Hpv嵌合颗粒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及嵌合人乳头瘤病毒(HPV)病毒样颗粒(VLP)，其具有约30nm的直径。本发明进一步涉及通过向受试者施用本发明的嵌合HPVVLP治疗和/或预防HPV感染和/或宫颈癌的方法。
【专利说明】HPV嵌合颗粒
发明背景
[0001]本发明涉及具有约30nm的直径的嵌合人乳头瘤病毒(HPV)病毒样颗粒(VLP)和通过施用本发明的嵌合HPV VLP治疗和/或预防HPV感染和/或宫颈癌的方法。
[0002]宫颈癌主要由HPV感染引起并且是世界范围内女性中第三大最常见的癌症(Ferlay等人，2010)。因此，HPV疫苗的开发对于预防性的癌症研究是优先的。LI主要衣壳蛋白是用于预防性疫苗的选择的抗原，因为它是免疫显性的并自组装在与真实病毒颗粒结构和免疫学相似的VLP中。用VLP接种在动物和人中都诱发高滴定度的中和抗体(NAb)，并且两种多价的基于HPV LlVLP的预防性疫苗已得到许可并且在预防疫苗类型HPV-16和18感染和相关疾病中高度有效(Schiller等人，2008)。
[0003]尽管现在基于LlVLP的HPV疫苗是高效的，但疫苗的类型特异性(BiOwn等人，2009 ;Wheeler 等人，2009)，缺乏治疗有效性(FUTURE IIStudy Group, 2007 ；Hildersheim等人，2007)和高成本(Schiller等人，2008)已限制了其广泛应用，尤其在发展中国家，其具有宫颈癌负担的>80% (Parkin和Bray，2006)。因此，有紧迫的对买得起的第二代HPV疫苗的需求，所述第二代HPV疫苗扩大保护到包含多种致癌的HPV类型，并改善治疗功效以清除已建立的HPV感染和癌性病变。
[0004]广谱的预防性HPV疫苗可以通过交叉中和L2表位进行开发。所述L2表位可以整合入LI的表面区域以产生L1/L2嵌合体，所述嵌合体在组装的LI表面展示L2肽(W003/097673 ；Kawana 等人，1999，2003 ；Slupetzky 等人，2007 ；Kondo 等人，2007，2008)。
[0005]使用植物表达系统大规模生产外源蛋白已被提议为是用于疫苗生产的划算的备选方案(Fischer等人，2004)，其具有确定的用于高水平蛋白表达和优化的瞬时表达的趋势(Rybicki，2009)。几 个研究组已在植物中表达出了 HPV-16L1 (Biemelt等人，2003 ;W02006/119516 ；Maclean 等人，2007)。
[0006]植物系统的一个实际的局限性是重组蛋白的低产量，可能是由于蛋白不稳定或表达水平低(Fischer等人,2004 ;0bembe等人,2011)。据估计,植物表达重组蛋白的产量需要大于总可溶蛋白(TSP)的1%才是经济上可行的(Fischer等人，2004)。这对于使用核转化的转基因植物的重组蛋白的表达是尤其有问题的，因为这些系统经常与重组蛋白的低产量相关(Rybicki，2009)。
[0007]HPV-16LI已经转基因表达在核转化的马铃薯和烟草植物中，但始终报告HPV-16LI的低表达水平(< 1% TSP)并且诱发的免疫应答相对弱(Biemelt等人，2003 ；Varsani 等人，2003b ；Varsani 等人，2006a)。
[0008]然而，LI基因的人密码子优化并靶向叶绿体在转基因的和农杆菌(Agrobacterium)介导的瞬时烟草表达系统已显著改善了 HPV-16L1的表达至多达TSP的17% (Maclean 等人，2007)。
[0009]一项最近源自植物的HPV疫苗的开发是在植物中首次表达HPV-16L1嵌合体。LI/E6/E7嵌合体由HPV-16L1通过C 端融合于几个E6和E7表位组成并且在转基因番茄中表达(Paz De la Rosa等人，2009)。然而，产量低(TSP的0.05_0.1 % )，并且因此无法在商业上使用。
