专利名称：一种通用型水稻工程保持系的培育方法及其在水稻普通核不育系繁殖中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属 于作物不育系的繁殖技术领域，具体涉及一种自花授粉类作物(例如水稻、小麦等)雄性不育系的繁殖方法。
背景技术：
利用植物的雄性不育性培育雄性不育系，再借助这种遗传工具来大量生产杂交种子，能使许多作物特别是自花授粉作物的杂种优势得以在生产上应用。按照三型学说，植物的雄性不育分为细胞质雄性不育、细胞核雄性不育和质核互作型雄性不育三种遗传类型。细胞质雄性不育指不育性状仅受细胞质基因控制，与细胞核无关，单纯由细胞质控制的不育性状由于找不到恢复系，所以在生产上还没有应用实例。细胞核雄性不育指不育性状仅受控于细胞核基因，与细胞质无关，分为显性核不育和隐性核不育。目前已发现的核不育大多是隐性核不育。质核互作型雄性不育由细胞质基因和细胞核基因共同控制，既有保持系使其不育性得以保持，又能在恢复系的帮助下恢复Fl杂交种的育性，这种类型的不育系与保持系、恢复系形成三系配套，是目前生产上最经典、最成熟的方法，即三系法。但是三系法的育种程序和生产环节较复杂，以致选育新组合的周期长、效率低、推广环节多、速度慢，同时种子成本高、价格贵。在细胞核雄性不育类型中，隐性核不育依据不育性是否对环境因子敏感，又分为环境敏感核不育和普通核不育。环境敏感核不育，目前主要指光温敏核不育，其育性既受核不育基因控制，又受外界光照长短和温度高低的调控，在一定的发育时期，长日、高温导致不育，短日、低温导致可育，具有育性转换的特征，可以一系两用，比三系减少一系，也即常说的两系法。光温敏不育系除了不需要保持系、繁育简易且效率更高外，还具有1)恢复谱广，几乎所有同亚种的正常品种都能使其育性恢复正常；2)遗传行为简单，不育性由I 2对隐性基因控制，容易转育和稳定，有利于培育多种类型的不育系。但是也应当指出，由于光温敏不育系的育性受外界光照和温度调控，如果在不育系繁殖过程中光照和气温变化不在控制范围内，将导致光温敏不育系繁殖减产甚至失败。普通核不育一般不受外部环境因子的影响，不管环境条件怎样变化，总是表现为不育，这种不育类型在自然界中比较常见。与质核互作型不育和光温敏核不育相比，普通核不育具有以下特点1)由于只受一对隐性核基因的控制，且育性不受环境影响，容易选育出不育率和不育株都为100%的普通核不育系；2)育性正常的品种都是它的恢复系，恢复谱及其广泛，配组自由使得选育优良组合的几率大增；3)能紧跟常规稻的选育步伐，开辟籼粳亚种间杂种优势新领域，使水稻产量在现有杂交水稻基础上实现更高产目标。因此，普通核不育系来源丰富，选育相对简单，育性稳定，易于恢复，是一种理想的不育材料，但由于这种类型的不育系没有相应的保持系，且自身不能进行育性转换，繁殖非常困难，这成为制约其大规模生产利用的关键因素。现阶段，研究普通核不育系的热点集中在核不育基因的定位与克隆上，例如CN1884541A号中国专利文献(申请号为200610027399.8)·中公开了一种“控制水稻绒毡层降解的蛋白编码序列”，其中，张大兵等通过图位克隆获得一个水稻的普通核不育基因7S/ ，功能解析发现该基因编码的蛋白通过控制水稻绒毡层降解来控制花粉的育性。在普通核不育系的大规模繁殖并应用于实际生产方面，现有文献中少有报道，目前普通核不育系主要采用回交和无性繁殖来繁殖后代，例如，CN102121052A号中国专利文献记载了利用分子标记辅助选择通过回交来创制和繁殖水稻隐性核不育系。CN101946715A号中国专利文献中记载了利用小孢子培养和无性克隆技术选育和繁殖甘蓝型油菜隐性核不育系。另外，有文献报道水稻的普通核不育系还可以通过再生繁殖，棉花的普通核不育系可以通过扦插来繁殖。通过上述方法，科研工作者可以繁殖得到少量的普通核不育系用于科研和实验，但是繁殖得到的普通不育系数量稀少，而且需要花费大量的人力物力。如果能解决普通核不育系大规模繁殖的问题，将普通核不育系这一类型大规模应用于杂交制种，将极大地释放杂种优势的利用潜力。由于越来越多的研究机构和科研工作者意识到普通核不育系巨大的利用价值和潜力，近期不少研究机构加大了对普通核不育系大规模繁殖问题上的研究投入和研究力度，并且取得了可喜的进展，例如湖南杂交水稻研究中心通过定位和克隆不育基因S和可育基因S，构建工程保持系来繁殖普通核不育系已获得了成功，但该方法需要克隆不育基因s和可育基因S，加大了工程保持系构建的难度，并大大延长了工程保持系构建的进度。