肺癌的生物标志物的制作方法
【专利摘要】本发明（部分）涉及用一种或多种生物标志物确定个体内早期肺癌预后的方法。
【专利说明】肺癌的生物标志物
【技术领域】
[0001]本发明涉及预后方法和个性化疗法。
[0002]发明背景[0003]肺癌是世界上最常见的癌症诊断，2007年有150万例新病例(Salomon等，CritRev Oncol Hematol.，19:183-232，1995，SEER-数据库05.2010)。高发病率和死亡率使得其成为癌症相关死亡的主要原因，每年有超过975，000例死亡且5年存活率为15% (Salomon等人，同上)。肺癌可分类为小细胞肺癌或非小细胞肺癌(NSCLC)。NSCLC占到约80%的病例。NSCLC能进一步细分成数个组织学类型，最常见的是腺癌(40%)和鳞状细胞癌(25%)。
[0004]当前的NSCLC治疗主要基于肿瘤形态学和以肿瘤淋巴结转移(--Μ)为基础的分期系统，所述系统将肿瘤分类成对应于肿瘤进展程度的分级类别(IA、IB、IIA、IIB、IIIA、IIIB和IV期)。存在许多分期系统(例如临床相对病理分期，以及多个版本的分期指南，如由国际肺癌研究会(IASLC)发布的那些)(Goldstraw 等,J.Thorac.0ncol.2, 706-714, 2007)。例如，根据临床分期和IASLC第6版--!分期建议，各期的频率为23%1期、19%11期、37%111期和21%IV期(Goldstraw等人，同上)。相对比例可能根据所述指南以及使用临床或是病理分期而显著改变。
[0005]手术是早期NSCLC (I期和II期)的标准治疗，然后是辅助治疗如放射治疗、化疗(用于II期及以后)以及用于晚期NSCLC的贝伐单抗和表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI) (Kutikova 等，Lung Cancer ;50 (2): 143-154，2005)。美国和欧洲的 NSCLC治疗临床指南支持这些治疗选择(Mendelssohn等，2000 ；NCCN-指南NSCLC VI，2010)。
[0006]根据目前用于早期肺癌的基于--Μ的分期系统，I期NSCLC患者在手术后5年内复发的概率为35% (SEER-数据库，2008)。目前的治疗指南不建议对这些患者辅以化疗。而基于--Μ的II期患者中有30%在没有任何辅助化疗情况下不经历复发(SEER-数据库)，这意味着根据当前治疗指南(即，ESMO (D，Addario等，Annals of Oncology.2009 ；20 (增刊4):1v68-1v70，2009)、NCCN V1-2010)这些患者经历过度治疗。与此类似的是有报道指出60%的早期NSCLC患者在手术后无复发(Arriagada等，NEJM，350:351-360，2004)。根据当前临床数据，早期NSCLC的辅助化疗提供证据显示辅助化疗的平均效益为4% (NSCLC荟萃分析协作组)，5年内从60%提高到64%。
[0007]根据现有缺陷，对NSCLC患者进行预后和/或预测基因组标签的需求是具有医学合理性的。
[0008]发明概述
[0009]本发明(部分)涉及用本文所述一种或多种生物标志物确定个体内早期肺癌预后的方法。这些发现可用于帮助为早期肺癌患者确定合适的治疗，例如鉴定那些会通过接受辅助治疗而受益的患者。
[0010]一方面，本发明包括对患有非小细胞肺癌(NSCLC)的对象进行预后或分类的方法，所述方法包括在手术切除后从患有NSCLC的对象获得测试样品；测定表1、表2和/或表3中所鉴定的至少一种或多种生物标志物，或表1、表2和/或表3所鉴定生物标志物的任何组合在所述测试样品中的表达水平；分析该表达水平以产生风险评分，其中风险评分可用于提供预后或分类对象。
[0011]另一方面，本发明包括对患有非小细胞肺癌(NSCLC)的对象进行预后或分类的方法，所述方法包含:在手术切除后从患有NSCLC的对象获得测试样品；测定表1、表2和表3中的至少一种生物标志物在所述测试样品中的表达水平；分析该表达水平以产生风险评分，其中风险评分可用于提供预后或分类对象。在一个实施方式中，表1、表2和表3中所鉴定的至少一种生物标志物包括CBX7、STX1A和TPX2。在另一个实施方式中，表1、表2和表3中所鉴定的至少一种生物标志物包括CBX7、TMPRSS2、STX1A、KLK6、TPX2和UCK。在另一个实施方式中，表1、表2和表3中所鉴定的至少一种生物标志物包括CBX7、TMPRSS2、GPR116、STX1A、KLK6、SLC16A3、TPX2、UCK2、PHKAl。