[0010]W0201I/077371描述了一种生产嵌合HPVLl多肽的方法，其具有相对于在昆虫、植物、或酵母表达系统中HPV LI蛋白增加的表达水平。尽管在植物中生产的从HPV LI和BPVL2(氨基酸1-88)的人密码子优化的L1/L2嵌合体形成约55nm的VLP，其它的HPV L1/L2嵌合体只能形成约17nm直径的壳粒。
[0011 ] 尽管壳粒在室温稳定，但它们相比VLP只能诱导20到40倍较低的体液免疫应答( Thones等人，2008)。因此开发一种在表达系统中具有商业可用水平的表达的包含LI和L2的嵌合VLP将是有益的。这种嵌合VLP将更易于纯化并且可能比嵌合壳粒更具有免疫原性。
[0012]发明概述
[0013]根据本发明的第一个方面，提供一种包含约30nm的直径的嵌合人乳头瘤病毒(HPV)病毒样颗粒(VLP)，所述嵌合HPV VLP具有人密码子优化的核苷酸序列编码的嵌合HPV16L1/L2多肽，所述嵌合HPV16L1/L2多肽进一步包含含有约13个氨基酸到约26个氨基酸的HPV L2肽的HPV LI多肽，所述HPV L2肽从HPV16L1多肽的残基414插入，其中，插入的HPV L2肽的氨基酸替代HPV16L1多肽中相应的氨基酸。
[0014]例如，插入的HPV L2肽可以是如SEQ ID NO:7所示的人密码子优化的核苷酸序列编码的13个氨基酸LVEETSFIDAGAP的肽(SEQ ID NO:3)，或如SEQ ID NO:9所示的人密码子优化的核苷酸序列编码的20个氨基酸QLYKTCKQAGTCProilPKV的肽(SEQID NO:5)，或如SEQ ID NO:8所示的人密码子优化的核苷酸序列编码的26个氨基酸GGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPT 的肽(SEQ ID NO:4)。
[0015]优选的，所述插入的HPV L2肽是如SEQ ID NO:7所示的人密码子优化的核苷酸序列编码的13个氨基酸LVEETSF IDAGAP的肽(SEQ ID NO:3)。
[0016]HPV类型16的LI蛋白可以进一步由修饰核苷酸序列编码以致核定位信号缺失。
[0017]优选的，所述HPV-16L1/L2 多肽包含如 SEQ ID NO: 22, SEQ IDN0:23 或 SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，或其变体或衍生物。
[0018]优选的，所述HPV-16L1多肽如SEQ ID NO:1所示，并且所述HPV-16L1多肽如SEQID NO:2所示的人密码子优化的HPV-16L1多核苷酸序列编码。
[0019]直径约30nm的嵌合HPV VLP可以是一种植物表达的嵌合HPV VLP，所述嵌合HPVVLP从植物表达系统中纯化。优选的，所述表达的嵌合VLP可以靶向植物的叶绿体。
[0020]根据本发明一个进一步的方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包含如本发明的直径为30nm的嵌合HPV VLP和药学上可接受的载体。
[0021]所述组合物还可以包含佐剂。
[0022]根据本发明一个进一步的方面，提供一种生产具有尺寸为直径约30nm的嵌合HPVVLP，所述方法包含以下步骤:
[0023](i)提供编码嵌合HPV16L1/L2多肽的嵌合人密码子优化的核苷酸序列，所述嵌合HPV16L1/L2多肽包含具有约13个氨基酸到约26个氨基酸的HPV L2肽的HPV16L1多肽，所述HPV L2肽从嵌合HPV16L1/L2多肽的残基414插入，其中所述插入的HPV L2肽的氨基酸代替HPV16L1多肽的相应氨基酸；
[0024](ii)将嵌合人密码子优化的核苷酸序列克隆入适于在植物中表达多肽的表达载体；
[0025](iii)用步骤(ii)的表达载体转化或渗入植物细胞；
[0026](iv)在步骤(iii)的植物细胞中表达所述嵌合HPV16L1/L2多肽，以至于表达的嵌合HPV16L1/L2多肽装配进入具有均一形状和约30nm的直径的嵌合HPV VLP ;和
[0027](V)从所述植物细胞中回收所述嵌合HPV VLP。
