拯救成功。本发明所构建的重组病毒rCVS-11-eGFP作为检测抗原，包括以下步骤
灭活待检血清，于96孔板中操作待检血清经3X倍比稀释，做6个稀释度，每个样品
4个重复。加入含100 TCID5tl的病毒液rCVS-11-eGFP，与中和抗体感作lh，加入BHK-21细胞培养48h，直接在倒置荧光显微镜蓝紫光下观察有无苹果绿色荧光。结果判定标准同标准FAVN相同孔内有一个以上荧光灶的，记“ ” ;孔内没有荧光灶的，记“一”。记录结果，通过Spearman-Karber公式计算出待检血清的抗体效价。以上测定结果与标准FAVN测定结果相比较，二者一致性良好。FAVcN-eGFP具有快速、特异、便捷等优点。FAVJ-eGFP可作为一种快速、特异、便捷的检测方法。本发明的标准攻击毒株CVS-Il反向遗传操作系统，其特征在于
包括全长质粒pcDNA3. I-CVS-11及辅助质粒系统pcDNA3. 1_N、pcDNA3. 1_P、pcDNA3. I-G和pcDNA3. 1_L，4个辅助质粒分别表达CVS-11株的核蛋白N、磷酸蛋白P、糖蛋白G和大转录蛋白L，以及拯救的重组病毒rCVS-11。本发明的积极效果在于利用反向遗传学方法，在国内外首次建立了狂犬病病毒国际标准攻击毒株CVS-Il的反向遗传操作系统,为进一步修饰或改造CVS-Il基因组结构提供有效平台，为从分子水平上研究狂犬病病毒的致病机理、抗原位点及毒力决定位点等奠定了基础。在CVS-Il反向遗传操作系统的基础上，构建拯救了基于国际标准攻击毒株CVS-Il的重组病毒rCVS-ll-eGFP。rCVS_ll_eGFP在增殖过程中表达eGFP，可用于直接观察病毒的增殖状态及扩散。利用eGFP无毒性、可以不需依赖任何辅助因子或其他基质而自主发光等特点，将rCVS-11-eGFP作为检测抗原，用于测定抗狂犬病病毒中和抗体效价，结果判定时，无需固定染色等操作，经济便捷。以rCVS-11-eGFP为检测抗原，建 立了一种新型狂犬病病毒中和抗体检测方法(FAVcN-eGFP )，与标准FAVN —致性良好。FAVJ-eGFP具有特异性高，经济便捷等优点。FAVcN-eGFP能够及时提供准确的免疫监测数据，有助于预防狂犬病，对定量评价疫苗免疫效果具有重要意义。
图I为狂犬病病毒标准攻击毒株CVS-II全长cDNA重组质粒 pcDNA3. I-CVS-11的构建示意 图2为从全长重组质粒pcDNA3. I-CVS-11构建重组质粒pCVS-11-eGFP的策略；
图3为重组病毒rCVS-11感染NA细胞的免疫荧光照片(200 X )；
图4为rCVS-11-eGFP感染BHK-21的免疫荧光照片和BHK-21阴性细胞(200 X )；
图5为rCVS-11-eGFP感染BHK-21后表达eGFP的照片(200 X )；
图6为rCVS-11-eGFP的电子显微镜观察图(40KX );
图7为wtCVS、rCVS-11和rCVS-11-eGFP在NA细胞上的生长曲线；
图8为FAVeN-eGFP同FAVN对血清效价的测定结果比较。
具体实施例方式为了便于理解本发明，特例举以下实施例。其作用是对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。实施例I
I.CVS-Il全基因组CDNA重组质粒的构建
按照Simple P Total RNA Extraction Kit说明书，提取CVS-11细胞毒的总RNA。参照AMV反转录酶(Promega公司)说明书，获得病毒基因组cDNA。利用DNAMAN软件分析CVS-Il全基因组的单一性酶切位点，设计4对引物(如表1)，为方便将分段扩增片段拼接至pcDNA3. I，及后续实验室改造CVS-II基因组，引物上下游添加了相应酶切位点。以病毒cDNA为模板，参照TransStart Fast Pfu DNA Polymerase说明书及表I中的引物及其退火温度，对全基因组分4段进行PCR扩增，同时利用引物将G-L处替换为BssH II ,BsiwI和Sac II 3个限制性内切酶序列。扩增片段Fl和F4连接至平端克隆载体pEASY-Blunt Simplevector, F2、F3 片段连接至 pEASY-Blunt vector。