生物合成1,3丁二烯的方法

生物合成1,3丁二烯的方法
【专利摘要】本申请描述了通过在丁二烯合成底物中形成两个乙烯基而产生丁二烯的生物化学途径。本申请描述的这些途径依赖于用于最终酶促步骤的酶如甲羟戊酸二磷酸脱羧酶、异戊二烯合酶和脱水酶。
【专利说明】生物合成1,3 丁二烯的方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2011年12月2日提交的美国申请61/566, 085和2012年10月17日 提交的美国申请61/714, 883的优先权，将其全部公开内容并入本文作为参考。

【技术领域】
[0003] 本发明涉及生物合成1，3- 丁二烯的方法，并且更具体地，涉及使用一种或者多种 分离的酶如去氢酶、单氧化酶、去饱和酶、脱水酶，和脱羧酶，或者使用表达这些酶中的一种 或者多种的重组宿主细胞合成1，3- 丁二烯。

【背景技术】
[0004] 1，3-丁二烯（下文称为丁二烯）是用于生产合成橡胶（包括苯乙烯-丁二烯-橡 胶（SBR)、聚丁二烯（PB)、苯乙烯-丁二烯胶乳（SBL)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯树脂 (ABS)、丁腈橡胶，和己二腈）的重要单体，其在制造Nylon-66 (White, Chemico-Biological Interactions, 2007, 166, 10-14)中使用。
[0005] 丁二烯通常作为蒸汽裂化过程的副产品产生，蒸馏成粗制丁二烯流，并经萃取蒸 馈纯化（White, Chemico-Biological Interactions, 2007, 166, 10-14)。
[0006] 除了其它方法之夕卜，有意的丁二烯也可通过以下方法制备：正丁烷和 正丁烯的脱氢（Houdry方法）；和正丁烯的氧化脱氢（Oxo-D或者O-X-D方法） (White, Chemico-Biological Interactions, 2007, 166, 10-14)〇
[0007] 在工业上，全球9 5 %的丁二烯生产使用基于石化产品的给料如石脑油经 蒸汽裂化过程进行。有意的丁二烯的生产效果不好，制造成本高并且工艺收率低 (White, Chemico-Biological Interactions, 2007, 166, 10-14)〇
[0008] 依赖于石化产品给料和对于有意的丁二烯而言的能源密集型催化步骤；生物技术 经生物催化提供了替代方法。生物催化是使用生物催化剂如酶实施有机化合物的生物化学 转换。
[0009] 因此，针对这样的背景，很明显需要用于制造中间体（具体为丁二烯）的可持续的 方法，其中所述方法基于生物催化剂（Jang等人，Biotechnology and Bioengineering, 20 12, 109(10)，2437 - 2459)。
[0010] 生物来源的给料和石化产品的给料均为用于生物催化过程的可行的起始原料。
[0011] 在经生物催化过程合成丁二烯中，在中等碳链长度的酶底物中产生两个乙烯基是 一个关键的考虑因素。
[0012] 在原核生物或者真核生物中没有已知的导致合成丁二烯的酶途径。已经提出了用 于由生物质-糖产生1，3-丁二烯的三种可能的途径：（1)经巴豆酰基-CoA从乙酰基-CoA ; (2)从赤藓糖-4-磷酸；和（3)经与丙二酸单酰基-CoA和乙酰基-CoA的缩合反应。然而， 使用这些策略的信息还未有报导（Jang等人，Biotechnology and Bioengineering, 2012， 109(10)，2437 - 2459)。
[0013] 通过原核生物或者真核生物合成的最接近的类似化合物是2-甲基-1，3- 丁二 烯（异戊二烯），给出短的五碳链长和两个乙烯基。异戊二烯可经两种导致前体二甲基 乙烯基-PP的途径合成，即，甲轻戊酸和非甲轻戊酸途径0^^115^1]^，13;[08(3；[.13;[(^6(3111101. Biochem.，2002, 66(8)，1619-1627)。
[0014] 甲羟戊酸途径包括一种脱羧酶，甲羟戊酸二磷酸脱羧酶（下文称为 MDD),其在异戊二烯的前体中产生第一乙烯基〇(1^11}^11^，13;[08(3；[.13;[(^6(3111101. Biochem.，2002, 66(8)，1619-1627)。
[0015] 因此在从非天然底物合成丁二烯中可将甲羟戊酸二磷酸脱羧酶（EC 4. I. 1. 33) 指定为候选酶。
[0016] 在阐释与天然底物甲羟戊酸二磷酸相关的3-甲基的功能中，已经证实，图12(a) 中所示的3-羟基-5-二磷酸戊酸的转换数k eat为0. 23 ±0. 05 [s_1]，这与天然底物的标称 的 8. 33±l[s-1]形成对比（Dhe-Paganon 等人，Biochemistry, 1994,33, 13355 - 13362)。另 夕卜，与底物的反应仅进展至3-羟基的磷酸化，S卩，未检测到脱羧产物，这暗示与天然底物相 t匕，脱羧率至少降低300倍。总之，在稳定碳正离子过渡态中3-甲基被认为是不可缺少的 (Dhe-Paganon 等人，Biochemistry, 1994, 33, 13355 - 13362)。
[0017] 已经证实，来自酿酒酵母菌的MDD酶接受3-羟基-3-甲基-丁酸（图12(b))(其 包含稳定碳正离子过渡态的3-甲基）作为底物，从而将所述底物转化成异丁烯。然而，t匕 活性为 4. 8 ? 10_6[ ii mol/(min ? mg)]，比 6. 4[ ii mol/(min ? mg)]的天然底物活性低得多 (Gogerty 和 Bobik，Applied&Environmental Microbiology, 2010, 76(24)，8004 - 8010)。
[0018] 已经阐明了在催化裂隙（catalytic cleft)的外围上的丝氨酸和精氨酸残基与天 然底物甲羟戊酸二磷酸的焦磷酸酯基的关键底物结合相互作用。因此，在催化裂隙内的正 确底物取向对于酶活性是重要的，这似乎解释了当接受3-羟基-3-甲基-丁酸（图14 (b)) 作为底物时 MDD 的低活性（Barta 等人，Biochemistry, 2012, 51，5611-5621)。
[0019]与天然底物相关的3-甲基和焦磷酸酯基在支持MDD活性中的重要性的教导反对 在从不含这些关键基团的非天然前体合成丁二烯中使用MDD。
[0020] 酶异戊二烯合酶（下文称为ISPS)在异戊二烯合成的最终前体二甲基乙烯基-PP 中产生第二乙烯基。
[0021] 因此，在从非天然底物合成丁二烯中可将异戊二烯合酶（EC 4. 2. 3. 27)指定为候 选酶。
[0022] 类似于MDD，与天然底物二甲基乙烯基-PP相关的3-甲基在稳 定已经被假定为瞬时中间产物的碳正离子中发挥重要作用（Silver和 Fall, J. Biol. Chem.，1995, 270 (22)，13010 - 13016 ;Kuzma 等人，Current Microbiology, 1995, 30, 97-103)。
[0023] 3-甲基在支持ISPS活性中的重要性的教导反对从不含3-甲基的非天然前体合成 丁二烯中使用ISPS。
[0024] 除了 MDD和ISPS，微生物通常借助脱水酶、脱氨酶、去饱和酶或者脱羧酶活性可在 代谢物中产生乙烯基。然而，这些酶活性很少催化末端乙烯基的形成。脱水酶和脱氨酶通 常接受具有活化的氢原子的脂肪酸类似物，或者芳族化合物，其中芳环用作吸电子基团。去 饱和酶在脂肪酸合成中起着重要作用，在沿着长链脂肪酸的固定的非末端位置产生不饱和 键。接下来，作用于末端羧基的脱羧酶通常在催化后在末端位置留下相关的a官能团。因 此，这些酶的相关酶活性的教导反对将它们用于在短链或者中链碳代谢物中产生末端乙烯 基以合成丁二烯。


【发明内容】

[0025] 本申请至少部分地基于以下发现：可能构建用于产生中链碳代谢物的生物化学途 径，在所述中链碳代谢物中可形成两个乙烯基，从而合成丁二烯。本申请所述的这些途径依 赖于酶如MDD、ISPS和脱水酶，用于最终酶促步骤。
[0026] 在本发明的发明人的意料不到的发现之前，不知道能够在中链碳代谢物中形成两 个末端乙烯基的酶存在或者可被制备用于合成丁二烯。
[0027]因此，在一个方面，本申请提供可将丁二烯合成底物转化成丁二烯的酶。本申请使 用的术语"丁二烯合成底物"是指这样的底物：酶可催化这种底物的反应，直接得到1，3- 丁 二烯，或者得到在一个或者多个酶催化反应后转化成1，3- 丁二烯的产物。
[0028] 在一些实施方案中，导致丁二烯合成的第一乙烯基在4-草酰巴豆酸 (4-oxalocrotonate)、2_ 轻基粘康酸半醒（2-hydroxymuconate semialdehyde)，或者 2_ 轻 基 _6_ 氧代 _2, 4_ 二烯 _1，9-壬二酸（2-hydroxy-6_oxonona-2, 4-diene-l，9-dioate)中 酶促形成，从而产生2-氧代戊-4-烯酸（2-〇xopent-4-enoate)。参见图2。
[0029] 在一些实施方案中，导致丁二烯合成的第一乙烯基在丙酰基_CoA、乳酰基-CoA， 或者3-羟基丙酰基-CoA中酶促形成，从而产生丙烯酰基-CoA。参见图3。
[0030] 在一些实施方案中，导致丁二烯合成的第一乙烯基在（R) 3-羟基-戊 酸（(R)3-hydroxy_pentanoate)中酶促形成，从而产生3-轻基戊-4-烯酸 (3_hydroxypent-4-enoate)。参见图 4。
[0031] 在一些实施方案中，导致丁二烯合成的第一乙烯基在戊-2-烯酰基[acp]中酶促 形成，从而产生2, 4-戊二烯酰基-[acp]。参见图5。
[0032] 在一些实施方案中，导致丁二烯合成的第一乙烯基在5-羟基戊酰基-CoA(经 5_羟基-戊-2-烯酰基-CoA作为中间体）或者戊-3-烯酰基-CoA中酶促形成，从而产生 2, 4_戊二稀醜基_CoA。参见图6。
[0033] 在一些实施方案中，导致丁二烯合成的第一乙烯基在4-羟基丁酰基-CoA、 003-羟基丁酰基-&^或者戊烯二酸单酰基-&^&1此&(：〇1^1-&^)中酶促形成，从而产生 巴豆醜基-CoA(crotonyl-CoA)。参见图7。
[0034] 在一些实施方案中，导致丁二烯合成的第一乙烯基在2-丁醇中酶促形成，从而产 生3-丁烯-2-醇。参见图8。
[0035] 在一些实施方案中，导致丁二烯合成的第二乙烯基通过甲羟戊酸二磷酸脱羧酶 (mevalonate diphosphate decarboxylase,MDD)( 一种归类在EC 4. I. I. 33下的酶）形成 (图9)。例如，将2-羟基戊-4-烯酸相继通过两种或者更多种酶转化；从而在最后的酶促 转化中通过脱羧直接产生丁二烯（图1，反应X)。
[0036] 在一些实施方案中，导致丁二烯合成的第二乙烯基通过异戊二烯合酶（ISPS)( - 种归类在EC 4. 2. 3. 27下的酶）形成（图10)。例如，活化的丁烯醇（二磷酸酯）可通过一 种或者多种酶从丁烯醇生成（图1，反应II);从而通过去磷酸化在最后的酶促转化中直接 产生丁二烯（图1，反应III)。