[0028]所述表达载体优选的包含启动子和其它调控序列或类似物，其可操作的连接于表达载体的编码序列。
[0029]优选的，步骤(ii)的表达载体适于靶向植物细胞的叶绿体，并且在步骤(iv)中所述表达的嵌合HPV蛋白靶向植物叶绿体。
[0030]步骤(iii)可以进一步包括向植物细胞引入适于抑制植物中转录后基因沉默的抑制蛋白。优选的，所述抑制蛋白是番爺斑萎病毒(tomato spotted wilt virus)的NSs蛋白或番爺丛矮病毒(tomato bushy stunt virus)的pl9。
[0031]例如插入的HPV L2肽可以是如SEQ ID NO:7所示的人密码子优化的核苷酸序列编码的13个氨基酸LVEETSFIDAGAP的肽(SEQ ID NO:3)，或如SEQ ID NO:9所示的人密码子优化的核苷酸序列编码的20个氨基酸QLYKTCKQAGTCProilPKV的肽(SEQID NO:5)，或如SEQ ID NO:8所示的人密码子优化的核苷酸序列编码的26个氨基酸GGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPT 的肽(SEQ ID NO:4)。
[0032]优选的，所述插入的HPV L2肽是如SEQ ID NO:7所示的人密码子优化的核苷酸序列编码的3个氨基酸LVEETSFIDAGAP的肽(SEQ ID NO:3)。
[0033]根据本发明一个 进一步的方面，提供一种根据本发明的直径为约30nm的嵌合HPVVLP，其用于在受试者中预防和/或治疗HPV感染和/或宫颈癌的方法中。
[0034]更具体的，所述嵌合HPV VLP可以用于在受试者中诱发免疫应答(如中和抗体和/或CTL应答)的方法中。优选的，所述嵌合HPV VLP用于针对受试者中的多种HPV类型诱导交叉保护的免疫应答中。
[0035]根据本发明一个进一步的方面，提供根据本发明的规则形状的、直径约30nm的嵌合HPV VLP在制备用于在受试者中预防和/或治疗HPV感染和/或宫颈癌方法的药物中的用途。
[0036]更具体的，所述药物可以用于在受试者中诱发免疫应答(如中和抗体和/或CTL应答)的方法中。优选的，所述药物用于针对受试者中的多种HPV类型诱导交叉保护免疫应答。
[0037]根据本发明一个进一步的方面，提供一种在受试者中预防和/或治疗HPV感染和/或宫颈癌的方法，所述方法包括向受试者施用预防或治疗有效量的根据本发明的形状均一、直径约30nm的嵌合HPV VLP的步骤。
[0038]更具体的，所述方法可以包括诱发受试者中的免疫应答(如中和抗体和/或CTL应答)。优选的，所述方法针对受试者中的多利HPV类型诱导交叉保护的免疫应答。
[0039]受试者优选是人。
[0040]附图简要说明
[0041]图1显示用于产生HPV嵌合体植物表达构建体的质粒。C)源于pGA4构建体的HPV嵌合体直接亚克隆入农杆菌 植物表达载体:A)pTRAkc-rbcsl-cTP，B)pTRAc和D)pRIC3。植物表达所需的载体元件在图中显示。P35SS:CaMV35S启动子，其含有重复的转录增强子，CHS:查耳酮合酶5’非翻译区，pA35S:用于外源基因表达的CaMV35S多聚腺苷酸信号，ColElor1:大肠杆菌(E.coli)复制起点，RK2or1:农杆菌复制起点，bla:氨节青霉素/羧节青霉素抗性基因，和LB/RB =T-DNA整合的左和右边界。pTRAc载体包含SAR:烟草表达盒侧翼的Rb7框架附着区。此外，pTRAkc-rbcsl-cTP载体含有npt I1:卡那霉素抗性基因，Pnos/PAnos:胭脂碱合成酶基因的启动子/多聚腺苷酸化信号和rbcsl-cTP:核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(Rubisco)小亚基基因rbcSl的马铃薯(Solanum tuberosum)叶绿体_转移妝序列。pRIC3载体包含LIR =BeYDV长基因间区域，SIR =BeYDV短基因间区域和R印/R印A:BeYDV r印基因。