在另一个实施方式中，表1、表2和表3中所鉴定的至少一种生物标志物包括 CBX7、TMPRSS2、GPRl 16、KCNJl5, STX1A、KLK6、SLC16A3、PYGL,TPX2、UCK2、PHKAl或EIF4A3。在另一个实施方式中，表1、表2和表3所鉴定中的至少一种生物标志物包括 CBX7、TMPRSS2、GPRl 16、KCNJl5, PTPNl3, STX1A、KLK6、SLC16A3、PYGL,LDHA、TPX2、UCK2、PHKA1、EIF4A3*TK1。在另一个实施方式中，表1、表2和表3中所鉴定的至少一种生物标志物包括 CBX7、TMPRSS2、GPRl 16、KCNJl5, PTPN13、CTSH、STX1A、KLK6、SLC16A3、PYGL, LDHA, ITGA5、TPX2、UCK2、PHKAl、EIF4A3、TKl 或 CCNA2。
[0012]在一个实施方式中，通过将对象对肺癌、距离转移或局部复发所致死亡的时间特异性概率作附图，本发明的风险评分可用于预后。
[0013]在另一个实施方式中，风险评分可用于将对象分入将受益于接受辅助化疗的高风险组或不会受益于接受辅助化疗的低风险组。
[0014]另一方面，本发明包括预测患有非小细胞肺癌(NSCLC)的对象在手术切除后预后的方法，所述方法包含从肿瘤样品确定mRNA的表达谱，所述样品来自新鲜冷冻(FF)或福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)材料。 所述谱包含表1、表2和/或表3所列的一种或多种生物标志物，其中表2和/或表3所列一种或多种生物标志物的表达相较对照的增加以及表1所列一种或多种生物标志物的表达相较对照的减少可用于预测对象是否处于存活差的高风险组或存活良好的低风险组。在本发明的方法中，高风险组的对象被选定用于辅助化疗，而低风险组的对象不被选择用于辅助化疗和相应的随后治疗。
[0015]在另一个实施方式中，本发明包括为NSCLC对象选择治疗方案的方法，所述方法包括从已接受切除的患有NSCLC的对象获得测试样品；测定表2所鉴定的至少二种或更多生物标志物在所述测试样品中的表达水平以产生各基因的表达值；分析所述表达值以产生风险评分，其中风险评分可用于分类是否选择该对象接受血管新生抑制剂如阿瓦斯丁。
[0016]在本发明的方法中，本发明包括测定表1、表2和/或表3中所鉴定的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种或至少15种生物标志物或其任何组合的表达。例如，各从表1、表2和表3选择至少任意5种生物标志物的表达(此实施方式中的标签会包括至少15种生物标志物)。
[0017]在一个实施方式中，NSCLC是I期NSCLC、II期NSCLC或其组合。NSCLC能在由鳞状细胞癌和/或腺癌组成的组中被鉴定。
[0018]在一个实施方式中，所述对象是人。在另一个实施方式中，所述测试样品能是新鲜、冷冻、FFPE细胞。在另一个实施方式中，所述表达水平用定量PCR或阵列测定。
[0019]在另一个实施方式中，通过统计学分析进行分析表达以产生风险评分，所述统计学分析如Cox回归或参数存活预测因子。
[0020]另一方面，本发明包括选择性治疗有NSCLC癌症对象的方法，所述方法包括在手术切除后从患有NSCLC的对象获得测试样品，测定表1、表2和/或表3中所鉴定的至少一种或多种生物标志物，表1、表2和/或表3所鉴定生物标志物的任何组合在所述测试样品中的表达水平以产生风险评分；根据风险评分将对象分入高风险组或低风险组；对分类于高风险组的对象给予辅助治疗或对分类于低风险组的对象不给予辅助治疗。
[0021]另一方面，本发明包括一种含多种试剂和使用说明书的试剂盒，所述试剂用于测量表1、表2和/或表3所鉴定的一种或多种生物标志物的表达。另一方面，本发明包括用于预测肺癌对象是否会受益于辅助治疗的试剂盒，所述试剂盒包括多种用于测量表1、表2和/或表3所鉴定的一种或多种生物标志物表达的试剂；以及包括分析所述表达和产生风险评分以预测患者是否会受益于辅助治疗的工具。测量表达的试剂能包括与所鉴定生物标志物的mRNA互补的多核苷酸阵列。测量表达的试剂能包括多种PCR探针和/或qRT-PCR弓丨物。所述试剂盒能包括测量表1、表2和表3所鉴定的至少一种生物标志物如CBX7、STXlA或TPX2的试剂。
[0022]另一方面，本发明包括含一种或多种多核苷酸探针的阵列，所述探针互补于表1、表2和/或表3所示至少两种生物标志物的表达产物并可与之杂交。