[0037] 在一些实施方案中，导致丁二烯合成的第二乙烯基通过归类在EC 4. 2.L-中的 脱水酶如芳樟醇脱水酶（EC 4. 2. 1. 127)、奇维酮（kievitone)水合酶（EC 4. 2. 1. 95)、油酸 水合酶（EC 4. 2. 1. 53)和类胡萝卜素1，2-水合酶（EC 4. 2. 1. 131)形成（图11)。这种脱 水酶接受羟基化底物如丁烯醇。例如，丁烯醇可在一个或者多个酶促步骤中通过脱水酶、水 合酶、去饱和酶、去氢酶或者脱羧酶活性从丁二醇、丁醇、丁烯、丁烯醛或者C5烯醇生成（图 1，反应IV、V、VI、VII、IX);从而在最后的酶促转化中通过脱水直接产生丁二烯（图1，反应 I)。丁烯醇包括，例如，1- 丁烯-1-醇、2- 丁烯-1-醇和3- 丁烯-2-醇（参见图1)。
[0038] 例如，本申请提供将丁烯醇转化成丁二烯的酶。这种转化可通过单一酶进行，或者 可通过相继作用的两种或者更多种酶进行（也就是说，例如，第一酶作用在四碳分子上产 生以第一丁烯醇，然后第二酶作用在该第一丁烯醇上以产生丁二烯）（参见例如，图1，反应 I)。
[0039] 本申请也提供从不饱和的羟基化四碳分子产生丁二烯的方法，其包括至少一个生 物催化步骤。例如，可将丁烯醇在转化成丁二烯之前活化成相应的丁烯醇二磷酸酯（参见 例如，图1，反应II和III)。在一些实施方案中，丁烯醇选自1 丁烯2醇、1 丁烯3醇、1 丁烯 4醇、2 丁烯1醇、2 丁烯2醇、2 丁烯3醇或者2 丁烯4醇。对于丁烯醇如1- 丁烯-1-醇、 1-丁烯-2-醇、2-丁烯-2-醇，和2-丁烯-3-醇，所述丁烯醇可作为相应的酮或者醛如1-丁 醛或者2- 丁酮的烯醇化物原位生成。
[0040] 在一些实施方案中，丁烯醇通过酶的作用从选自以下的四碳分子产生：丁二醇 (1，4_ 丁二醇、1，3_ 丁二醇、2,3_ 丁二醇）（图 1，反应 IV)或者丁醇（1-丁醇，或者 2-丁 醇）（图1，反应V)或者丁烯（1- 丁烯或者2- 丁烯）（图1，反应VI)或者丁烯醛如1- 丁烯 醛或者2-丁烯醛，或者2-酮-丁-1-烯（图1，反应VII)。
[0041] 通过酶进行的反应可为净脱水（即，通过具有脱水酶活性的酶从分子除去H2O,反 应IV)、通过具有去饱和酶活性的酶或者酶复合物脱氢（即，从分子除去氢，其在通过酶催 化的反应中导致分子的碳骨架的去饱和）（反应V)、通过具有羟化酶活性的酶如烯烃单氧 化酶或者细胞色素P450或者《 -羟化酶羟基化（即，用羟基替代氢）（反应VI)，或者通过 氧化还原酶/酮还原酶还原以将丁烯醛或者C4不饱和酮转化成丁烯醇。对于脱水步骤，酶 可为与用于脱水丁烯醇形成丁二烯的酶种类相同的酶种类，或者可为其它酶种类。在丁烯 醇中双键的迁移可通过异构酶催化。
[0042] 本申请还提供来自酶种类4. 2.L-的酶，其将丁二醇转化成丁烯醇（图1，反应 VIII)。
[0043] 在一些实施方案中，丁烯醇如1-丁烯-4-醇通过脱羧酶（例如来自EC 4. I. L-的 脱羧酶）的作用从五碳分子如2-羟基戊-4-烯酸产生（图1，反应IX)。2-羟基戊-4-烯 酸也可通过脱羧酶或者GHMP激酶直接转化成丁二烯，而不形成中间体丁烯醇（图1，反应 X)。
[0044] 在一些实施方案中，丁烯醇选自1 丁烯2醇、1 丁烯3醇、1 丁烯4醇、2 丁烯1醇、 2 丁烯2醇、2 丁烯3醇或者2 丁烯4醇。对于丁烯醇如1- 丁烯-2-醇、2- 丁烯-2-醇，和 2_ 丁烯-3-醇，丁烯醇可作为相应的酮或者醛如1- 丁醛或者2- 丁酮的烯醇化物原位生成。
[0045] 在一个方面，本申请的特征在于生物合成丁二烯的方法。所述方法包括在丁二烯 合成底物中形成两个末端乙烯基。第一乙烯基可在丁二烯合成底物中酶促形成，从而产生 选自以下的化合物：2-氧代戊-4_烯酸、丙烯基-CoA、（R) 3-轻基戊-4-烯酸、2, 4-戊二烯 醜基-[acp]、2, 4_戊二稀醜基-CoA、巴醜基-CoA，和3_ 丁稀_2_醇。
[0046] 在一个方面，2-氧代戊-4-烯酸可通过在以下物质中形成第一乙烯基产生： (i) 4-草酰巴豆酸，使用归类在EC 4. 1.1. 77中的4-草酰巴豆酸脱羧酶，（ii) 2-羟基粘 康酸半醛，使用归类在EC 3. 7. 1. 9中的2-羟基粘康酸-半醛水解酶，或者（iii) 2-羟 基-6-氧代-2, 4-二烯-1，9-壬二酸，使用归类在EC 3. 7. 1. 14中的2-羟基-6-氧 代-2, 4-二烯壬二酸水解酶。2-氧代戊-4-烯酸可通过以下方法生成：使用归类在EC 1. 2. 1. 32下的2氨基粘康酸半醛去氢酶将2-羟基粘康酸半醛转化成2-羟基粘康酸，使用 归类在EC 5. 3. 2. 6下的2-羟基粘康酸互变异构酶将2-羟基粘康酸转化成4-草酰巴豆 酸，和使用归类在EC 4. 1. 1.77下的4-草酰巴豆酸脱羧酶将4-草酰巴豆酸转化成2-氧代 戊-4-烯酸。2-羟基粘康酸半醛可通过以下方法产生：使用归类在EC 1.13. 11. 2下的儿 茶酚2, 3-双加氧酶将儿茶酚转化成2-羟基粘康酸半醛。儿茶酚通过以下方法产生：使用 归类在EC 1. 14. 12. 1下的邻氨基苯甲酸1，2_双加氧酶（anthranilate 1,2-dioxygenase) 转化邻氨基苯甲酸（anthranilate)，或者使用归类在EC 4. I. 1. 63下的原儿茶酸脱羧酶 (protocatechuate decarboxylase)转化原儿茶酸（protocatechuate)。邻氨基苯甲酸 (anthranilate)可通过以下方法产生：使用归类在EC 4. 1. 3. 27下的邻氨基苯甲酸合酶转 化分支酸（chorismate)。原儿茶酸可通过以下方法产生：使用归类在EC 4. 2. 1.118下的 3-去氢莽草酸脱水酶转化3-去氢莽草酸（3-dehydroshikimate)。
[0047] 在一个方面，2-羟基粘康酸半醛可通过以下方法产生：使用5-羧基-2-羟基粘 康酸-6-半醒脱羧酶如praH编码的5-羧基-2-轻基粘康酸-6-半醒脱羧酶转化5-羧 基 _2_ 轻基粘康酸 _6_ 半醒（5-carboxy-2_hydroxy muconate-6-semiladehyde)。5_ 竣 基-2-羟基粘康酸-6-半醛可通过以下方法产生：使用原儿茶酸2, 3-双加氧酶如praA编 码的原儿茶酸2, 3-双加氧酶转化原儿茶酸。2-羟基-6-氧代-2, 4-二烯-1，9-壬二酸 可通过以下方法产生：使用归类在EC 1. 13. 11. 16下的3-羧基乙基儿茶酚2, 3-双加氧酶 转化 2, 3_ 二轻基苯基丙酸（2, 3-dihydroxy phenylpropionoate)。2, 3_ 二轻基苯基丙酸 可通过以下方法产生：使用归类在EC 1. 3. 1. 87下的3-(顺式-5, 6-二羟基环己-1，3-二 烯-1-基）丙酸去氢酶转化顺式-3_(羧基-乙基）_3, 5-环-己二烯-1，2-二醇。顺 式-3_(羧基-乙基）_3, 5-环-己二烯-1，2-二醇可通过以下方法产生：使用归类在EC L 14. 12. 19下的3-苯基丙酸双加氧酶转化3-苯基-丙酸（3-phenyl-propionate)。3-苯 基-丙酸可通过以下方法产生：使用归类在EC 1. 3. 1. 31下的2-烯酸还原酶转化E-肉桂 酸。E-肉桂酸可通过以下方法产生：使用归类在EC 4. 3. 1. 24下的苯基丙氨酸脱氨酶转化 L-苯基丙氨酸。
[0048] 在一个方面，丁二烯合成底物可为丙酰基-CoA。丙烯酰基-CoA可通过在以下 物质中形成第一乙烯基产生：（i)丙酰基-CoA，使用归类在EC1. 3. 8. 1下的丁酰基-CoA 去氢酶或者归类在EC1.3. 8.7下的中链酰基-CoA去氢酶，（ii)乳酰基-CoA，使用归类 在EC4. 2. 1.54下的乳酰基-CoA脱水酶，或者（iii) 3-羟基丙酰基-CoA，使用归类在EC 4. 2. 1. 116下的3-羟基丙酰基-CoA脱水酶。丙酰基-CoA可通过以下方法产生：使用归类 在EC2. 1. 3. 1下的甲基丙二酸单酰基-CoA羧基转移酶或者归类在EC4.I.1. 41下的甲基 丙二酸单酰基-CoA脱羧酶转化（2S)-甲基丙二酸单酰基-CoA ((2S)-methylmalonyI-CoA)。 (2S)-甲基丙二酸单酰基-CoA可通过以下方法产生：使用归类在EC 5. I. 99. 1下的甲基丙 二酸单酰基-CoA差向异构酶转化（2R)-甲基丙二酸单酰基-CoA。（2R)-甲基丙二酸单酰 基-CoA可通过以下方法产生：使用归类在EC 5. 4. 99. 2下的甲基丙二酸单酰基-CoA变位 酶转化琥拍酸单酰基-CoA(succinyl-CoA)。
[0049] 丙酰基-CoA可通过以下方法产生：使用归类在EC 2.3. L-下的2-酮丁酸甲酸 裂解酶（2-ketobutyrate formate-lyase)如tdcE编码的2-酮丁酸甲酸裂解酶转化2-氧 代-丁酸（2-oxo-butyrate)。2_氧代-丁酸可通过以下方法产生：使用归类在EC 4. 3. 1. 19 下的苏氨酸脱氨酶转化L-苏氨酸。
[0050] 丙酰基-CoA可通过以下方法产生：使用丙醛去氢酶如pduP编码的丙醛去氢酶 转化丙醇。丙醇可通过以下方法产生：使用归类在EC 4.2. 1.28下的丙二醇脱水酶转化 1，2-丙二醇。
[0051] 丙酰基-CoA可由3-乙酰丙酸（levulinic acid)通过以下方法产生：使用归类在 EC 2. 3. 1.-下的转移酶转化3-乙酰丙酰基-CoA。3-乙酰丙酰基-CoA可通过以下方法产 生：使用归类在EC 6. 2. 1.-下的酰基-CoA合成酶或者连接酶转化3-乙酰丙酸。
[0052] 乳酰基-CoA可通过以下方法产生：使用归类在EC 2. 8. 3. 1下的丙酸CoA-转移酶 转化L-乳酸（L-Iactate)。L-乳酸可通过以下方法产生：使用归类在EC 1.1. 1.27下的 L-乳酸去氢酶转化丙酮酸（pyruvate)。
[0053] 3-羟基丙酰基-CoA可通过以下方法产生：使用归类在EC 3. 1. 2. 4下的3-羟 基异丁酰基-CoA水解酶转化3-轻基丙酸（3-hydroxypropionate)或者使用归类在EC I. I. 1. 59下的3-轻基丙酸去氢酶转化丙二酸半醒（malonate semialdehyde)。丙二酸半 醛可通过以下方法产生：使用归类在EC 1. 2. 1. 75下的丙二酸单酰基-CoA还原酶转化丙二 酸单酰基-CoA。
[0054] 丙酰基-CoA可通过以下方法产生：使用归类在EC 1. 3. 8. 1下的丁酰基-CoA去氢 酶或者归类在EC 1. 3. 8. 7下的中链酰基-CoA去氢酶转化丙烯酰基-CoA。
[0055] (R) 3-羟基戊-4-烯酸可通过以下方法产生：使用去饱和酶/单氧化酶或者细胞 色素P450在（R) 3-羟基戊酸中形成第一乙烯基。（R) 3-羟基-戊酸可通过以下方法产生： 使用归类在EC3. 1. 2.-下的硫酯酶转化（R) 3-羟基戊酰基-CoA。（R) 3-羟基戊酰基-CoA 可通过以下方法产生：使用归类在ECI. I. 1. 36下的乙酰乙酰基-CoA还原酶转化3-氧代 戊酰基-CoA。3-氧代戊酰基-CoA可通过以下方法产生：使用归类在EC2. 3. 1. 16下的乙 醜基-CoA C-醜基转移酶（acetyl-CoA C-acyltransferase)转化丙醜基-CoA。