因此，探索一种简单并且通用性强的普通核不育系的繁殖及创制方法，将为推进普通核不育系大规模应用于生产及进一步释放杂种优势的利用潜力方面，具有重大的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种步骤简单、操作方便、周期短、效率高的通用型水稻工程保持系的培育方法，还相应提供一种通用型水稻工程保持系在水稻普通核不育系繁殖中的应用，该应用能实现水稻普通核不育系的机械化、规模化的繁殖制种，且能够大大加快普通核不育系从选育到实现应用的过程。为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种通用型水稻工程保持系的培育方法，包括以下步骤
(1)准备基因型为SS的水稻普通核不育系，s表示控制水稻普通核不育系不育性状的不育基因；
(2)构建颜色标记基因C的双元表达载体pC；
(3)采用现有的转基因方法(例如农杆菌介导法或基因枪转化法)将所述双元表达载体PC转入基因型为SS的上述水稻普通核不育系的来源亲本或育性正常的品种中(S表示对不育基因s显性的可育基因S)，根据颜色标记基因设计引物，通过PCR筛选得到带有颜色标记基因C的Ttl代转基因株系；再将Ttl代转基因株系通过不断的自交繁殖获得带有单拷贝颜色标记基因的纯合株系，其基因型为SSCC (通过测交验证了其基因型)；
(4)分析步骤(3)所获得的每个纯合株系中颜色标记基因C在水稻基因组中的插入位点(插入位点分析方法一般是采用常规的接头法或TAIL-PCR方法)，并根据颜色标记基因C在水稻基因组的插入位置，筛选出一系列单拷贝的纯合株系组库，使纯合株系组库中的水稻基因组每隔(T2cM就有一个颜色标记基因C，该纯合株系组库即构成了一个工程保持系候选库；
(5)将步骤(I)中的水稻普通核不育系(ss)与步骤(4)中工程保持系候选库中的每个纯合株系(SSCC)进行杂交，获得F1杂合种子，F1杂合种子自交繁殖一代获得多种基因型的F2种子，然后通过色选工艺先剔除F2种子中带有颜色标记基因C的种子，将剩余不带颜色标记基因C的各组F2种子分别进行培育，获得对应的各组F2株系，调查前述各组F2株系中的不育株数，筛选出不育株数占比> 98%的F2株系组，并将该F2株系组来源的F1杂合种子作为所述水稻普通核不育系的工程保持系(基因型为上述本发明的培育方法中，基因型为的工程保持系杂合种子是根据颜色标记基因C与可育基因S在F2代中的遗传连锁分析确证得到，其基于以下基本原理水稻普通核不育系(ss)与工程保持系候选库中的每一个株系杂交，获得F1杂合种子，F1杂合种子自交繁殖一代获得F2种子，通过色选将不携带颜色标记基因的F2种子种下去后获得F2群体，调 查F2群体不育株数，如果不育株数占比为1/4左右时，则分析判定颜色标记C与可育基因S位于不同染色体上；如果不育株数占比大于1/4且小于98%时，则颜色标记C与可育基因S位于同一染色体上，且颜色标记C与可育基因S的重组率在1%到50%之间；如果不育株数占比在98%以上，则可判定颜色标记C与可育基因S位于同一染色体上，且颜色标记C与可育基因S的重组率在1%以下，因此，留选不育株数占比在98%以上的F2来源的F1种子，即为本发明所获得的工程保持系。上述的培育方法中，所述的水稻普通核不育系可以是通过遗传选育、物理化学诱变、基因工程及其他各种手段或正规途径获得，优选的，所述水稻普通核不育系的不育性状是由单基因控制的隐性核不育性状，所述可育基因S对不育基因s为显性，且不育性状不受外界环境条件影响。在优选的方案中，由于不育性状只受一对隐性核基因的控制，且育性不受环境影响，因此更容易选育出不育率和不育株都为100%的普通核不育系。上述的培育方法，所述步骤(2)中，所述双元表达载体pC具体优选为pCAMBIA1300、pCAMBIA1301、pCAMBIA1390、pCAMBIA3301、pBI121 中的任意一种(特别优选为PCAMBIA1300 或 pCAMBIA1390)。上述的培育方法，所述步骤(2)中，颜色标记基因C能在种子中表达，使种子带有颜色标记，以便于后续应用中色选出带有该颜色标记基因的种子。