[0042]图2显示在有(+)或没有(_) NSs沉默抑制子时,在本生烟草(N.benthamiana)中渗入后(dpi) 1-9天叶绿体-祀向L1/L2嵌合体的表达计时测验。在叶粗提物中的L1/L2嵌合体 A)L1/L2(108-120)，B)L1/L2(56-81)，C)L1/L2(17-36)和 D)L1/L2BPV(1-88)用 CamVirl 蛋白质印迹分析进行检测。M=用在左侧示出的kDa表示大小的蛋白质分子量标准。NSs负对照=pBIN-NSs渗入的植物粗提物(5dpi)。正对照:本生烟草(+)=源于植物的HPV-16L1。黑色箭头指示L1/L2嵌合体(~56kDa)的位置并且灰色箭头指示降解的蛋白。 [0043]图3a)显示使用3个植物表达载体pTRAc，pTRAkc-rbcsl-cTP和pRIC3表达的LI/L2嵌合体的蛋白质印迹分析。嵌合体与NSs共表达，提取5dpi并用CamVirl检测。HPV-16L1作为pTRAc和pTRAkc-rbcsl-cTP (pRIC3构建体不可获得)的正表达对照进行表达，负表达对照为NSs-渗入的植物。M =用在左侧示出的kDa表示大小的蛋白质分子量标准。黑色箭头指示L1/L2嵌合体或HPV-16L1 (~56kDa);和b)显示用3种植物表达载体:pTRAc，pTRAkc-rbcsl-cTP和pRIC3表达的L1/L2嵌合体之间的比较。误差线指示标准差。
[0044]图4显示使用3种不同植物表达载体:pTRAc，pTRAkc-rbcsl-cTP和pRIC3表达的L1/L2嵌合体的组装。蛋白与NSs沉默抑制子共表达并提取5dpi。嵌合体组装为高阶的结构如壳粒或VLP(由构象特异的H16.V5MAb检测)表示为占总嵌合体蛋白的百分比(由线性特异的H16.J4MAb检测)。HPV-16L1表达为正表达对照且负表达对照为NSs-渗入的植物。误差线指不标准差。
[0045]图5显示植物生产疫苗抗原的纯度。A)考马斯染色的蛋白胶。B)蛋白质印迹检测HPV抗原。M=用在左侧示出的kDa表示大小的蛋白质分子量标准。C=澄清的植物粗提物。P =纯化的抗原。Vl = L1/L2 (108-120), V2 = L1/L2 (56-81)，V3 = L1/L2 (17-36)，V4(+) = HPV-16LI和V5(_) = NSs-渗入的植物提取物。黑色箭头指示HPV抗原且白色箭头指示植物蛋白Rubisc0.[0046]图6显示中未加工和纯化样品中可溶蛋白(TSP)和总HPV蛋白。TSP用Lowry测定法进行测定且HPV蛋白用H16.J4(线性表位特异)测定。Vl:L1/L2 (108-120), V2:L1/L2 (56-81), V3:L1/L2 (17-36), V4:HPV_16L1 (正对照)，V5:NSs 植物提取物(负对照)。误
差线指不标准差。
[0047]图7显示CamVirl-免疫捕获的未加工的和纯化的疫苗抗原的电子透射显微照片。A)Vl:L1/L2(108-120)，B)V2:L1/L2(56-81)，C)V3:L1/L2(17-36)，D)V4:HPV-16L1(正对照)，E)V5:NSs植物提取物(负对照)。格子框出的是在Zeiss9120mega Cryo EFTEM中看到的。左侧比例尺=50nm,右侧比例尺=200nm。浅灰色箭头指示HPV-16壳粒(~IOnm),白色箭头表示壳粒聚集体或小的VLP (~30nm)深灰色箭头指示实际大小的VLP (~55nm)。
[0048]图8显示CamVirl免疫捕获的的未加工疫苗抗原L1/L2 (56-81)。格子框出的是在Zeiss9120mega Cryo EFTEM 中看到的。比例尺=IOOnm0
[0049]图9显示使用昆虫细胞表达的HPV-16L1作为包被抗原的小鼠血清直接ELISA。Vl=L1/L2 (108-120)，V2 = L1/L2 (56-81)，V3 = L1/L2 (17-36)，V4 = HPVLl (+ 疫苗对照)，V5=植物提取物(_疫苗对照)。A)所有疫苗的小鼠抗血清滴定度。B)图标显示ELISA正对照MAbs H16.V5和CamVirl获得的值。C) 1:50稀释后接种前取血吸光度值。标记表示