[0023]另一方面，本发明包括一种含多种分离的核酸序列的组合物，其中各分离的核酸序列可与表1所示生物标志物的RNA产物杂交，例如生物标志物CBX7、STX1A和TPX2，其中所述组合物用于测量所述三种基因的RNA表达水平。
[0024]另一方面，本发明包括一种预测NSCLC对象的预后或对其进行分类的计算机产品，所述产品包括用于接收对应于NSCLC对象样品中一种或多种生物标志物表达水平的数据的手段，其中所述一种或多种生物标志物鉴定于表1、表2和/或表3,用于产生各基因表达值的手段；以及基于向数据库输入表达值来产生风险评分的手段，所述数据库中包含与预后相关的对照表达谱，其中风险评分预测所述对象的存活预后或者将其分入高风险组或低风险组。
[0025]另一方面，本发明包括与上述任意方法一起使用的计算机产品。
[0026]“生物标志物”是可用作对象中生物学状态指示物的分子。关于本主题，本文公开的生物标志物可以是显示表达变化且其存在可用于预后或预测对象是否会受益于接受特定治疗的分子。感兴趣的生物标志物可通过检测该生物标志物表达变化来确定。表达变化描述DNA基因序列信息向转录RNA (初始未剪接的RNA转录本或成熟mRNA)或编码蛋白产物的转变。本文公开的生物标志物包括表1、表2和表3所列生物标志物中的任何一种或其任意组合，且可以是转录RNA或编码蛋白产物。
[0027]附附图简述
[0028]附图1描述模块1、2和3的标准化评分的成对散点附图，证实它们传递关于肿瘤的不同信息。
[0029]附图2A-D描述Kaplan-Meier总体存活分析曲线，显示就手术后长至5年的患者而言，3种标签(模块1、2和3)分别或组合应用时的预后性能。[0030]附图3A-F描述Kaplan-Meier总体存活分析曲线，显示就手术后长至5年的患者而言，模块I根据阶段、组织学、年龄分层的预后性能。
[0031]附图4A-F描述Kaplan-Meier存活分析曲线，显示就手术后长至5年的患者而言，由模块2根据阶段、组织学、年龄分层的预后性能。
[0032]附图5A-F描述Kaplan-Meier存活分析曲线，显示就手术后长至5年的患者而言，由模块3根据阶段、组织学、年龄分层的预后性能。
[0033]附图6A-F描述Kaplan-Meier存活分析曲线，显示就手术后长至5年的患者而言，组合评分根据阶段、组织学、年龄分层的预后性能。
[0034]附图7A-F描述Kaplan-Meier存活分析曲线，显示构建为38-基因列表之亚组的多个示例性标签的预后性能。 [0035]附图8A描述肺癌死亡百分率(等同于100%负存活)为所主张标签的风险评分的函数，和显示在1、2、3、4和5年随访期的所述预后。附图SB描述肺癌死亡百分率(等同于100%负存活)为所主张标签的风险评分的函数，和显示5年死亡率为风险评分的函数，根据肿瘤I期和2期分层。
[0036]附图9描述Kaplan-Meier存活分析曲线，显示来自安德森癌症中心(M.D.Anderson Cancer Center)的可公开获得的数据集中的存活性能,所述数据集获自FFPE材料。
[0037]附图10A-B描述成对散点附图，比较了 FF/Affymetrix相对FFPE/qNPA，以及FF/Affymetrix 相对 FFPE/nanoString。
[0038]发明详述
[0039]本发明(部分)基于可用于患早期肺癌个体预后或分类的方法。本发明还包括鉴定疾病复发风险高并和可向其推荐辅助治疗的患者以及复发风险低且可能不会受益于辅助治疗的患者。在一个示例中，本文所述预后和预测方法是基于多种生物标志物在肺癌测试样品中的差异性表达。本发明的生物标志物可包括38个基因(CBX7、TMPRSS2、GPRl 16,KCNJ15、PTPN13、CTSH、PPFIBP2、CD302、SFTPB、HSD17B6、DLC1、ADRB2、PARM1、KLRB1、MS4A1、STXIA、KLK6、SLC16A3、PYGL、LDHA、ITGA5、VEGFC、EEF1A2、TPX2、UCK2、PHKA1、EIF4A3、TK1、CCNA2、GGH、CCNBU MELK, HMMR、EIF2S1、TEAD4、HMGAl、RIMS2, H2AFZ)或其组合，所述生物标志物可根据包括生物学功能在内的标准拆分成3个模块(表1、2和3)。表1 (本文中也称为模块I)包括参与肿瘤抑制的基因，表2 (本文中也称为模块2)包括参与血管新生的基因，和表3 (本文中也称为模块3)包括参与增殖的基因。