[0056] 2, 4-戊二烯酰基-[acp]可通过以下方法产生：使用酰基_[acp]去氢酶在 戊-2-烯酰基-acp中形成第一乙烯基。2, 4-戊二烯酰基-CoA可通过在以下物质中形成第 一乙烯基产生：（i) 5-羟基戊酰基-CoA，使用归类在EC 4. 2. 1.-下的5-羟基戊酰基-CoA 脱水酶，或者（ii)戊-3-烯酰基-CoA，使用归类在EC 1.3. 1.34下的2, 4-二烯酰基辅酶A 还原酶。5-轻基戊酰基-CoA脱水酶可源于Clostridium viride。
[0057] 巴豆酰基-CoA可通过在以下物质中形成第一乙烯基产生：（i)戊烯二酸单酰 基-CoA，使用归类在EC 4. 1.1. 70下的戊烯二酸单酰基-CoA脱羧酶，（ii) 4-羟基丁酰 基-CoA(4-hydroxybutryl_CoA)，使用归类在 EC 4. 2. L 120 下的 4-轻基丁酰基-CoA 脱 水酶和归类在EC 5. 3. 3. 3下的乙烯基乙酰基-CoA异构酶，或者（iii) (R) 3-羟基丁酰 基-CoA，使用归类在EC 4. 2. 1. 119下的烯酰基-CoA水合酶。
[0058] 3- 丁烯-2-醇可通过以下方法产生：使用去饱和酶或者单氧化酶在2- 丁醇中形 成第一乙烯基。
[0059] 第二乙烯基在（R)3_羟基戊-4-烯酸中通过甲羟戊酸二磷酸脱羧酶（MDD)酶促形 成。MDD可归类在EC 4. 1.1. 33下。在催化裂隙的催化性精氨酸残基的任一侧的五个残基 中，MDD可包含最少四个丝氨酸残基。MDD可来自链球菌属或者葡萄球菌属。
[0060]第二乙烯基可在 2-丁烯-1-醇二磷酸酯（2-buten-l-ol diphosphate)或者 3-丁 烯-2-醇二磷酸酯（3-buten_2-〇l diphosphate)中通过异戊二烯合酶（ISPS)酶促形成。 第二乙烯基可在3- 丁烯-2-醇或者2- 丁烯-1-醇中通过酶种类EC 4. 2. 1.-中的脱水酶 如芳樟醇脱水酶（EC 4. 2. 1. 127)、奇维酮水化酶（kievitone hydrase) (EC 4. 2. 1. 95)、油 酸水合酶（EC 4. 2. 1. 53)或者类胡萝卜素1，2-水合酶（EC 4. 2. 1. 131)酶促形成。
[0061] 戊-2-烯酰基_[acp]可通过以下方法产生：使用归类在EC 4. 2. 1.59下的3-羟 基酰基-[acp]脱水酶转化（R) 3-羟基戊酰基-[acp]。（R) 3-羟基戊酰基-[acp]可通过以 下方法产生：使用归类在EC I. I. 1. 100下的3-氧代酰基_[acp]还原酶转化3-氧代戊酰 基 _[acp]〇
[0062] 3-氧代戊酰基-[acp]可通过以下方法产生：使用归类在EC 2.3. 1.41下的酮 酰基- [acp]合酶I和酰基-转移酶如tcsA转化丙酰基-CoA。
[0063] 戊-2-烯酰基- [acp]可通过以下方法产生：使用酰基转移酶转化戊-2-烯酰 基-CoA。戊-2-烯酰基-CoA可通过以下方法产生：使用归类在EC 4. 2. 1.119下的烯酰 基-CoA水合酶转化（R) 3-羟基戊酰基-CoA。（R) 3-羟基戊酰基-CoA可通过以下方法产生： 使用归类在EC I. I. 1. 36下的乙酰乙酰基-CoA还原酶转化3-氧代戊酰基-CoA。
[0064] 3-氧代戊酰基-CoA可通过以下方法产生：使用归类在EC 2.3. 1. 16下的乙酰 基-CoA C-酰基转移酶转化丙酰基-CoA。
[0065] 戊-3-烯酰基-CoA可通过以下方法产生：使用归类在EC 5. 3. 3. 8下的异构酶转 化戊_2_烯醜基-CoA。
[0066] 5-羟基戊酰基-CoA可通过以下方法产生：使用归类在EC 2.8.3.14下的 5-轻基戊酸 CoA-转移酶（5-hydroxypentanoate CoA-transferase)转化（i)5_ 轻 基戊酸（5-hydroxypentanoate)或者使用细胞色素P450如CYP153A6的基因产物转 化（ii)戊酰基-CoA。5-羟基戊酸可通过以下方法产生：使用5-羟基戊酸去氢酶 (5-hydroxyvalerate dehydrogenase)如 cpnD 的基因产物或者来自 Clostridium viride 的去氢酶转化5-氧代戊酸（5-oxopentanoate)。5-氧代戊酸可通过以下方法产生：使 用归类在60 2.6.1.48下的5-氨基戊酸转氨酶（5-3111；[110￥316四七6 1：四1183111；[仙86)转 化5-氨基戊酸（5-aminovalerate)。5-氨基戊酸可通过以下方法产生：使用归类在 EC 1.21.4. 1下的D-脯氨酸还原酶转化D-脯氨酸。D-脯氨酸可通过以下方法产生：使 用归类在EC 5. 1.1. 4下的脯氨酸消旋酶转化L-脯氨酸。L-脯氨酸可通过以下方法产 生：使用归类在EC 1.5. 1.2下的吡咯啉-5-羧酸还原酶转化（S)-I-吡咯啉-5-羧酸 ((S) -l-Pyrroline-5-carboxylate)。（S) -1-批咯啉_5_羧酸可通过以下方法产生：L-谷 氨酸5-半醒（L-glutamate 5-semialdehyde)的自发转化。L-谷氨酸5-半醒可通过以下 方法产生：使用归类在EC I. 2. I. 41下的谷氨酸-5-半醛去氢酶转化L-谷氨酰基-5-磷酸(L-glutamyl-5-phosphate)。L-谷氨酰基-5-磷酸可通过以下方法产生：使用归类在EC 2. 7. 2. 11下的谷氨酸5-激酶转化L-谷氨酸。
[0067]戊酰基-CoA可通过以下方法产生：使用归类在EC 1.3. 1.38下的反式-2-烯酰 基-CoA还原酶转化戊-2-烯酰基-CoA。
[0068] 戊烯二酸单酰基-CoA可通过以下方法产生：使用归类在EC 4. 2. 1.-下的脱水酶 转化2-轻基戊二酸单酰基-CoA(2-hydroxyglutaryl-CoA)。2-轻基戊二酸单酰基-CoA 可通过以下方法产生：使用归类在EC 2. 8. 3. 12下的戊烯二酸CoA-转移酶（glutaconate CoA-transferase)转化 2_ 轻基戊二酸（2-hydroxyglutarate)。2_ 轻基戊二酸可通过 以下方法产生：使用归类在EC I. 1. 99. 2下的2-羟基戊二酸去氢酶转化2-氧代戊二酸 (2-oxoglutarate)。3-轻基丁酰基-CoA可通过以下方法产生：使用归类在EC I. I. L 36下 的3-羟基丁酰基-CoA去氢酶转化乙酰乙酰基-CoA。乙酰乙酰基-CoA可通过以下方法产 生：使用归类在EC 2. 3. 1. 9下的乙酰基-CoA C-乙酰基转移酶转化乙酰基-CoA。
[0069] 4-羟基丁酰基-CoA可通过以下方法产生：使用CoA-转移酶如Ck_cat2的基因 产物转化4-轻基丁酸（4-hydroxybutyrate)。4-轻基丁酸可通过以下方法产生：使用归 类在EC I. I. 1. 61下的4-轻基丁酸去氢酶转化琥拍酸半醒（succinate semialdehyde)。 琥珀酸半醛可通过以下方法产生：使用归类在EC 1.2. 1.76下的琥珀酸-半醛去氢酶 (succinate-semialdehyde dehydrogenase)转化玻拍酸单醜基-CoA。
[0070] 2-丁醇可通过以下方法产生：使用归类在EC I. I. 1.B4下的（R)-特异性仲醇 去氢!酶（(R)_specific secondary alcohol dehydrogenase)转化丁丽。丁丽可通过以下 方法产生：使用归类在EC 4.2. 1.28下的丙二醇脱水酶转化2, 3 丁二醇。2, 3 丁二醇可通 过以下方法产生：使用归类在EC 1.1. 1.4下的（R，R)-丁二醇去氢酶转化（R)-3-羟基丁 酮。（R)-3-羟基丁酮可通过以下方法产生：使用归类在EC 4. 1.1. 5下的乙酰乳酸脱羧酶 (acetolactate decarboxylase)转化 2_ 乙醜乳酸（2-acetolactate)。2_ 乙醜乳酸可通 过以下方法产生：使用归类在EC 2. 2. 1. 6下的乙酰乳酸合酶（acetolactate synthase)转 化丙酮酸（口5^11￥3七6)。（1〇3-轻基戊-4-烯酸（(1〇3-117(11'(?5^6111：-4-61103七6)可通过以下 方法产生：使用归类在EC 3. 1. 2.-下的硫酯酶转化3-羟基戊-4-烯酰基-CoA。3-羟基 戊-4-烯酰基-CoA可通过以下方法产生：使用归类在EC 4. 2. 1下的烯酰基-CoA脱水酶2 转化2, 4-戊二烯酰基-CoA。2, 4-戊二烯酰基-CoA可通过以下方法产生：使用2-羟基异 己酰基-CoA脱水酶如起始子HadI和HadBC的基因产物转化2-羟基戊-4-烯酰基-CoA。 2_羟基戊-4-烯酰基-CoA可通过以下方法产生：使用CoA-转移酶如GctAB的基因产物转 化2-轻基戊-4-烯酸（2-hydroxypent-4_enoate)。2-轻基戊-4-烯酸可通过以下方法产 生：使用（R) _2_ 轻基异己酸去氧酶（(R)-2_hydroxyisocaproate dehydrogenase)如来自 艰难梭菌的LdhA的基因产物转化2-氧代戊-4-烯酸（2-〇xopent-4_enoate)。
[0071] (R)-羟基戊-4-烯酸可通过以下方法产生：使用归类在EC 3. 1. 2.-下的硫酯酶 转化（R) 3-羟基戊-4-烯酰基-CoA。（R) 3-羟基戊-4-烯酰基-CoA可通过以下方法产生： 使用归类在EC I. 1. 1.36下的乙酰乙酰基-CoA还原酶转化3-氧代戊-4-烯酰基-CoA。 3_氧代戊-4-烯酰基-CoA可通过以下方法产生：使用归类在EC 2. 3. 1. 16下的酮硫解 酶转化丙烯酰基_CoA。（R)-轻基戊-4-烯酸（(R)-hydroxypent-4_enoate)可通过以下方 法产生：使用归类在EC 3. I. 2.-下的硫酯酶转化（R) 3-羟基戊-4-烯酰基-CoA。（R) 3-羟 基戊-4-烯酰基-CoA可通过以下方法产生：使用（R) -3-羟基酰基-ACP: CoA转酰酶如phaG 的基因产物转化（R)-3-羟基戊-4-烯酰基_[acp]。（R)-3-羟基戊-4-烯酰基_[acp]可通 过以下方法产生：使用归类在EC 4. 2. 1. 59下的3-羟基酰基-[酰基-载体-蛋白]脱水 酶（3-hydroxyacyl-[acyl-carrier-protein] dehydratase)转化 2, 4 戊二烯醜基 _[acp]。 (R) 3-羟基戊-4-烯酰基-CoA可通过以下方法产生：使用归类在EC 4. 2. 1. 119下的烯酰 基-CoA脱水酶2转化2, 4-戊二烯酰基-CoA。