三重样品的平均值且误差线指示标准差。[0050]图10显示大肠杆菌表达的His标签的HPV-16L2用1:100稀释的小鼠血清进行的蛋白质印迹检测。M =用kDa表示蛋白大小的蛋白质分子量标准。Vl = L1/L2 (108-120),V2 = L1/L2 (56-81), V3 = L1/L2 (17-36)，V4 = HPVLl (+疫苗对照)，V5 =植物提取物(_ 疫苗对照)。PB =预取血血清。FB =最终的取血血清。用于蛋白质印迹分析对照:+ve =小鼠抗-His (1:2000 ；Serotec), _ve =无主要抗体。黑色箭头指示L2 (~80kDa).[0051]图11显示HPV_16PsV中和试验。从用V1-V5接种的小鼠中采集的血清用于测试其中和 HPV-16PsV 的能力。A)V1 = L1/L2 (108-120)，B) V2 = L1/L2 (56-81)，C) V3 = LI/L2 (17-36)，D) V4 = HPV-16LI (+ve疫苗对照)，E) V5 = NSs-渗入的植物提取物(_ve疫苗对照)。F)H16.V5 = +ve中和作用对照。细胞对照=-ve感染/SEAP表达对照。PsV对照=+ve感染/SEAP表达对照。样品以一式三份进行测试且误差线指示标准差。
[0052]图 12 显示 HPV-18PsV 中和试验。A)V1 = L1/L2 (108-120)，B) V2 = L1/L2 (56-81)，C) V3 = L1/L2 (17-36)，D) V4 = HPV-16LI，E) V5 = NSs-渗入的植物提取物(_ve 疫苗对照)。F)兔抗Cervarix血清=+ve中和作用对照。
[0053]图 13 显示 HPV-45PsV 中和试验。A)V1 = L1/L2 (108-120)，B) V2 = L1/L2 (56-81)，C) V3 = L1/L2 (17-36)，D) V4 = HPV-16LI，E) V5 = NSs-渗入的植物提取物(_ve 疫苗对照)。F)H45.N5 = +ve中和作用对照。
[0054]图 14 显示 HPV-52PsV 中和试验。A)V1 = L1/L2 (108-120)，B) V2 = L1/L2 (56-81)，C) V3 = L1/L2 (17-36)，D) V4 = HPV-16LI，E) V5 = NSs-渗入的植物提取物(_ve 疫苗对照)。F)H52.Cl = +ve中和作用对照。
[0055]图15 显示 HPV-16LI 的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。
[0056]图16显示HPV-16L1的人密码子优化的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)。
[0057]图17显示插入到HPV LI序列中的L2 (108-120)表位氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。
[0058]图18显示插入到HPV LI序列中的L2 (56-81)表位氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。
[0059]图19显示插入到HPV LI序列中的L2 (17-36)表位氨基酸序列(SEQ ID NO:5)。
[0060]图20显示插入到HPV LI序列中的L2BPV (1-88)表位氨基酸序列(SEQ ID NO:6)。
[0061]图21显示插入到HPV LI序列中的L2 (108-120)的人密码子优化的DNA核苷酸序列(SEQ ID NO:7)ο
[0062]图22显示插入到HPV LI序列中的L2 (56-81)人密码子优化的DNA核苷酸序列(SEQ ID NO:8)。
[0063]图23显示插入到HPV LI序列中的L2 (17-36)人密码子优化的DNA核苷酸序列(SEQ ID NO:9)。[0064]图24显示插入到HPV LI序列中的L2BPV (1_88)人密码子优化的DNA核苷酸序列(SEQ ID NO:10)。