利用 pEASY-Blunt vector 本身存在的酶切位点Kpn I和Not I。将pEASY-Fl和pEASY_F2用Kpn I和Blp I双切，回收Fl片段和含F2的载体片段，用T4连接酶连接，转化trans 10感受态，挑取阳性克隆，送上海生工测序正确，得到PEASY-F1-F2。将pEASY_F3和pEASY_F4用Cla I和Not I双切，回收F4片段和含F3的载体片段，用T4连接酶连接，转化trans 10感受态，挑取阳性克隆，送上海生エ测序正确，得到 PEASY-F3-F4。将 pEASY_Fl_F2 和 pEASY_F3_F4 用 Bsiw I 和 Not I 双切，回收F3-F4片段和含F1-F2的载体片段，用T4连接酶连接，转化trans 10感受态，挑取阳性克隆，得到 pEASY-CVS-11。为了使病毒基因组cDNA转录时，能够产生精确的5’末端和3’末端，在病毒cDNA两端分别添加锤头状核酶(HamRz)和丁型肝炎核酶(HdvRz)。根据两种核酶的ニ级结构及作用原理，合成部分HamRz和HdvRz序列(如表2)，HamRz-A, B经变性、退火形成两端为Nhe I、Kpn I 黏性末端的双链 HamRz-AB, Nhe I、Kpn I 双切 pcDNA3. I 后与 HamRz-AB 连接，得到pcDNA3. 1-HamRz-AB。HdvRz_A、B变性、退火形成两端为Not I ,Pme I末端的双链HdvRz-AB, Not I、Pme I 双切 pcDNA3. I-HamRz-AB 后与 HdvRz-AB 连接，转化 trans 10 感受态，挑取阳性克隆，送上海生エ测序正确，得到pcDNA3. I-HamRz-HdvRz。Kpn I 和 Not I 分别双酶切 pEASY-CVS-11 和 pcDNA3. I-HamRz-HdvRz,回收病毒基因组cDNA拼接片段(F1-F2-F3-F4)和pcDNA3. I-HamRz-HdvRz载体片段，T4连接酶连 接，转化trans 10感受态，挑取阳性克隆，送上海生エ测序正确，得到病毒cDNA全长质粒pcDNA3. I-CVS-Il0 用 QIAGEN 公司的 HiSpeed Plasmid Midi Kit 制备中量高纯度质粒，于ー 70°C保存待用。表I CVS-Il全基因组分段扩增用引物
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表2合成的核酶序列
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2.辅助质粒的构建
设计引物(如表3),以病毒cDNA为模板，參照TransStart Fast Pfu DNA Polymerase说明书及表3中的引物及其退火温度，对CVS-Il的N、P、G和L基因的开发阅读框(ORF)进行PCR扩增。由于L基因太长，分两段扩增后进行拼接。扩增产物经酶切连接，克隆至真核表达载体pcDNA3. 1，转化trans 10感受态，挑取阳性克隆，送上海生エ测序正确，得到辅助质粒 pcDNA3. 1-N、pcDNA3.トP、pcDNA3. I-G 和 pcDNA3.トし用 QIAGEN 公司的 HiSpeedPlasmid Midi Kit制备中量高纯度质粒，于ー 70°C保存待用。表3 N、P、G和L基因扩增引物
权利要求
1.一种基于国际标准攻击毒株CVS-Il的重组病毒rCVS-11-eGFP，其特征在于 以国际标准攻击毒株CVS-Il反向遗传操作系统为基础,在CVS-Il基因组G-L处插入eGFP基因，构建获得表达eGFP的重组病毒rCVS_ll_eGFP。
2.根据权利要求I所述重组病毒rCVS-11-eGFP的制备方法，包括以下步骤 1)国际标准攻击毒株CVS-Il反向遗传操作系统的建立，具体包括全长质粒pcDNA3. I-CVS-11 及辅助质粒系统 pcDNA3. l_N、pcDNA3. l_P、pcDNA3. I-G 和 pcDNA3. 1_L，4个辅助质粒分别表达CVS-II株的核蛋白N、磷酸蛋白P、糖蛋白G和大转录蛋白L，以及应用此系统拯救的重组病毒rCVS-11 ； 2)在CVS-Il反向遗传操作系统基础上，构建CVS-Il绿色荧光蛋白重组病毒载体pCVS-11-eGFP，拯救获得重组病毒 rCVS-11-eGFP。