[0072] 2- 丁烯-1-醇二磷酸酯可通过以下方法产生：使用归类在EC 2. 7. 4. 2下的磷酸 甲轻戊酸激酶或者使用归类在EC 2. 7. 6.-下的二磷酸激酶（diphosphokinase)转化2-丁 烯-1-醇磷酸酯（2-buten-l-ol phosphate)。2-丁烯-1-醇磷酸酯可通过以下方法产生： 使用归类在EC 2. 7. 1. 36下的甲羟戊酸激酶转化2-丁烯-1-醇。2-丁烯-1-醇可通过以下 方法产生：使用归类在EC I. 1. 1.54下的丙烯醇去氢酶转化2-丁烯-1-醛。2-丁烯-1-醛 可通过以下方法产生：使用归类在EC 1.2. 1.48下的长链醛去氢酶转化巴豆酸。巴豆酸 可通过以下方法产生：使用归类在EC 6. 2. 1. 5下的琥珀酸-CoA连接酶（succinate-CoA ligase)转化巴豆酰基-CoA。
[0073] 2- 丁烯-1-醇二磷酸酯可通过以下方法产生：使用归类在EC 2. 7. 6.-下的二磷 酸激酶如归类在EC 2. 7. 6. 2下的硫胺素二磷酸激酶转化2- 丁烯-1-醇。
[0074] 3- 丁烯-2-醇二磷酸酯可通过以下方法产生：使用归类在EC 2. 7. 6.-下的二磷 酸激酶转化3- 丁烯-2-醇或者使用归类在EC 2. 7. 4. 2下的磷酸甲羟戊酸激酶转化3- 丁 烯-2-醇磷酸酯。3- 丁烯-2-醇磷酸酯可通过以下方法产生：使用归类在EC 2. 7. 1. 36下 的甲羟戊酸激酶转化3- 丁烯-2-醇。
[0075] 在本申请所述的任何方法中，所述方法可使用分离的酶，使用包含酶的细胞溶胞 产物，或者使用重组宿主进行。可将重组宿主厌氧地、微需氧地或者需氧地培养。在发酵期 间可将重组宿主细胞保留在陶瓷中空纤维膜中以维持高细胞密度。供给至发酵的主要碳源 可来源于生物或者非生物给料。例如，生物给料来源于或者衍生自单糖类、二糖类、木质纤 维素、半纤维素、纤维素、木质素如3-乙酰丙酸和糠醛、木质素、甘油三酯类如甘油和脂肪 酸、农业废物或者城市废物。非生物给料来源于或者衍生自天然气、合成气、C0 2/H2、甲醇、乙 醇、或者来自环己烷氧化工艺的非挥发性残留物（NVR)或碱洗废液流。
[0076] 宿主微生物可为原核生物，其来自埃希氏菌属如大肠杆菌；来自梭状芽 胞杆菌属如杨氏梭菌（Clostridium Ijungdahlii)、自产乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum)或者克鲁佛梭菌（Clostridium kluyveri);来自棒状杆菌属如谷氨酸 棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum);来自贪铜菌属如钩虫贪铜菌（Cupriavidus necator)或者耐金属贪铜菌（Cupriavidus metallidurans);来自假单胞菌属如突 光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida)或 者食油假单胞菌（Pseudomonas oleavorans);来自代尔夫特菌属如食酸代尔夫特菌 (Delftia acidovorans);来自芽抱杆菌属如枯草芽胞杆菌（Bacillus subtillis);来 自乳杆菌属如德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii);或者来自乳球菌属如乳酸乳 球菌（Lactococcus lactis)。宿主微生物可为真核生物，其来自曲霉菌属如黑曲霉菌 (Aspergillus niger);来自酵母菌属如酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae);来自毕 赤酵母属如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris);来自耶罗维亚酵母属如解脂耶罗维亚酵 母（Yarrowia Iipolytica);来自伊萨酵母属如东方伊萨酵母（Issathenkia orientalis); 来自德巴利酵母属如汉逊德巴利酵母G)ebaryomyces hansenii);来自Arxula属如Arxula adenoinivorans;或者来自克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母菌（Kluyveromyces Iactis)。
[0077] 在本申请所述的重组宿主中，可将催化丙酰基-CoA和乙酰基-CoA的水解的酶 弱化；可将经柠檬酸甲酯循环（methyl-citrate cycle)消耗丙酰基-CoA的酶弱化；可将 消耗丙酰基-CoA成丙酮酸的酶弱化；可将消耗丙酰基-CoA成丙二酸单酰基-CoA的酶弱 化；可将抗反馈苏氨酸脱氨酶基因工程化至宿主生物体中；可将催化乙酰基-CoA缩合成 乙酰乙酰基-CoA的P -酮硫解酶如AtoB或者phaA的基因产物弱化；可将在天然累积聚 轻基烧酸酯（polyhydroxyalkanoates)的宿主株中的聚合物合酶弱化；可将编码磷酸转 乙酰酶的基因如Pta弱化；可将编码降解丙酸（propanoate)的乙酸激酶的基因如ack弱 化；可将编码降解丙酮酸成乳酸（lactate)的基因弱化；可将编码降解磷酸烯醇丙酮酸 (phophoenolpyruvate)成琥拍酸（succinate)的基因如frdBC弱化；可将编码降解乙酰 基-CoA成乙醇的基因如adhE弱化；可将催化补充柠檬酸循环中间体的添补反应的酶扩 增；可将批陡核苷酸转氢酶（puridine nucleotide transhydrogenase)基因如UdhA过表 达；甘油醛-3P-去氢酶基因如GapN可在宿主生物体中过表达；苹果酸酶基因如maeA或者 maeB在宿主生物体中过表达；葡萄糖-6-磷酸去氢酶基因如zwf在宿主生物体中过表达； 果糖1，6二磷酸酶基因如fbp在宿主生物体中过表达；通过以基因工程的方式对细胞膜进 行结构修饰，可将丁二烯跨越细胞膜到达细胞外介质的外向通量增强或者扩大；或者通过 以基因工程的方式使用于丁二烯的任何相关的转运子活性增加，将丁二烯跨越细胞膜到达 细胞外介质的外向通量增强或者扩大；将丁二烯降解成毒性中间体如1，2-环氧-3-丁烯和 1，2:3, 4-二环氧丁烷的加氧酶在宿主生物体中被弱化。
[0078] 在本申请所述的任何方法中，硫酯酶可为tesB的基因产物；乙酰乙酰基-CoA还原 酶可为PhaB的基因产物；乙酰基-CoA C-酰基转移酶可为BktB的基因产物；烯酰基-CoA 水合酶可为phaj的基因产物；去饱和酶可为MdpJ的基因产物；细胞色素P450可为CYP4家 族的基因产物邛-酮酰基_[acp]合酶I可为tcsB的基因产物；酰基-转移酶可为tcsA 的基因广物。
[0079] 除非另外定义，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通 技术人员所通常理解的含义相同的含义。尽管与本申请所述的方法和材料相似或者等价的 方法和材料可用于实践本发明，但是下面描述适合的方法和材料。将本申请所述的所有公 开、专利申请、专利，和其它文献的全部内容并入本文作为参考。在冲突的情况中，将以本发 明的说明书（包括定义）为准。另外，材料、方法，和实例仅为说明性的并且不意图限制本 发明。
[0080] 本发明的一个或者多个实施方案的细节在附图和下面的描述中阐述。根据描述和 附图，以及根据权利要求，本发明的其它特征、目的，和优点将显而易见。根据专利法中的标 准实践，在权利要求中的词语"包含"可用"基本上由…组成"或者"由…组成"替代。

【专利附图】

【附图说明】
[0081] 图1是从C4醛和酮、C4羟基-醛和二酮、丁烯、丁烯醛或者不饱和的酮、丁烯醇、 丁二醇、C5烯醇，和活化的丁烯醇得到1，3 丁二烯的主要酶活性的示意图。
[0082]图2是使用2-氧代戊-4-烯酸作为中心前体得到丁二烯的生物化学途径的示意 图。
[0083] 图3是使用丙烯酰基-CoA作为中心前体得到丁二烯的生物化学途径的示意图。
[0084] 图4是使用3-轻基-4-戊烯酸（3-hydroxy-4_pentenoate)作为中心前体得到丁 二烯的生物化学途径的示意图。
[0085] 图5是使用2, 4-戊二烯酰基_[acp]作为中心前体得到丁二烯的生物化学途径的 示意图。
[0086] 图6是使用2, 4-戊二烯酰基-CoA作为中心前体得到丁二烯的生物化学途径的示 意图。
[0087] 图7是使用巴豆酰基-CoA作为中心前体得到丁二烯的生物化学途径的示意图。
[0088] 图8是使用3- 丁烯-2-醇作为中心前体得到丁二烯的生物化学途径的示意图。
[0089] 图9是使用甲羟戊酸二磷酸脱羧酶合成丁二烯的生物化学途径的示意图。
[0090]图10是使用异戊二烯合酶合成丁二烯的生物化学途径的示意图。
[0091]图11是使用脱水酶合成丁二烯的生物化学途径的示意图。
[0092] 图12是MDD接受的备选底物的结构，（a)为3-羟基-5-二磷酸戊酸（ 3_hydroxy-5-diphosphatepentanoic acid)和（b)为 3_ 轻基 _3_ 甲基-丁酸 (3-hydroxy-3-methyl_butyrate) 〇
[0093] 图13是来自酿酒酵母菌的MDD酶的氨基酸序列（Uniprot登录号P32377, SEQ ID NO: 1)、来自表皮葡萄球菌的MDD酶的氨基酸序列（Uniprot登录号Q7CCL9, SEQ ID NO:2)， 和来自肺炎链球菌（streptococcus pneumonia)的MDD酶的氨基酸序列（Uniprot登录号 B8ZLF3，SEQ ID N0:3)，用粗体突出在酶的催化裂隙内的保守残基。

【具体实施方式】
[0094] 具体地，本申请将酶、非天然途径、培养策略、给料、宿主微生物和弱化提供至宿主 的生物化学网络，其在四和五碳链代谢物中产生两个末端乙烯基，从而由中心前体或者中 心代谢物合成1，3 丁二烯（本申请中称为"丁二烯"）。本申请使用的术语〃中心前体〃用 于表示合成丁二烯的途径中的关键代谢物。术语"中心代谢物"在本申请中用于表示在所 有微生物中产生以支持生长的代谢物。
[0095] 因此，本申请所述的宿主微生物可包括可操纵使得可产生丁二烯的内源性途径。 在内源性途径中，宿主微生物天然地表达在途径内催化反应的所有酶。含有工程化途径的 宿主微生物不天然地表达在途径内催化反应的所有酶，而是已经被工程化使得在宿主中表 达在途径内的所有酶。在工程化途径内，酶可来自单一来源，即，来自一个物种，或者可来自 多个来源，即，不同物种。编码本申请所述的酶的核酸已经从多种生物鉴别出并可在公开的 数据库如GenBank或者EMBL中容易地得到。工程化宿主不能天然地表达本申请所述途径 的酶，或者能天然地表达本申请所述途径的酶中的一些（例如，一种或者多种，两种或者更 多种，三种或者更多种，四种或者更多种，五种或者更多种，或者六种或者更多种）。也可将 工程化宿主的内源性基因破坏以防止形成不希望的代谢物，或者防止在途径中作用于中间 体的其它酶导致所述中间体的损失。可将工程化宿主称为重组宿主或者重组宿主细胞。因 此，如本申请所述，重组宿主可包括核酸，该核酸编码脱羧酶、去氢酶、去饱和酶、单氧化酶、 酰基[酰基载体蛋白（acp)]去氢酶、脱水酶，或者水合酶中的一种或者多种，如下面更详细 地描述。
[0096]另外，丁二烯的产生可在体外使用本申请所述的分离的酶，使用宿主微生物的溶 胞产物（例如，细胞溶胞产物）作为酶源，或者使用来自不同宿主微生物的多种溶胞产物作 为酶源进行。