[0065]图25 显示 HPV16L1/L2 (108-120)嵌合多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:22)。
[0066]图26显示HPV16L1/L2 (56-81)嵌合多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:23)。
[0067]图27显示HPV16L1/L2 (17-36)嵌合多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:24)。
[0068]图28 显示 HPV16Ll/L2BPV(l-88)嵌合多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:25)。
[0069]图29显示编码HPV16L1/L2 (108-120)嵌合多肽的人密码子优化的DNA核苷酸序列(SEQ ID NO:26)。
[0070]图30显示编码HPV16L1/L2 (56-81)嵌合多肽的人密码子优化的DNA核苷酸序列(SEQ ID NO:27)。
[0071]图31显示编码HPV16L1/L2 (17-36)嵌合多肽的人密码子优化的DNA核苷酸序列(SEQ ID NO:28)。
[0072]图32显示编码HPV L1/L2BPV (1-88)嵌合多肽的人密码子优化的DNA核苷酸序列(SEQ ID NO:29)。
[0073]发明详述
[0074]本发明将结合附图作为参考在下文进行更充分的描述，其中展示一些，但不是所有本发明实施方案。
[0075]所描述的发明不应该限制于公开的特定实施方案且其它实施方案意在包含在本发明的范围内。尽管本文用到特定术语，其仅用于普通的和描述性的理解且不是为了限制。
[0076]除非另有指示，本文所用的术语具有本领域承认的意义。
[0077]本发明提供一种具有规则形状的和尺寸为直径约30nm的嵌合人乳头瘤病毒(HPV)病毒样颗粒(VLP)和一种通过施用本发明的嵌合HPV VLP预防和/或治疗HPV感染和/或宫颈癌的方法。尤其是，所述形状规则的直径为30nm的嵌合HPV VLP包含HPV类型16的LI蛋白，其中，人密码子优化的核苷酸序列编码的约13个氨基酸和26个氨基酸的HPVL2肽插入在氨基酸残基414，由此代替HPV LI中的相应氨基酸。
[0078]LI主要衣壳蛋白自然地自组装为病毒样颗粒(VLP)，所述病毒样颗粒形成当前HPV疫苗的基础(Schiller等人，2008)。重组VLP已在几种不同的宿主系统中表达，包括哺乳动物，昆虫，酵母，细菌和植物。
[0079]HPV-16LIC-端螺旋4 (h4)在VLP组装中起作用，且位于残基414-426之间(Varsani等人,2003a)。移除这些基序导致壳粒形成,且防止进一步自组装为VLP (Bishop等人，2007)。此外，在高度保守的175和428半胱氨酸残基之间有二硫键，且这些半胱氨酸的突变导致形成壳粒而不是VLP (Li等人,1998 ;McCarthy等人,1998 ；Sapp等人,1998 ；Fligge等人,2001 ；Varsani等人,2006b)。然而,在本研究中显示,人密码子优化的核苷酸序列编码的约13个氨基酸到约26氨基酸的HPV L2肽的插入，当插入在氨基酸残基414以代替HPV LI中相应氨基酸时，能够成功组装为小的，形状规则的直径约为30nm的嵌合VLP。
[0080] 商业化的HPV疫苗(目前表达在酵母和昆虫细胞中)是昂贵的(Schiller等人，2008)，尤其由于生产和纯化方案的成本高。此外，复杂的纯化方法和大范围的预处理可能影响其稳定性，且组装的LI蛋白的回收和变性的LI无法诱导中和抗体。因此，使用廉价的表达系统和简单的生产纯化工艺生产疫苗抗原在任何商业化蛋白生产系统中仍然具有高的优先级。
[0081]本发明用以下实施例进行描述，所述实施例不理解为对本发明的任伺限制。
实施例
[0082]实施例1:L1嵌合体的瞬时植物表达
[0083]方法和材料
[0084]植物表达载体