[0040]据发现，与对照(例如这些基因在早期肺癌(I和II期)患者中的平均表达)相比，一些生物标志物在早期肺癌中过表达，如参与血管新生或增殖的标志物(分别为表2和表3)，而其他参与肿瘤抑制的生物标志物表达不足(表1)。
[0041]牛物标志物
[0042]本发明的生物标志物包括表1、表2和/或表3所列的一种或多种生物标志物，或其基因产物。本发明基于以下发现--表1、表2和/或表3所列的生物标志物差异性表达。通过分析表1、表2和/或表3中所鉴定一种或多种生物标志物的表达谱水平，有可能确定早期肺癌个体的预后。
[0043]在一个示例中，发明方法包括测量表1中的一种或多种生物标志物。例如,本发明方法测量来自表1的至少I种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种或至少15种生物标志物。在一个不例中，测量来自表1的一个基因CBX7的表达水平。在另一个不例中，测量来自表1的两个生物标志物CBX7和TMPRSS2的表达水平。在另一个示例中，测量来自表1的三个生物标志物CBX7、TMPRSS2和GPR116的表达水平。在另一个示例中，测量来自表1的四个生物标志物CBX7、TMPRSS2、GPRl 16和KCNJ15的表达水平。在另一个示例中，测量来自表1的五个生物标志物CBX7、TMPRSS2、GPR116 、KCNJ15和PTPN13的表达水平。[0044]
【权利要求】
1.一种用于非小细胞肺癌(NSCLC)对象预后的方法，包括: 在手术切除后从患有NSCLC的对象获得测试样品； 测定表1、表2或表3各自所鉴定的至少三种或更多种生物标志物的表达水平；和 分析所述表达水平以产生风险评分，其中该风险评分可用于提供对象的预后。
2.一种非小细胞肺癌(NSCLC)对象预后的方法，所述方法包括: 在手术切除后从患有NSCLC的对象获得测试样品； 测定表1、表2和表3所鉴定的至少一种生物标志物在所述测试样品中的表达水平；和 分析所述表达水平以产生风险评分，其中该风险评分可用于提供对象的预后。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述风险评分将对象分为高风险组且会受益于接受辅助化疗，或分为低风险组且不会受益于接受辅助化疗。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述对象有存活差的预后或存活良好的预后。
5.如权利要求2所述的方法，其中所述表1、表2和表3鉴定的至少一种生物标志物包括 CBX7、STX1A 和 TPX2。
6.如权利要求2所述的方法，其中所述表1、表2和表3鉴定的至少一种生物标志物包括 CBX7、TMPRSS2、STX1A、KLK6、TPX2 和 UCK2。
7.如权利要求2所述的方法，其中所述表1、表2和表3鉴定的至少一种生物标志物包括 CBX7、TMPRSS2、GPRl 16、STX1A`、KLK6、SLC16A3、TPX2、UCK2、PHKAl。
8.如权利要求2所述的方法，其中所述表1、表2和表3鉴定的至少一种生物标志物包括 CBX7、TMPRSS2、GPRl 16、KCNJl5, STX1A、KLK6、SLC16A3、PYGL, TPX2、UCK2、PHKAl 或EIF4A3。
9.如权利要求2所述的方法，其中所述表1、表2和表3鉴定的至少一种生物标志物包括 CBX7、TMPRSS2、GPRl16、KCNJ15、PTPNl3、STXIA、KLK6、SLC16A3、PYGL、LDHA、TPX2、UCK2、PHKA1、EIF4A3 或TK1。
10.如权利要求2所述的方法，其中所述表1、表2和表3鉴定的至少一种生物标志物包括 CBX7、TMPRSS2、GPRl16、KCNJ15、PTPNl3、CTSH、STXIA、KLK6、SLC16A3、PYGL、LDHA、ITGA5、TPX2、UCK2、PHKAl、EIF4A3、TKl 或 CCNA2。
11.一种预测手术切除后非小细胞肺癌(NSCLC)对象预后的方法，包括测定表1、表2和/或表3所列一种或多种生物标志物的表达,其中表2和/或表3所列一种或多种生物标志物的表达相较对照的增加以及表1所列一种或多种生物标志物的表达相较对照的减少可用于预测对象处于存活差的高风险组或是存活良好的低风险组。
12.如权利要求11所述的方法，其中高风险组的对象被选为接受辅助化疗，而所述低风险组的对象不被选为接受辅助化疗。