[0097]图1提供可用于从多种四或者五碳分子产生丁二烯的主要酶活性的示意图，所述 四或者五碳分子包括C4醛和酮、C4羟基-醛和二酮、丁烯、丁烯醛或者不饱和的酮、丁烯醇、 丁二醇、C5烯醇，和活化的丁烯醇。
[0098] 4. 1在丁二烯的生物合成中产生第一末端乙烯基的酶
[0099] 如图2-8中所示，第一乙烯基可在4-草酰巴豆酸、2-羟基粘康酸半醛、2-羟 基 _6-氧代-2, 4- _稀-1，9-壬_酸、丙醜基-CoA、乳醜基-CoA、3 -轻基丙醜基-CoA、 (R) 3-羟基-戊酸、戊-2-烯酰基-[acp]、5_羟基戊酰基-CoA(经5-羟基-戊-2-烯酰 基-CoA)、戊-3-烯酰基-CoA、4-羟基丁酰基-CoA、戊烯二酸单酰基-CoA、（R) 3-羟基丁酰 基-CoA或者2- 丁醇中形成，以产生化合物如2-氧代戊-4-烯酸、丙烯酰基-CoA、（R) 3-羟 基戊-4-烯酸、（R) 3-羟基戊-4-烯酰基-[acp]、2, 4-戊二烯酰基-CoA、巴豆酰基-CoA，和 3_ 丁烯-2-醇。
[0100] 在一些实施方案中，导致丁二烯合成的第一乙烯基在4-草酰巴豆酸、2-羟基粘康 酸半醛，或者2-羟基-6-氧代-2, 4-二烯-1，9-壬二酸中通过4-草酰巴豆酸脱羧酶（EC 4. I. 1. 77)、2-羟基粘康酸-半醛水解酶（EC 3. 7. 1. 9)或者2-羟基-6-氧代-2, 4-二烯壬 二酸水解酶（EC 3. 7. 1. 14)酶促形成，从而产生2-氧代戊-4-烯酸。参见例如，图2。
[0101] 在一些实施方案中，导致丁二烯合成的第一乙烯基在丙酰基_CoA、乳酰基-CoA、 3_羟基丙酰基-CoA中通过丁酰基-CoA去氢酶（EC 1.3.8. 1)、中链酰基-CoA去氢酶 (EC 1. 3. 8. 7)、乳酰基-CoA脱水酶（EC 4. 2. 1. 54)或者3-羟基丙酰基-CoA脱水酶（EC 4. 2. 1. 116)酶促形成，从而产生丙烯酰基-CoA。参见例如，图3。
[0102] 在一些实施方案中，导致丁二烯合成的第一乙烯基在（R) 3-羟基-戊酸中通过去 饱和酶或者单氧化酶如MdpJ的基因产物或者细胞色素P450如CYP4家族的基因产物酶促 形成，从而产生（R) 3-羟基戊-4-烯酸。参见例如，图4。
[0103] 单氧化酶MdpJ的基因产物去饱和与仲醇相邻的乙基的末端（ScMfer等人， Applied and Environmental Microbiology, 2012,78(24))〇
[0104] 细胞色素P450 CYP4家族的基因产物已经显示出对于末端去饱和的特异性，而非 对于C5羧酸丙戊酸的to-轻基化的特异性（Rettie等人，Biochemistry, 1995, 34, 7889-7 895)。
[0105] 在一些实施方案中，导致丁二烯合成的第一乙烯基在戊-2-烯酰基-[acp]中通过 酰基_[acp]去氢酶如TcsD的基因产物酶促形成，从而产生2, 4戊二烯酰基-[acp]。参见 例如，图5。
[0106] 酰基_[acp]去氢酶TcsD的基因产物去饱和戊-2-烯酰基-[acp]的末端亚甲基 成2, 4-戊二烯酰基-[acp] (Mo等人，J.Am.Chem. Soc.，2011，133(4)，976-985)。
[0107] 在一些实施方案中，导致丁二烯合成的第一乙烯基在5-羟基戊酰基-CoA中经 5-羟基-戊-2-烯酰基-CoA通过5-羟基戊酰基-CoA脱水酶（EC 4. 2. I.-)或者通过 2, 4-二烯酰基辅酶A还原酶（EC 1. 3. 1. 34)酶促形成，从而产生2, 4-戊二烯酰基-CoA。参 见例如，图6。
[0108] 5-羟基戊酸通过5-羟基戊酰基-CoA脱水酶脱水成2, 4戊二烯酰 基-CoA 已经从 Clostridium viride 中得到表征（Eikmanns 和 Buckel, Eur. J. Biochem.，1991，197, 661 - 668)。
[0109] 在一些实施方案中，导致丁二烯合成的第一乙烯基在3-羟基丁酰基-CoA、4-羟基 丁酰基-CoA或者戊烯二酸单酰基-CoA中通过烯酰基-CoA水合酶（EC 4. 2. 1. 119)如phaj 的基因产物、4-羟基丁酰基-CoA脱水酶（EC 4. 2. 1. 120)或者戊烯二酸单酰基-CoA脱羧酶 (EC 4. I. 1. 70)酶促形成，从而产生巴豆酰基-CoA。参见例如，图7。
[0110] 可逆脱水酶4-羟基丁酰基-CoA脱水酶已经在数个梭菌属物种如克 鲁佛梭菌中得到表征，从而提供经中心代谢物琥珀酸到达巴豆酰基-CoA的路 线（Scherf 等人，Arch. Microbiol, 1994，161 (3) ,239-245 ;Sherf 和 Buckel, Eur. J.Biochem.，1993, 215, 421-429)。
[0111] 生物素依赖性脱羧酶戊烯二酸单酰基-CoA脱羧酶在脱羧后维持底物的乙烯基的 位置，从而提供经中心代谢物2-氧代戊二酸到达巴豆酰基-CoA的路线（Kerstin等人，The EMBO Journal, 2003, 22(14)，3493-3502)。
[0112] 在一些实施方案中，导致丁二烯合成的第一乙烯基在2- 丁醇中通过去饱和酶或 者单氧化酶如MdpJ的基因产物或者细胞色素P450如CYP4家族的基因产物形成，从而产生 3- 丁烯-2-醇。参见例如，图8。
[0113] 4. 2在丁二烯的生物合成中产生第二末端乙烯基的酶
[0114] 如图9-11中所示，第二乙烯基可使用甲羟戊酸二磷酸脱羧酶（MDD)、异戊二烯合 酶（ISPS)，或者脱水酶酶促形成。
[0115] 在一些实施方案中，导致丁二烯合成的第二乙烯基通过甲羟戊酸二磷酸脱羧酶 (MDD)，一种归类在EC 4. I. 1. 33下的酶形成。参见例如，图9。
[0116] 在一些实施方案中，导致丁二烯合成的第二乙烯基通过异戊二烯合酶（ISPS)，一 种归类在4. 2. 3. 27下的酶酶促形成。参见例如，图10。
[0117] 在一些实施方案中，导致丁二烯合成的第二乙烯基通过酶种类EC 4. 2.L-中的 脱水酶，具体为芳樟醇脱水酶（EC 4. 2. 1. 127)、奇维酮水合酶（EC 4. 2. 1. 95)、油酸水合酶 (EC 4. 2. 1. 53)或者类胡萝卜素1，2-水合酶（EC 4. 2. 1. 131)酶促形成。参见例如，图11。
[0118] 可将芳樟醇视为在a位置取代有异己烯基R基团的3-丁烯-2-醇。芳樟醇脱水 成香叶烯在热力学上是有利的并且很可能经去质子化进行，其中R基团在机理上不具有作 用（Bordkorb 等人，J. Biol. Chem.，2010, 285 (40)，30436-30442)。
[0119] 油酸水合酶将长链不饱和的脂肪酸油酸转化成（R)-IO-羟基硬脂酸 ((R)-lO-hydroxystearate)。然而，在筛查E.meningoseptica的油酸水合酶序列的 165 个同系物中，数个同系物接受异丁醇作为底物形成异丁烯（Bianca等人，Appl. Microbiol Biotechnol.，2012, 93, 1377-1387)。
[0120] 4.3生物化学途径
[0121] 4. 3. 1使用2-氧代戊-4-烯酸作为丁二烯的中心前体的途径
[0122] 充分表征了从诸如以下的芳族化合物产生2-氧代戊-4-烯酸的途径：原儿茶酸 (Kasai 等人，J. Bacteriol.，2009, 191 (21)，6758 - 6768)、儿茶酚（He 和 Spain, J. Bacterio 1. , 1998, 180(9), 2502 - 2506)、邻氨基苯甲酸（Muraki 等人，Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69 (3)，1564 - 1572)和 3-苯基丙酸（Ferrandez 等人，J. Bacteriol.， 1997, 179 (8)，2573 - 2581)。经 3_ 去氧莽草酸（3-dehydroshikimate)通过 3_ 去氧莽草酸 脱水酶（EC 4. 2. 1. 118)，经分支酸通过邻氨基苯甲酸合酶（EC 4. 1. 3. 27)，和经L-苯基丙 氨酸通过苯基丙氨酸脱氨酶（EC 4. 3. 1. 24)和2-烯酸还原酶（EC 1. 3. 1. 31)，可将碳通量 从中心代谢物引导至这些降解途径。
[0123] 在一些实施方案中，2-氧代戊-4-烯酸通过以下方法合成：通过邻氨基苯甲 酸合酶（EC 4. 1.3.27)将中心代谢物分支酸转化成邻氨基苯甲酸；然后通过邻氨基苯 甲酸1，2-双加氧酶（EC 1.14. 12. 1)转化成儿茶酚；然后通过儿茶酚2, 3-双加氧酶 (EC 1. 13. 11. 2)转化成2-羟基粘康酸半醛；然后通过2-羟基粘康酸-半醛水解酶（EC 3. 7. 1. 9)转化成2-氧代戊-4-烯酸。另外，可将2-羟基粘康酸半醛通过氨基粘康酸半醛 去氢酶（EC 1. 2. 1. 32)转化成2-羟基粘康酸，可将2-羟基粘康酸通过2-羟基粘康酸互变 异构酶（EC 5. 3. 2. 6)转化成4-草酰巴豆酸，并且可将4-草酰巴豆酸通过4-草酰巴豆酸 脱羧酶（EC 4. I. 1. 77)转化成2-氧代戊-4-烯酸。参见例如，图2。
[0124] 在一些实施方案中，2-氧代戊-4-烯酸通过以下方法合成：将中心代谢物3-去氢 莽草酸通过3-去氢莽草酸脱水酶（EC 4. 2. 1. 118)转化成原儿茶酸；然后通过原儿茶酸脱 羧酶（EC 4. I. 1. 63)转化成儿茶酚；然后通过儿茶酚2, 3-双加氧酶（EC 1. 13. 11. 2)转化 成2-羟基粘康酸半醛；然后通过2-羟基粘康酸-半醛水解酶（EC 3. 7. 1. 9)或者通过氨基 粘康酸半醛去氢酶（EC 1. 2. 1. 32)、2_羟基粘康酸互变异构酶（EC 5. 3. 2. 6)和4-草酰巴 豆酸脱羧酶（EC 4. I. 1. 77)转化成2-氧代戊-4-烯酸。参见例如，图2。
[0125] 在一些实施方案中，2-氧代戊-4-烯酸通过以下方法合成：将中心代谢物3-去 氢莽草酸通过3-去氢莽草酸脱水酶（EC 4. 2. 1. 118)转化成原儿茶酸；然后通过原儿茶 酸2, 3-双加氧酶如praA的基因产物转化成5-羧基-2-轻基粘康酸-6-半醒；然后通 过5-羧基-2-轻基粘康酸-6-半醒脱羧酶如praH的基因产物转化成2-轻基粘康酸半 醛；然后通过2-羟基粘康酸-半醛水解酶（EC 3. 7. 1. 9)或者通过氨基粘康酸半醛去氢 酶（EC 1. 2. 1. 32)、2-羟基粘康酸互变异构酶（EC 5. 3. 2. 6)和4-草酰巴豆酸脱羧酶（EC 4. I. 1. 77)转化成2-氧代戊-4-烯酸。参见例如，图2。