[0085]三种二元农杆菌植物表达载体用来优化HPV嵌合体的表达:p TRAc和pTRAkc-rbcs1-cTP (由 Rainer Fischer 教授提供；Fraunhofer Institute for Molecular Biology andApplied Ecology,Germany)且豆黄矮双生病毒(Bean yellow dwarf geminivirus,BeYDV)载体pRIC3(由Richard Halley-Stott构建)。两个是非复制型载体,其使表达的蛋白或者革巴向细胞质(pTRAc)或者祀向叶绿体(pTRAkc-rbcsl-cTP) (Maclean等人,2007),且第三种载体是一种自复制型细胞质靶向载体(PRIC3)。pRIC3载体是pRIC载体的第三代载体(Regnard等人，2010)，其减小了尺寸且显示出在植物中类似的对转基因表达的放大。
[0086]所述载体含有许多植物中蛋白表达所需的元件(图1)。pTRAkc-rbcsl-cTP载体(图1A)由pTRAc衍生(图1B)，且含有马铃薯rbcSl基因叶绿体-转移的肽序列。pRIC3(图1D)包含自复制所需的BeYDV复制相关蛋白(Regnard等人，2010)。
[0087]LI嵌合体的合成
[0088]用于本研究的四种HPV-16L1/L2嵌合体在表1中描述。所述嵌合体由一种南非HPV-16LI分离基因序列组成(SALI =GenBank登录号AY177679)，所述基因序列具有位于h4螺旋内在aa414处(指示“F-位置”)的L2表位。这些嵌合基因由Inga Hitzeroth博士(Plant Vaccine Group, UCT)设计，由 GENEART AG (Regensburg, Germany)使用高通量基因装配进行人密码子优化和经电脑模拟(in silico)合成。合成的L2表位序列在F-位置代替LI序列而不是简单的插入LI蛋白。
[0089]表1:HPV_16L1嵌合构建体概述
[0090]
【权利要求】
1.一种嵌合人乳头瘤病毒(HPV)病毒样颗粒(VLP),其具有约30nm的直径,所述嵌合HPV VLP包含由人密码子优化的核苷酸序列编码的嵌合HPV16L1/L2多肽，所述嵌合HPV16L1/L2多肽进一步包含含有约13个氨基酸到约26个氨基酸的HPV L2肽的HPV16L1多肽，所述HPV L2肽从所述HPV16L1多肽的残基414插入，并且其中插入的HPV L2肽的氨基酸替代HPV16L1多肽中相应的氨基酸。
2.权利要求1的嵌合HPVVLP，其中插入的HPV L2肽选自由以下组成的组: (i)由SEQID NO:7的人密码子优化的核苷酸序列编码的SEQ ID NO:3的13个氨基酸的肽； (ii)由SEQID NO:9的人密码子优化的核苷酸序列编码的SEQ ID NO:5的20个氨基酸的肽；和 (iii)由SEQID NO:8的人密码子优化的核苷酸序列编码的SEQ IDNO:4的26个氨基酸的肽。
3.权利要求1或2的嵌合HPVVLP，其中编码嵌合HPV16L1/L2多肽的人密码子优化的核苷酸序列被修饰为核定位信号缺失。
4.权利要求1到3任一项的嵌合HPVVLP，其中所述嵌合HPV16L1/L2多肽包含选自由SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24组成的组的氨基酸序`列。
5.权利要求4的嵌合HPVVLP，其中所述嵌合HPV16L1/L2多肽由选自由SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28组成的组的人密码子优化的核苷酸序列编码。
6.权利要求1到5任一项的嵌合HPVVLP，其中所述嵌合HPV16L1/L2多肽在植物中表达和从植物中回收。
7.权利要求6的嵌合HPVVLP，其中所述嵌合HPV16L1/L2多肽靶向植物的叶绿体。