3.根据权利要求I所述重组病毒rCVS-11-eGFP的制备方法，包括以下步骤 O建立国际标准攻击毒株CVS-Il反向遗传操作系统 提取CVS-Il细胞毒的总RNA，反转录获得CDNA ;分4段扩增CVS-Il全基因组cDNA，通过引物添加酶切位点，将CVS-Il基因组的G-L处替换为BssH II ,BsiwI和Sac II 3个限制性内切酶序列；4个扩增片段经多步酶切连接插入到pcDNA3. I的Kpn I和Not I处；在cDNA两端加入锤头状核酶和丁型肝炎核酶序列；通过单链合成锤头状核酶和丁型肝炎核酶的部分序列，变性退火后形成双链锤头状核酶序列和丁型肝炎核酶序列，并分别插入到pcDNA3. I 的 Nhe I -Kpn I 处和 Not I -Pme I 处，获得全长质粒 pcDNA3. I-CVS-11 ;构建辅助质粒，克隆CVS-Il的核蛋白(N)、磷酸蛋白(P)、糖蛋白(G)和聚合酶蛋白(L)基因的开放阅读框(0RF)，分别定向克隆至 pcDNA3. 1，分别得到 pcDNA3. 1_N、pcDNA3. 1_P、pcDNA3. I-G和 pcDNA3. I-L ；pcDNA3. I-CVS-11 和 pcDNA3. 1_N、pcDNA3. 1_P、pcDNA3. I-G 和 pcDNA3. I-L共转染NA细胞，经免疫荧光染色鉴定，确定成功拯救到重组病毒rCVS-11 ； 2)rCVS-11-eGFP的构建及拯救 从pIRES2-eGFP载体上扩增eGFP基因，上下游引物分别添加BsiW I和Sac II酶切位点；在CVS-II反向遗传操作系统基础上，经酶切连接，将eGFP基因定向克隆至pcDNA3. I-CVS-11 的 BsiwI-Sac II 处，得到重组质粒 pCVS-11-eGFP ；pCVS-1 Ι-eGFP 和pcDNA3. l-N、pcDNA3. l_P、pcDNA3. I-G 和 pcDNA3. I-L 共转染 BHK-21 细胞，培养后在荧光显微镜下观察到有绿色荧光蛋白的表达，重组病毒rCVS-1 Ι-eGFP拯救成功。
4.权利要求I所述重组病毒rCVS-11-eGFP作为检测抗原，用于检测动物和人血清中抗狂犬病病毒中和抗体效价，由此建立的一种新型狂犬病病毒中和抗体检测方法。
5.—种国际标准攻击毒株CVS-Il反向遗传操作系统,其特征在于 包括全长质粒pcDNA3. I-CVS-11及辅助质粒系统pcDNA3. 1_N、pcDNA3. 1_P、pcDNA3. I-G和pcDNA3. 1_L，4个辅助质粒分别表达CVS-Il株的核蛋白N、磷酸蛋白P、糖蛋白G和大转录蛋白L，以及拯救的重组病毒rCVS-11。
全文摘要
本发明提供一种标准攻击毒株CVS-11的重组病毒及其制备方法，利用反向遗传学方法建立了狂犬病病毒国际标准攻击毒株CVS-11的反向遗传操作系统，为进一步修饰或改造CVS-11基因组结构提供有效平台，为从分子水平上研究狂犬病病毒的致病机理、抗原位点及毒力决定位点等奠定了基础。在CVS-11反向遗传操作系统的基础上，构建拯救了基于国际标准攻击毒株CVS-11的重组病毒rCVS-11-eGFP。rCVS-11-eGFP在增殖过程中表达eGFP，可用于直接观察病毒的增殖状态及扩散。利用eGFP无毒性、可以不需依赖任何辅助因子或其他基质而自主发光等特点，将rCVS-11-eGFP作为检测抗原，用于测定抗狂犬病病毒中和抗体效价，结果判定时，无需固定染色等操作，经济便捷。
文档编号C12N7/01GK102864126SQ201210346779
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月19日 优先权日2012年9月19日
发明者夏咸柱, 杨松涛, 薛向红, 郑学星, 高玉伟, 冯娜, 王化磊, 王承宇, 黄耕, 王铁成, 赵永坤 申请人:中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所