[0126] 在一些实施方案中，2-氧代戊-4-烯酸通过以下方法合成：将中心代谢物 L-苯基丙氨酸通过苯基丙氨酸脱氨酶（EC 4.3.1.24)转化成E-肉桂酸；然后通过 2-烯酸还原酶（EC 1.3. 1.31)转化成3-苯基-丙酸；然后通过3-苯基丙酸双加氧 酶（3-phenylpropanoate dioxygenase) (EC L 14. 12. 19)转化成顺式 _3_(羧基-乙 基）-3, 5-环-己二烯-1，2-二醇；然后通过3-(顺式-5, 6-二轻基环己-1，3-二烯-1-基） 丙酸去氢酶（EC L 3. L 87)转化成 2, 3-二轻基苯基丙酸（2, 3-dihydroxyphenylpropiono ate);然后通过3-羧基乙基儿茶酚2, 3-双加氧酶（EC 1. 13. 11. 16)转化成2-羟基-6-氧 代-2, 4-二烯-1，9-壬二酸；然后通过2-羟基-6-氧代-2, 4-二烯壬二酸水解酶（EC 3. 7. 1. 14)转化成2-氧代戊-4-烯酸。参见例如，图2。
[0127] 在一些实施方案中，丁二烯通过以下方法合成：将2-氧代戊-4-烯酸通过 (R) -2-羟基异己酸去氢酶如LdhA的基因产物转化成2-羟基戊-4-烯酸；然后通过CoA 转移酶如GctAB的基因产物转化成2-羟基戊-4-烯酰基-CoA ;然后通过2-羟基异己酰 基-CoA脱水酶如起始子HadI和HadBC的基因产物转化成2, 4-戊二烯酰基-CoA ;然后通 过烯酰基-CoA脱水酶2 (EC 4. I. I. 119)转化成（R) -3-羟基戊-4-烯酰基-CoA ;然后通过 硫酯酶（EC 3. 1. 2.-)如tesB的基因产物转化成（R)-3-羟基戊-4-烯酸；然后通过甲羟戊 酸二磷酸脱羧酶（EC 4. I. 1. 33)转化成丁二烯。参见例如，图9。
[0128] (R)-2-羟基异己酸去氢酶（LdhA的基因产物）接受2-氧代戊酸 (2-oxopentanoate)和 2_ 氧代己酸（2-oxohexanoate)作为底物（Kim, On the enzymatic mechanism of 2-hydroxyisocaproyI-CoA dehydratase from Clostridium difficile，2004, Ph. D. dissertation，Philipps-Universiliit，Marburg，2004)。2_氧代戊酸 是2-氧代戊-4-烯酸的接近的底物类似物。
[0129] 戊烯二酸CoA-转移酶（GctAB)是杂乱酶，其接受长度为3-6个碳的碳链，所述碳 链为支化的和非支化的，a -取代的和未取代的单羧酸和二羧酸（参见例如，Buckel等人， Eur. J. Biochem.，1981，118, 315 - 321)。2-羟基戊-4-烯酸具有可比较的结构和官能团，其 中CoA活化是2-羟基异己酰基-CoA脱水酶的活性所需要的。
[0130] 2-羟基异己酰基-CoA脱水酶（HadI和HadBC)接受底物类似物2-羟基 戊-4-烯酰基-CoA作为底物，从而合成2, 4-戊二烯酰基-CoA (Kim等人，Nature Letters,2008, 452, 239 - 243)。
[0131] 短和中碳链酰基-CoA底物的水解已经使用tesB的基因产物证实（Liu 等人，Appl. Microbiol. Biotechnol. ,2007, 76, 811-818)。tesB 的硫酯酶 II 基 因产物有效水解（R) _3_轻基戊酰基-CoA (Martin和Prather, Journal of Biotechnology, 2009, 139, 61-67)。
[0132] 4. 3. 2合成作为通向丁二烯的中心前体的前体的丙酰基-CoA的途径
[0133] 在一些实施方案中，丙酰基-辅酶A (CoA)是在合成丁二烯中通向中心前体的前体 (参见例如，图3)。
[0134] 在一些实施方案中，丙酰基-CoA通过以下方法合成：将中心代谢物琥珀酸单酰 基-CoA通过甲基丙二酸单酰基-CoA变位酶（EC 5. 4. 99. 2)转化成（2R)-甲基丙二酸单酰 基-CoA;然后通过甲基丙二酸单酰基-CoA差向异构酶（EC 5. 1.99. 1)转化成（2S)-甲基 丙二酸单酰基-CoA ;然后通过甲基丙二酸单酰基-CoA羧基转移酶（EC 2. 1. 3. 1)或者甲基 丙二酸单酰基-CoA脱羧酶（EC 4. I. 1. 41)转化成丙酰基-CoA。参见例如，图3。
[0135] 在一些实施方案中，丙酰基-CoA通过以下方法合成：将中心代谢物L-苏氨酸通 过苏氨酸脱氨酶（EC 4. 3. 1. 19)转化成2-氧代丁酸（2-oxobutyrate);然后通过2-酮丁 酸甲酸裂解酶如tdcE的基因产物（EC 2.3. 1.-)转化成丙酰基-CoA (参见Tseng等人， Microbial Cell Factories, 2010, 9:96)。参见例如，图 3。
[0136] 作为其它产物的前体，来自L-苏氨酸的丙酰基-CoA在细胞内累积已经被证实 (Tseng 等人，Microbial Cell Factories, 2010, 9:96)。
[0137] 在一些实施方案中，丙酰基-CoA通过以下方法合成：将1，2-丙二醇通过丙二醇脱 水酶（EC 4. 2. 1. 28)转化成丙醛；然后通过CoA依赖性丙醛去氢酶如pduP的基因产物转化 成丙醜基-CoA(参见 Luo 等人，Bioresource Technology, 2012, 103, 1-6)。参见例如，图 3。
[0138] 来自1，2-丙二醇的丙酰基-CoA在细胞内累积已经被报导（Luo等人，Bioresource Technology, 2012, 103, 1-6)。
[0139] 在一些实施方案中，丙酰基-CoA通过以下方法合成：将碳源3-乙酰丙酸 (levulinic acid)通过酰基-CoA合成酶或者连接酶（EC 6. 2. 1.-)转化成3-乙酰丙酰 基-CoA ;然后通过EC 2. 3. 1.-中的转移酶转化成丙酰基-CoA (Jaremko和Yu, Journal of Biotechnology, 2011，155, 2011，293 - 298)。参见例如，图 3。
[0140] 在一些实施方案中，丙酰基-CoA通过以下方法合成：将中心代谢物丙酮酸通过 L-乳酸去氢酶（EC I. I. 1. 27)转化成L-乳酸（L-Iactate);然后通过丙酸CoA-转移酶 (proprionate CoA-transferase) (EC 2. 8. 3. 1)转化成乳醜基-CoA ;然后通过乳醜基-CoA 脱水酶（EC 4. 2. 1. 54)转化成丙烯酰基-CoA;然后通过丁酰基-CoA去氢酶（EC 1. 3. 8. 1) 或者中链酰基-CoA去氢酶（EC 1. 3. 8. 7)转化成丙酰基-CoA。参见例如，图3。
[0141] 在一些实施方案中，丙酰基-CoA通过以下方法合成：将中心代谢物丙二酸单酰 基-CoA通过丙二酸单酰基-CoA还原酶（EC 1. 2. 1. 75)转化成丙二酸半醛；然后通过3-羟 基丙酸去氢酶（EC I. I. 1. 59)转化成3-羟基丙酸；然后通过3-羟基异丁酰基-CoA水解 酶（EC 3. 1. 2. 4)转化成3-羟基丙酰基-CoA;然后通过3-羟基丙酰基-CoA脱水酶（EC 4. 2. 1. 116)转化成丙烯酰基-CoA ;然后通过丁酰基-CoA去氢酶（EC 1. 3. 8. 1)或者中链酰 基-CoA去氢酶（EC 1. 3. 8. 7)转化成丙酰基-CoA。参见例如，图3。
[0142] 4. 3. 3使用丙烯酰基-CoA作为丁二烯的中心前体的途径
[0143] 在一些实施方案中，丙烯酰基-CoA从丙酰基-CoA通过丁酰基-CoA去氢酶（EC 1. 3. 8. 1)或者中链酰基-CoA去氢酶（EC 1. 3. 8. 7)合成。参见例如，图3。
[0144] 在一些实施方案中，丙烯酰基-CoA通过以下方法合成：将中心代谢物丙酮酸通过 L-乳酸去氢酶（EC I. I. 1. 27)转化成L-乳酸；然后通过丙酸CoA-转移酶（EC 2. 8. 3. 1)转 化成乳酰基-CoA;然后通过乳酰基-CoA脱水酶（EC 4. 2. 1. 54)转化成丙烯酰基-CoA。参 见例如，图3。
[0145] 在一些实施方案中，丙烯酰基-CoA通过以下方法合成：将中心代谢物丙二酸单酰 基-CoA通过丙二酸单酰基-CoA还原酶（EC 1. 2. 1. 75)转化成丙二酸半醛；然后通过3-羟 基丙酸去氢酶（EC I. I. 1. 59)转化成3-羟基丙酸；然后通过3-羟基异丁酰基-CoA水解 酶（EC 3. 1. 2. 4)转化成3-羟基丙酰基-CoA;然后通过3-羟基丙酰基-CoA脱水酶（EC 4. 2. 1. 116)转化成丙烯酰基-CoA。参见例如，图3。
[0146] 在一些实施方案中，丁二烯通过以下方法合成：将丙烯酰基-CoA通过酮硫解 酶如EC 2. 3. 1. 16转化成3-氧代戊_4_烯醜基-CoA;然后通过乙醜乙醜基-CoA还原酶 (EC I. I. 1. 36)如phaB的基因产物转化成（R)-3-羟基戊-4-烯酰基-CoA;然后通过硫酯 酶（EC. 3. 1. 2.-)如tesB的基因产物转化成（R)-3-羟基戊-4-烯酸；然后通过甲羟戊酸二 磷酸脱羧酶（EC 4. I. 1. 33)转化成丁二烯。参见例如，图9。
[0147] 4. 3. 4使用（R) 3-羟基戊-4-烯酸作为丁二烯的中心前体的途径
[0148] 在一些实施方案中，（R)3_羟基戊-4-烯酸通过以下方法合成：将丙酰基-CoA通 过乙酰基-CoA C-酰基转移酶（EC 2. 3. 1. 16)转化成3-氧代戊酰基-CoA;然后通过乙酰 乙酰基-CoA还原酶（EC I. I. 1. 36)如phaB的基因产物转化成（R) 3-羟基戊酰基-CoA; 然后通过硫酯酶如tesB的基因产物（EC 3. 1. 2.-)转化成（R) 3-羟基戊-4-烯酰基-CoA ; 然后通过去饱和酶如MdpJ的基因产物或者细胞色素P450如CYP4家族的基因产物转化成 (R) 3-羟基戊-4-烯酸。参见例如，图4。
[0149] 羧酸通过CYP4家族中的细胞色素P450酶的末端去饱和已有阐述。通过除去末端 的氢，CYP4B1将十二碳链长度的脂肪酸月桂酸去饱和（Guan等人，Chemico-Biology Interactions, 1998, 110, 103 - 121)。
[0150] 在一些实施方案中，丁二烯从（R) 3-羟基戊-4-烯酸通过甲羟戊酸二磷酸脱羧酶 (EC 4. I. 1. 33)合成。参见例如，图9。
[0151] 4. 3. 5使用2, 4-戊二烯酰基_[acp]作为丁二烯的中心前体的途径
[0152] 在一些实施方案中，（R)3_羟基戊-4-烯酰基_[acp]通过以下方法合成：将丙酰 基-CoA通过乙酰基-CoA C-酰基转移酶（EC 2. 3. 1. 16)转化成3-氧代戊酰基-CoA ;然后 通过3-羟基酰基-CoA去氢酶（EC I. I. 1. 36)如phaB的基因产物转化成（R) 3-羟基戊酰 基-CoA;然后通过烯酰基-CoA水合酶（EC 4. 2. 1. 119)如phaj的基因产物转化成戊-2-烯 酰基-CoA;然后在与酰基转移酶如tcsA的基因产物的反应中转化成戊-2-烯酰基_[acp]; 然后通过酰基_[acp]去氢酶如TcsD的基因产物转化成（R) 2, 4-戊二烯酰基_[acp]。参见 例如，图5。