8.一种产生具有约30nm直径的嵌合HPV VLP的方法，所述方法包括以下步骤: (i)提供编码嵌合HPV16L1/L2多肽的嵌合人密码子优化的核苷酸序列，所述嵌合HPV16L1/L2多肽包括具有约13个氨基酸到约26个氨基酸的HPV L2肽的HPV16L1多肽，所述HPV L2肽从所述嵌合HPV16L1/L2多肽的残基414插入，其中插入的HPV L2肽的氨基酸替代HPV16L1多肽中相应的氨基酸； (?)将所述嵌合人密码子优化的核苷酸序列克隆到适于在植物中表达多肽的表达载体中； (iii)用步骤(ii)的表达载体转化或渗入植物细胞； (iv)在步骤(iii)的植物细胞中表达所述嵌合HPV16L1/L2多肽，从而表达的嵌合HPV16L1/L2多肽装配进入具有约30nm的直径的嵌合HPV VLP ;和 (V)从所述植物细胞回收所述嵌合HPV VLP。
9.权利要求8的方法，其中步骤(ii)的表达载体进一步包括靶向序列，所述靶向序列编码引导所表达的嵌合HPV16L1/L2多肽从植物细胞的细胞质到叶绿体的多肽。
10.权利要求8或9的方法，其中所述表达载体包含与表达载体的编码序列可操作连接的启动子和其它调节子或类似物。
11.权利要求8到10任一项的方法，进一步包括用适于抑制植物中转录后基因沉默的抑制蛋白共渗入或共转化植物细胞的步骤。
12.权利要求11的方法，其中所述抑制蛋白是番茄斑萎病毒的NSs蛋白或番茄丛矮病毒的pl9。
13.权利要求8到12任一项的方法，其中插入的HPVL2肽选自由以下组成的组: (i)由SEQID NO:7的人密码子优化的核苷酸序列编码的SEQ ID NO:3的13个氨基酸的肽； (ii)由SEQID NO:9的人密码子优化的核苷酸序列编码的SEQ ID NO:5的20个氨基酸的肽；和(iii)由SEQID NO:8的人密码子优化的核苷酸序列编码的SEQ ID NO:4的26个氨基酸的妝。
14.一种预防或治疗受试者中HPV感染或宫颈癌的方法,所述方法包括向受试者施用治疗有效量的权利要求1-7任一项的嵌合HPV VLP。
15.权 利要求14的方法，进一步包括在受试者中诱发免疫应答的步骤。
16.权利要求15的方法，其中所述免疫应答是中和抗体应答或细胞毒T淋巴细胞应答。
17.权利要求15的方法，其中所述免疫应答是对受试者中存在的多种HPV类型的交叉保护免疫应答。
18.权利要求14到17任一项的方法，其中所述受试者是人。
19.权利要求1到7任一项的嵌合HPVVLP，其用于预防或治疗受试者中HPV感染或宫颈癌的方法中，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的所述嵌合HPV VLP。
20.权利要求19的嵌合HPVVLP，所述方法进一步包括在受试者中诱发免疫应答的步骤。
21.权利要求20的嵌合HPVVLP，其中所述免疫应答是中和抗体应答或细胞毒T淋巴细胞应笞。
22.权利要求20的嵌合HPVVLP，其中所述免疫应答是对受试者中存在的多种HPV类型的交叉保护免疫应答。
23.权利要求19-22任一项的嵌合HPVVLP，其中所述受试者是人。
24.权利要求1到7任一项的嵌合HPVVLP在制备用于预防或治疗受试者中HPV感染或宫颈癌方法的药物中的用途，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的所述药物。
25.权利要求24的用途，所述方法进一步包括在受试者中诱发免疫应答的步骤。
26.权利要求25的用途，其中所述免疫应答是中和抗体应答或细胞毒T淋巴细胞应答。
27.权利要求25的用途，其中所述免疫应答是对受试者中存在的多种HPV类型的交叉保护免疫应答。
28.权利要求24到27任一项的用途，其中受试者是人。
29.—种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1到7任一项的嵌合HPV VLP和药学上可接受的载体或佐剂。
【文档编号】C12N15/62GK103890177SQ201280052968
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年12月3日 优先权日:2011年12月1日
【发明者】爱德华·彼得·雷比茨基, 因加·伊莎贝尔·希策罗特 申请人:开普敦大学