所述的颜色标记基因优选为红色荧光蛋白基因DsRed、红色荧光标记基因RFP、绿色荧光蛋白基因GFP、绿色荧光蛋白基因EGFP或蓝色荧光蛋白基因EBFP，其中更优选为红色荧光蛋白基因DsRed或绿色荧光蛋白基因根据所述颜色标记基因C在种子中的表达部位，可以选择合适的特异性表达启动子，例如，颜色标记基因C在胚乳表达就选择胚乳特异性表达启动子，胚乳特异性启动子有PGtl (GenBank: EU2MlO3. I)和 Pg1ubi (GenBank: AY427569· I 或 GenBank:JN389781. I)。上述的培育方法中，所述不育基因S优选为mspl、pairl、pair2、zepl、mell、pssl、tdr、udtl、gamyb4、ptcl、api5、wdal、cyp704B2、dpw、tmds3、osc6、ripl、csa 或 ait/Z,所述可育基因S为对应的水稻野生型基因。
作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述方法培育的通用型水稻工程保持系在水稻普通核不育系繁殖中的应用，所述工程保持系为带有颜色标记基因C且基因型为ScSc的杂合种子，该工程保持系的遗传背景与水稻普通核不育系(ss) —致，唯一差别在于工程保持系的基因组中带有颜色标记基因C与可育基因S，且工程保持系中的颜色标记基因C与可育基因S紧密连锁(通过测交验证其基因型)，在进行繁殖应用时，先将所述工程保持系与基因型为SS的所述水稻普通核不育系进行杂交，在杂交后代中同时获得工程保持系种子和水稻普通核不育系种子(二者的比例一般为I : 1)，此时，颜色标记基因C在工程保持系种子特异性表达启动子驱动下，特异地在工程保持系种子中表达，通过色选机即可将所述工程保持系种子分选出来，通过颜色分选出来的基因型为SeSe的工程保持系种子，可以继续与基因型为ss的水稻普通核不育系杂交，繁殖基因型为的杂合种子与基因型为ss的普通核不育系种子；剩下的种子即为基因型为ss的水稻普通核不育系种子，不含转基因成分，可以与恢复系杂交用于杂交制种，也可以与基因型为Sc^的杂合种子杂交，用于自身材料的繁殖和延续。与现有技术相比，本发明的优点在于
(1)通过转基因手段创制工程保持系来繁殖水稻普通核不育系，繁殖得到的水稻普通核不育系不含转基因成分；且育性正常的品种都是该水稻普通核不育系的恢复系，恢复谱极其广泛，配组自由，使得选育优良组合的几率大增；能紧跟常规稻的选育步伐，开辟籼粳亚种间杂种优势新领域，使水稻产量在现有杂交水稻基础上实现更高产目标；
(2)繁殖过程简单，繁殖效率高不育系繁殖不受环境条件制约，种子纯度高；虽然比两系法多了一个工程保持系，但该工程保持系不需要额外繁殖，在繁殖水稻普通核不育系的同时，可由机器色选出工程保持系；更重要的是，不需要另外克隆不育基因s和可育基因S，大大简化和加快了工程保持系的构建；在转化受体上也做了进一步优化，由转化不育系受体变为转化可育系受体来构建工程保持系，进一步降低了转化难度和工程保持系的构建成本；
(3 )通用性大大提高对于任意不育位点的普通核不育系，都可以从工程保持系候选库中找一个株系使颜色标记基因C与不育位点对应的可育位点的遗传距离< lcM，因此，本发明的方法大大提高工程保持系的通用性；
(4)智能分选，操作方便通过机器智能分选代替人工控制，为大规模机械化制种提供了可能。
图I为本发明实施例中普通核不育系繁殖制种的工艺流程图。图2为本发明实施例中构建的胚乳特异性绿色荧光蛋白表达载体pEGt。图3为本发明中工程保持系的筛选流程图。图4为本发明中工程保持系与普通核不育系杂交制种中基因重组的影响分析图。
具体实施例方式以下结合说明书附图和具体优选实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
实施例I :
一种本发明的通用型水稻工程保持系在水稻普通核不育系繁殖制种中的应用，其应用的具体对象即为水稻T98B的普通核不育系，具体包括以下步骤(工艺流程可参见图I)
I.选育普通核不育系6°Co- Y射线诱变，从水稻T98B中获得一株水稻不育突变体，通过遗传分析表明该不育性状由一个隐性单基因(即不育基因)控制，属于一种水稻普通核不育系(基因型为^)。我们也可从突变体库RiceGE购买水稻普通核不育突变体，网址http://signal. salk. edu/cgi-bin/RiceGE ;常见的可适用于本发明方法的核不育基因如下表I所示。表I :水稻普通核不育突变体列表·
权利要求