13.一种为NSCLC对象选择疗法的方法，包括 从已接受切除的患有NSCLC的对象获得测试样品； 测定表2所鉴定的至少二种或更多生物标志物在所述测试样品中的表达水平以产生各基因的表达值；和 分析所述表达值以产生风险评分，其中该风险评分可用于划分所述对象是否选择接受血管新生抑制剂。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述血管新生抑制剂是阿瓦斯丁。
15.一种选择性治疗患NSCLC癌的对象的方法，包括:在手术切除后从患有NSCLC的对象获得测试样品；测定表1、表2或表3所鉴定的至少一种或多种生物标志物，或表1、表2或表3所鉴定生物标志物的任何组合在所述测试样品中的表达水平以产生风险评分；根据风险评分将对象分入高风险组或低风险组；和对划分为属于高风险组的对象给予辅助治疗或对划分为属于低风险组的对象不给予辅助治疗。
16.如权利要求11、13或15所述的方法，包括测定表1、表2和/或表3所鉴定的至少三种生物标志物的表达。
17.如权利要求1、11、13或15所述的方法，包括测定表1、表2和/或表3所鉴定的至少四种生物标志物的表达。
18.如权利要求1、11、13或15所述的方法，包括测定表1、表2和/或表3所鉴定的至少五种生物标志物的表达。
19.如权利要求1、11、13或15所述的方法，包括测定表1、表2和/或表3所鉴定的至少六种生物标志物的表达。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述NSCLC是I期NSCLC或II期NSCLC或其组合。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述NSCLC在由鳞状细胞癌和腺癌组成的组中鉴定。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述测试样品是新鲜的、冷冻的、石蜡固定包埋的细胞。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法,其中所述表达水平用qNPA、nanoString、定量PCR或阵列测定。
24.如权利要求1或2所述的方法，其中所述产生风险评分的表达分析用统计学分析完成。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述统计学分析包括Cox回归分析或参数存活预测因子。
26.如权利要求1-25所述的方法，其中所述对象是人。
27.一种包含多种试剂和使用说明书的试剂盒，所述试剂用于测量表1、表2和/或表3所鉴定一种或多种生物标志物的表达。
28.一种用于预测肺癌对象是否会受益于辅助治疗的试剂盒，所述试剂盒包括:用于测量表1、表2和/或表3所鉴定一种或多种生物标志物表达的多种试剂；分析所述表达和产生风险评分以预测患者是否会受益于辅助治疗的工具。
29.如权利要求28所述的试剂盒，其中用于测量表达的试剂包括与所鉴定基因的mRNA互补的多核苷酸阵列。
30.如权利要求28所述的试剂盒，其中用于测量表达的试剂包括多种PCR探针和/或qRT-PCR 引物。
31.如权利要求28所述的试剂盒，其中表1、表2和表3鉴定的至少一种生物标志物包括 CBX7、STX1 A 或 TPX2。
32.—种含一种或多种多核苷酸探针的阵列,所述探针与表1、表2和/或表3所不至少两种生物标志物的表达产物互补和可杂交。
33.一种含多种分离的核酸序列的组合物，其中各分离的核酸序列可与所述生物标志物CBX7、STXlA和TPX2的RNA产物杂交，其中所述组合物用于测量所述三种基因的RNA表达水平。
34.一种预测NSCLC对象预后的计算机产品，其包括: 用于接收对应于NSCLC对象样品中一种或多种生物标志物表达水平的数据的手段，其中所述一种或多种生物标志物在表1、表2和/或表3中鉴定； 用于产生各基因表达值的手段；和 基于向数据库输入表达值来产生风险评分的手段，所述数据库包含与预后相关的对照表达谱，其中风险评分预测所述对象的存活预后或者将该对象分入高风险组或低风险组。
35.如权利要求34所述的计 算机产品，其用于如权利要求1-25中任一项所述的方法。
【文档编号】C12Q1/68GK103562409SQ201280025474
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2012年5月24日 优先权日:2011年5月25日
【发明者】E·米希亚格里亚, P·维拉帕蒂, S·罗西, W·克罗尔 申请人:诺华股份有限公司