[0153] 在一些实施方案中，（R)3_羟基戊-4-烯酰基_[acp]通过以下方法合成：将丙 酰基-CoA通过P -酮酰基-[acp]合酶I (EC 2. 3. 1. 41)如tcsB和酰基-转移酶如tcsA 转化成3-氧代戊酰基_[acp];然后通过3-氧代酰基-[酰基-载体-蛋白]还原酶（EC 1.1. 1.100)转化成（R)3-羟基戊酰基-CoA;然后通过3-羟基酰基_[acp]脱水酶（EC 4. 2. 1. 59)转化成戊-2-烯酰基-[acp];然后通过酰基_[acp]去氢酶如TcsD的基因产物 转化成2, 4-戊二烯酰基-[acp]。参见例如，图5。
[0154] 在一些实施方案中，丁二烯通过以下方法合成：将（R)-3_羟基戊-4-烯酰 基- [acp]通过（R)-3-轻基酰基- [acp] : CoA转酰酶如phaG的基因产物转化成（R)-3-轻 基戊-4-烯酰基-CoA;然后通过硫酯酶如tesB的基因产物转化成（R)-3-羟基戊-4-烯酸； 然后通过甲羟戊酸二磷酸脱羧酶（EC 4. I. 1. 33)转化成丁二烯。参见例如，图9。
[0155] phaj的基因产物（EC 4.2. 1. 119)是关键酶，用于将来自脂肪酸合成的短和中 链R-特异性3-轻基酰基-CoA单体提供至聚轻基烧酸酯合酶（Chung和Rhee, Biosci. Biotechnol.Biochem. , 2012, 76(3), 613-616 ；Tsuge 等人，International Journal of Biological Macromolecules, 2003, 31，195-205)。
[0156] 使用4-戊烯酸作为产生聚羟基烷酸酯的细菌的碳源，经氧化产生（R)-3-羟 基戊-4-烯酸。因此，将4-戊烯酸转化成2, 4-戊二烯酰基-CoA，其在通过R-特异性烯酰 基-CoA脱水酶活性水合成（R)-3-羟基戊-4-烯酸之后可用于聚合物合酶（Ulmer等人，M acromolecules，1994, 27, 1675-1679)。
[0157] 4. 3. 6使用2, 4戊二烯酰基-CoA作为丁二烯的中心前体的途径
[0158] 在一些实施方案中，2, 4-戊二烯酰基-CoA通过以下方法合成：将丙酰基-CoA通 过乙酰基-CoA C-酰基转移酶（EC 2. 3. 1. 16)如bktB的基因产物转化成3-氧代-戊酰 基-CoA;然后通过3-羟基酰基-CoA去氢酶（EC I. I. 1. 36)如phaB的基因产物转化成 (R) 3-羟基戊酰基-CoA;然后通过烯酰基-CoA水合酶（EC 4. 2. I. 119)如phaj的基因产物 转化成戊-2-烯酰基-CoA ;然后通过异构酶（EC 5. 3. 3. 8)转化成戊-3-烯酰基-CoA ;然后 通过2, 4-二烯酰基辅酶A还原酶（EC I. 3. I. 34)转化成2, 4,-戊二烯酰基-CoA。参见例 如，图6。
[0159] 在一些实施方案中，2, 4-戊二烯酰基-CoA通过以下方法合成：将丙酰基-CoA通 过乙酰基-CoA C-酰基转移酶（EC 2. 3. 1. 16)如bktB的基因产物转化成3-氧代-戊酰 基-CoA ;然后通过3-羟基酰基-CoA去氢酶（EC I. I. 1. 36)如phaB的基因产物转化成 (R) 3-羟基戊酰基-CoA ;然后通过烯酰基-CoA水合酶（EC 4. 2. I. 119)如phaj的基因产物 转化成戊-2-烯酰基-CoA ;然后通过异构酶（EC 5. 3. 3. 8)转化成戊-3-烯酰基-CoA ;然后 通过2, 4-二烯酰基辅酶A还原酶（EC 1. 3. 1. 34)转化成2, 4-戊二烯酰基-CoA。参见例 如，图6。
[0160] 在一些实施方案中，2, 4-戊二烯酰基-CoA通过以下方法合成：将丙酰基-CoA通 过乙酰基-CoA C-酰基转移酶（EC 2. 3. 1. 16)如bktB的基因产物转化成3-氧代-戊酰 基-CoA ;然后通过3-羟基酰基-CoA去氢酶（EC I. I. 1. 36)如phaB的基因产物转化成 (R) 3-羟基戊酰基-CoA;然后通过烯酰基-CoA水合酶（EC 4. 2. I. 119)如phaj的基因产物 转化成2E-戊烯酰基-CoA ;然后通过反式-2-烯酰基-CoA还原酶如EC 1. 3. 1. 38转化成 戊酰基-CoA;然后通过细胞色素P450单氧化酶如CYP153A6的基因产物转化成5-羟基戊 酰基-CoA ;然后通过5-羟基戊酰基-CoA脱水酶（EC 4. 2. 1.-)(例如，来自Clostridium viride)转化成2, 4,-戊二烯酰基-CoA。参见例如，图6。
[0161] 在一些实施方案中，2, 4-戊二烯酰基-CoA通过以下方法合成：将中心代谢物 L-谷氨酸通过谷氨酸5-激酶（EC 2.7.2. 11)转化成L-谷氨酰基-5-磷酸；然后通过谷氨 酸-5-半醛去氢酶（EC 1. 2. 1. 41)转化成L-谷氨酸-5-半醛；然后自发转化成（S) -1-吡 咯啉-5-羧酸；然后通过吡咯啉-5-羧酸还原酶（EC 1. 5. 1. 2)转化成L-脯氨酸；然后通过 脯氨酸消旋酶（EC 5. I. 1. 4)转化成D-脯氨酸；然后通过D-脯氨酸还原酶（EC 1. 21. 4. 1) 转化成5-氨基戊酸；然后通过5-氨基戊酸转氨酶（EC 2. 6. 1. 48)转化成5-氧代戊酸；然 后通过5-轻基戊酸去氢酶如cpnD的基因产物或者来自Clostridium viride的去氢酶转 化成5-羟基戊酸；然后通过5-羟基戊酸CoA-转移酶（EC 2. 8. 3. 14)转化成5-羟基戊 酰基-CoA ;然后通过5-羟基戊酰基-CoA脱水酶（EC 4. 2. 1.-)(例如，来自Clostridium viride)转化成2, 4-戊二烯酰基-CoA。参见例如，图6。
[0162] 在一些实施方案中，丁二烯通过以下方法合成：将2, 4-戊二烯酰基-CoA通过烯 酰基-CoA脱水酶2(EC 4. 2. 1. 119)如phaj的基因产物转化成（R)-3-羟基戊-4-烯酰 基-CoA;然后通过硫酯酶如tesB的基因产物转化成（R)-3-羟基戊-4-烯酸；然后通过甲 羟戊酸二磷酸脱羧酶（EC 4. I. 1. 33)转化成丁二烯。参见例如，图9。
[0163] phaj的基因产物（EC 4.2. 1. 119)是关键酶，用于将来自脂肪酸合成的短和中 链R-特异性3-轻基酰基-CoA单体提供至聚轻基烧酸酯合酶（Chung和Rhee, Biosci. Biotechnol. Biochem.，2012,76(3)，613 - 616 ;Tsuge 等人，International Journal of Biological Macromolecules, 2003, 31，195-205)。
[0164] 使用4-戊烯酸作为产生聚羟基烷酸酯的细菌的碳源，经氧化产生（R)-3-羟 基戊-4-烯酸。因此，将4-戊烯酸转化成2, 4-戊二烯酰基-CoA，其在通过R-特异性烯 酰基-CoA脱水酶活性水合成（R)-3-羟基戊-4-烯酸之后可用于聚合物合酶（参见例如， Ulmer等人，Macromolecules,1994, 27, 1675 - 1679)。
[0165] 4. 3. 7使用巴豆酰基-CoA作为丁二烯的中心前体的途径
[0166] 在一些实施方案中，巴豆酰基-CoA通过以下方法合成：将中心代谢物乙酰基-CoA 通过乙酰基-CoA C-乙酰基转移酶（EC 2. 3. 1. 9)如atoB或者phaA的基因产物转化成乙 酰乙酰基-CoA ;然后通过3-羟基丁酰基-CoA去氢酶（EC I. I. 1. 36)如phaB的基因产物 转化成（R) 3-羟基丁酰基-CoA ;然后通过烯酰基-CoA水合酶（EC 4. 2. 1. 119)如phaj的 基因产物转化成巴豆酰基-CoA。参见例如，图7。
[0167] 在一些实施方案中，巴豆酰基-CoA通过以下方法合成：将中心代谢物琥珀酸单酰 基-CoA通过琥珀酸-半醛去氢酶（EC 1. 2. 1. 76)转化成琥珀酸半醛；然后通过4-羟基丁 酸去氢酶（EC I. I. 1. 61)转化成4-羟基丁酸；然后通过CoA-转移酶如Ck-cat2的基因产 物转化成4-羟基丁酰基-CoA ;然后通过4-羟基丁酰基-CoA脱水酶（EC 4. 2. 1. 120)和乙 烯基乙酰基-CoA异构酶（EC 5. 3. 3. 3)转化成巴豆酰基-CoA。参见例如，图7。
[0168] 在一些实施方案中，巴豆酰基-CoA通过以下方法合成：将中心代谢物2-氧 代-戊二酸通过2-羟基戊二酸去氢酶（EC I. 1. 99. 2)转化成2-羟基戊二酸；然后通过 戊烯二酸CoA-转移酶（EC 2. 8. 3. 12)转化成2-羟基戊二酸单酰基-CoA ;然后通过脱水 酶（EC 4. 2. 1.-)转化成戊烯二酸单酰基-CoA ;然后通过戊烯二酸单酰基-CoA脱羧酶（EC 4. I. 1. 70)转化成巴豆酰基-CoA。参见例如，图7。
[0169] 在一些实施方案中，丁二烯通过以下方法合成：将巴豆酰基-CoA通过琥珀酸-CoA 连接酶（EC 6. 2. 1. 5)转化成巴豆酸；然后通过长链醛去氢酶（EC 1. 2. 1. 48)转化成2- 丁 烯-醛；然后通过丙烯醇去氢酶（EC 1.1. 1.54)转化成2-丁烯-1-醇；然后通过甲羟戊 酸激酶（EC 2.7. 1.36)转化成2-丁烯-1-醇磷酸酯；然后通过磷酸甲羟戊酸激酶（EC 2. 7. 4. 2)转化成2- 丁烯-1-醇二磷酸酯；然后通过异戊二烯合酶（EC 4. 2. 3. 27)转化成 丁二烯。参见例如，图10。
[0170] 在一些实施方案中，丁二烯通过以下方法合成：将巴豆酰基-CoA通过琥珀酸-CoA 连接酶（EC 6. 2. 1. 5)转化成巴豆酸；然后通过长链醛去氢酶（EC 1. 2. 1. 48)转化成2- 丁 烯-醛；然后通过丙烯醇去氢酶（EC I. I. 1. 54)转化成2- 丁烯-1-醇；然后通过二磷酸转 移酶如硫胺素二磷酸激酶（EC 2. 7. 6. 2)转化成2- 丁烯-1-醇二磷酸酯；然后通过异戊二 烯合酶（EC 4. 2. 3. 27)转化成丁二烯。参见例如，图10。
[0171] 在一些实施方案中，丁二烯通过以下方法合成：将巴豆酰基-CoA通过琥珀酸-CoA 连接酶（EC 6. 2. 1. 5)转化成巴豆酸；然后通过长链醛去氢酶（EC 1. 2. 1. 48)转化成2- 丁 烯-醛；然后通过丙烯醇去氢酶（EC I. I. 1. 54)转化成2- 丁烯-1-醇；然后通过酶种类EC 4. 2. 1.-中的脱水酶如芳樟醇脱水酶（EC 4. 2. 1. 127)、奇维酮水合酶（EC 4. 2. 1. 95)、油酸 水合酶（EC 4. 2. 1. 53)或者类胡萝卜素1，2-水合酶（EC 4. 2. 1. 131)转化成丁二烯。参见 例如，图11。
[0172] 4. 3. 8使用3- 丁烯-2-醇作为丁二烯的中心前体的途径