1.一种通用型水稻工程保持系的培育方法，包括以下步骤 (1)准备基因型为SS的水稻普通核不育系，s表示控制水稻普通核不育系不育性状的不育基因； (2)构建颜色标记基因C的双元表达载体； (3)采用现有的转基因方法将所述双元表达载体转入基因型为SS的上述水稻普通核不育系的来源亲本或育性正常的品种中，筛选得到带有颜色标记基因C的Ttl代转基因株系；再将Ttl代转基因株系通过不断的自交繁殖获得带有单拷贝颜色标记基因的纯合株系，其基因型为SSCC ； (4)分析步骤(3)所获得的每个纯合株系中颜色标记基因C在水稻基因组中的插入位点，并根据颜色标记基因C在水稻基因组的插入位置，筛选出一系列单拷贝的纯合株系组库，使纯合株系组库中的水稻基因组每隔(T2cM就有一个颜色标记基因C,该纯合株系组库即构成了一个工程保持系候选库； (5)将步骤(I)中的水稻普通核不育系与步骤(4)中工程保持系候选库中的每个纯合株系进行杂交，获得F1杂合种子，F1杂合种子自交繁殖一代获得多种基因型的F2种子，然后通过色选工艺先剔除F2种子中带有颜色标记基因C的种子，将剩余不带颜色标记基因C的各组F2种子分别进行培育，获得对应的各组F2株系，调查前述各组F2株系中的不育株数，筛选出不育株数占比> 98%的F2株系组，并将该F2株系组来源的F1杂合种子作为所述水稻普通核不育系的工程保持系。
2.根据权利要求I所述的培育方法，其特征在于所述水稻普通核不育系的不育性状是由单基因控制的隐性核不育性状，所述可育基因S对不育基因s为显性，且不育性状不受外界环境条件影响。
3.根据权利要求I或2所述的培育方法，其特征在于所述步骤(2)中，所述双元表达载体具体为 pCAMBIA1300、pCAMBIA1301、pCAMBIA1390、pCAMBIA3301 或 pBI121。
4.根据权利要求3所述的培育方法，其特征在于所述双元表达载体为PCAMBIA1300或PCAMBIA1390。
5.根据权利要求I或2所述的培育方法，其特征在于所述步骤(2)中，所述的颜色标记基因为红色荧光标记基因ife/fei/、红色荧光标记基因似P、绿色荧光蛋白基因ffP、绿色荧光蛋白基因EGFP或蓝色荧光蛋白基因EBFP。
6.根据权利要求5所述的培育方法，其特征在于所述的颜色标记基因为红色荧光蛋白基因DsRed或绿色荧光蛋白基因EGFP。
7.根据权利要求I或2所述的培育方法，其特征在于所述不育基因s%niSPl、Pairl、pair2^zepl、mell、pssl、tdr^udtl、gamyb4、ptcl、api5、wdal、cyp704B2、dpw、mads3、osc6、ripUcsa或&W/，所述可育基因S为对应的水稻野生型基因。
8.—种如权利要求I 7中任一项所述培育方法得到的通用型水稻工程保持系在该水稻普通核不育系繁殖中的应用，其特征在于所述工程保持系为带有颜色标记基因C且基因型为的杂合种子，所述工程保持系中颜色标记基因C与可育基因S紧密连锁，在进行繁殖应用时，先将所述工程保持系与基因型为ss的所述水稻普通核不育系进行杂交，在杂交后代中同时获得工程保持系种子和水稻普通核不育系种子，再通过色选机将所述工程保持系种子分选出来，剩下的种子即为基因型为ss的水稻普通核不育系种子。
全文摘要
本发明公开了一种通用型水稻工程保持系的培育方法，包括以下步骤构建颜色标记基因C的双元表达载体；采用转基因方法将载体转入基因型为SS的品种得到转基因株系；再通过自交繁殖获得纯合株系；分析各纯合株系中基因C的插入位点，并筛选、构建得到工程保持系候选库；将基因型为ss的水稻普通核不育系与该候选库中的纯合株系进行杂交，获得F1，F1自交繁殖获得F2，将F2中不带颜色的种子进行培育，调查培育后各组F2株系中的不育株数，筛选出不育株数占比98%以上的F2来源的F1种子作为工程保持系。本发明的培育方法具有周期短、通用性强、效率高等优点，培育的工程保持系可在水稻普通核不育系的机械化、规模化繁殖中进行应用。
文档编号C12Q1/68GK102870670SQ201210426939
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月31日 优先权日2012年10月31日
发明者段美娟, 袁定阳, 余东, 谭炎宁, 孙志忠, 孙学武, 刘瑞芬, 袁光杰, 袁贵龙, 赵炳然, 陈良碧, 袁隆平 申请人:湖南杂交水稻研究中心