[0173] 在一些实施方案中，3-丁烯-2-醇通过以下方法合成：将中心代谢物丙酮酸通过 乙酰乳酸合酶（EC 2. 2. 1. 6)转化成2-乙酰乳酸；然后通过乙酰乳酸脱羧酶（EC 4. I. 1. 5) 转化成（R)-3-羟基丁酮；然后通过（R，R) _ 丁二醇去氢酶（EC I. I. 1. 4)转化成2, 3 丁二 醇；然后通过丙二醇脱水酶（EC 4. 2. 1. 28)转化成丁酮；然后通过（R)-特异性仲醇去氢酶 (EC I. I. I. B4)转化成2- 丁醇；然后通过去饱和酶或者单氧化酶如MdpJ的基因产物或者 细胞色素P450(例如，在CYP4家族中）转化成3- 丁烯-2-醇。参见例如，图8。
[0174] 在一些实施方案中，丁二烯通过以下方法合成：将3- 丁烯-2-醇通过甲羟戊酸激 酶（EC 2. 7. 1. 36)转化成3-丁烯-2-醇磷酸酯；然后通过磷酸甲羟戊酸激酶（EC 2. 7. 4. 2) 转化成3- 丁烯-2-醇二磷酸酯；然后通过异戊二烯合酶（EC 4. 2. 3. 27)转化成丁二烯。参 见例如，图10。
[0175] 在一些实施方案中，丁二烯通过以下方法合成：将3-丁烯-2-醇通过二磷酸转移 酶如硫胺素二磷酸激酶（EC 2. 7. 6. 2)转化成3- 丁烯-2-醇二磷酸酯；然后通过异戊二烯 合酶（EC 4. 2. 3. 27)转化成丁二烯。参见例如，图10。
[0176] 在一些实施方案中，丁二烯从3-丁烯-2-醇通过酶种类EC 4. 2. L-中的脱 水酶如芳樟醇脱水酶（EC 4. 2. 1.127)、奇维酮水合酶（EC 4. 2. 1.95)、油酸水合酶（EC 4. 2. 1.53)或者类胡萝卜素1，2-水合酶（EC 4. 2. 1. 131)合成。参见例如，图11。
[0177] 4. 4培养策略
[0178] 在一些实施方案中，丁二烯在重组宿主中使用发酵策略生物合成，所述发酵策略 可包括厌氧地、微需氧地或者需氧地培养重组宿主。
[0179] 在合成丁二烯中，包括需要分子氧的酶和在体外表征为氧敏感性的酶的途径需要 微需氧培养策略，从而维持低溶解氧浓度，同时维持足够的氧转移以防止底物氧化控制的 条件（Chayabatra 和 Lu-Kwang, Appl. Environ. Microbiol. ,2000, 66 (2) ,493 0 498)。
[0180] 在一些实施方案中，细胞保留策略（使用例如陶瓷中空纤维膜）用于在合成丁二 烯中的分批供料或者连续发酵期间实现和维持高细胞密度。
[0181] 在一些实施方案中，在合成丁二烯中供料至发酵的主要碳源来源于生物或者非生 物给料。
[0182] 在一些实施方案中，生物给料为，包括，或者衍生自单糖类、二糖类、木质纤维素、 半纤维素、纤维素、木质素如3-乙酰丙酸和糠醛、木质素、甘油三酯类如甘油和脂肪酸、农 业废物或者城市废物。
[0183] 起源于生化柴油生产的粗制甘油的有效分解代谢已经在数种微生物如大肠杆 菌、钩虫贪铜菌、食油假单胞菌、恶臭假单胞菌和解脂耶罗维亚酵母中证实（Lee等人， Appl.Biochem. Biotechnol.，2012, 166, 1801 - 1813 ;Yang 等人，Biotechnology for Biofuels, 2012, 5:13 ;Meijnen 等人，Appl. Microbiol. Biotechnol.，2011，90, 885-893)。
[0184] 木质纤维素衍生的3-乙酰丙酸的有效分解代谢已经在数种生物体如钩虫贪铜 菌和恶臭假单胞菌中在经前体丙酰基-CoA合成3-轻基戊酸（3-hydroxyvalerate)中 证实（Jaremko和Yu, Journal of Biotechnology, 2011，155, 2011，293 - 298 ;Martin和 Prather, Journal of Biotechnology, 2009, 139, 61 - 67)〇
[0185] 木质素衍生的芳族化合物如苯甲酸类似物的有效分解代谢已经在数 种微生物如恶臭假单胞菌、钩虫贪铜菌中证实（Bugg等人，Current Opinion in Biotechnology, 2011，22, 394 - 400 ;P6rez_Pantoja 等人，FEMS Microbiol. Rev.，2008, 32, 736 - 794)。
[0186] 农业废物如橄榄油厂废水的有效利用已经在包括解脂耶罗维亚酵母的数种微生 物中证实（Papanikolaou 等人，Bioresour. Technol.，2008, 99 (7)，2419-2428)。
[0187] 可发酵糖如衍生自纤维素、半纤维素、甘蔗和甜菜糖蜜、木薯、玉米和 其它农业来源的单糖类和二糖类的有效利用已经在数种微生物如大肠杆菌、 谷氨酸棒状杆菌和德氏乳杆菌和乳酸乳球菌中证实（参见例如，Hermann等 人，Journal of Biotechnology, 2003，104，155 - 172 ;Wee 等人，Food Technol. Biotechnol.，2006, 44 (2)，163 - 172 ;0hashi 等人，Journal of Bioscience 和 Bioenginee ring, 1999, 87(5)，647-654)。
[0188] 衍生自多种农业木质纤维素源的糠醛的有效利用已经在钩虫贪铜菌中证实（Li 等人，Biodegradation, 2011，22, 1215 - 1225)。
[0189] 在一些实施方案中，非生物给料为或者衍生自天然气、合成气、C02/H 2、甲醇、乙醇、 或者来自环己烷氧化工艺的非挥发性残留物（NVR)或碱洗废液流。
[0190] 甲醇的有效分解代谢已经在甲基营养酵母巴斯德毕赤酵母中证实。
[0191] 乙醇的有效分解代谢已经在克鲁佛梭菌中证实（Seedorf等人，？1~〇(：.似1:1.4〇3(1. Sci. USA, 2008, 105(6)2128-2133)。
[0192] CO2和H2(其可衍生自天然气和其它化学和石化产品源）的有效分解代谢已经在 钩虫贪铜菌中证实（Prybylski 等人，Energy, Sustainability and Society, 2012, 2:11)。
[0193] 合成气的有效分解代谢已经在大量微生物如杨氏梭菌和自产乙醇梭菌中证实 (Kdpke等人，Applied and Environmental Microbiology, 2011，77 (15)，5467 - 5475) 〇
[0194] 来自环己烷工艺的非挥发性残留物废物流的有效分解代谢已经在大量微生物如 食酸代尔夫特菌和钩虫贪铜菌中证实（Ramsay等人，Applied and Environmental Microb iology，1986, 52(1)，152 - 156)。
[0195] 在一些实施方案中，宿主微生物为原核生物。例如，所述原核生物可来自埃希氏菌 属如大肠杆菌；来自梭状芽胞杆菌属如杨氏梭菌、自产乙醇梭菌或者克鲁佛梭菌；来自棒 状杆菌属如谷氨酸棒状杆菌；来自贪铜菌属如钩虫贪铜菌或者耐金属贪铜菌；来自假单胞 菌属如荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌或者食油假单胞菌；来自代尔夫特菌属如食酸代尔夫 特菌；来自芽孢杆菌属如枯草芽胞杆菌；来自乳杆菌属如德氏乳杆菌；或者来自乳球菌属 如乳酸乳球菌。这种原核生物也可为构建本申请所述的能够产生丁二烯的重组宿主细胞的 基因源。
[0196] 在一些实施方案中，所述宿主微生物为真核生物。例如，真核生物可来自曲霉菌属 如黑曲霉菌；来自酵母菌属如酿酒酵母菌；来自毕赤酵母菌属如巴斯德毕赤酵母；或者来 自耶罗维亚酵母属如解脂耶罗维亚酵母；来自伊萨酵母属如东方伊萨酵母；来自德巴利酵 母属如汉逊德巴利酵母；来自Arxula属如Arxula adenoinivorans;或者来自克鲁维酵母 属如乳酸克鲁维酵母菌。这种真核生物也可为构建本申请所述的能够产生丁二烯的重组宿 主细胞的基因源。
[0197] 4. 5代谢工程
[0198] 本申请提供方法，所述方法包括少于对所有上面途径所述的所有步骤。这种方法 可包括，例如，这些步骤中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或者 更多个步骤。在这种方法包含少于所有步骤的情况下，第一步骤可为所列步骤中的任何步 骤。
[0199] 而且，本申请所述的重组宿主可包括上面的酶中的任何组合，使得所述步骤中的 一个或者多个，例如，这些步骤中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十 个或者更多个步骤可在重组宿主内实施。
[0200] 另外，本申请认识到，在已经将酶描述为接受CoA活化的底物的情况下，存在与 [acp]结合底物相关的类似的酶活性，其不一定在相同酶种类中。
[0201] 此外，本申请认识到，在已经将酶描述为接受底物的（R)-对映异构体的情况下， 存在与（S)-对映异构体底物相关的类似的酶活性，其不一定在相同酶种类中。
[0202] 本申请还认识到，在酶显示接受特定辅助因子如NADPH或者共底物如乙酰基-CoA 的情况下，许多酶在催化特定酶活性中在接受许多不同辅助因子或者共底物方面是杂乱的 (promiscuous)。此外，本申请认识到，在酶对于例如特定辅助因子如NADH具有高特异性的 情况下，对于辅助因子NADPH具有高特异性的具有类似或者相同活性的酶可在不同酶种类 中。
[0203] 在一些实施方案中，在小节4. 3中概述的途径中的酶是经非直接或者合理的酶设 计方法的酶工程的结果，目标为改善活性、改善特异性、减少反馈抑制、减少阻遏、改善酶溶 解度、改变立体特异性，或者改变辅助因子特异性。
[0204] 在一些实施方案中，将在小节4. 3中概述的途径中的酶经附加型或者染色体整合 方法基因给予（即，过表达）至所得的基因修饰生物体中。
[0205] 在一些实施方案中，使用基因组规模的系统生物学技术如通量平衡分析来设计用 于将碳通量引导至丁二烯的基因组规模的弱化或者敲除策略。
[0206] 弱化策略包括但不限于使用转位子、同源重组（双交换方法）、诱变、酶抑制剂和 RNAi干扰。
[0207]在一些实施方案中，使用通量组（fluxomic)、代谢组（metabolomic)和转录组 (transcriptomal)数据通知或者支持基因组规模的系统生物学技术，由此在将碳通量引导 至丁二烯中设计基因组规模的弱化或者敲除策略。
[0208] 在一些实施方案（其需要用于丁二烯合成的丙酰基-CoA或者丙烯酰基-CoA的细 胞内可用性）中，可将催化丙酰基-CoA和乙酰基-CoA的水解的酶在宿主生物体中弱化。
[0209] 在一些实施方案（其需要用于丁二烯合成的丙酰基-CoA或者丙烯酰基-CoA的细 胞内可用性）中，将经柠檬酸甲酯循环消耗丙酰基-CoA的酶在宿主生物体中弱化（Upton 和 Mckinney，Microbiology, 2007, 153, 3973-3982)。
[0210] 在一些实施方案（其需要用于丁二烯合成的丙酰基-CoA或者丙烯酰基-CoA的细 胞内可用性）中，将消耗丙酰基-CoA成丙酮酸的酶在宿主生物体中弱化。
[0211] 在一些实施方案（其需要用于丁二烯合成的丙酰基-CoA或者丙烯酰基-CoA的细 胞内可用性）中，将消耗丙酰基-CoA成丙二酸单酰基-CoA的酶在宿主生物体中弱化。
[0212] 在一些实施方案（其需要用于丁二烯合成的经L-苏氨酸作为中心代谢物的丙酰 基-CoA或者丙烯酰基-CoA的细胞内可用性）中，将抗反馈苏氨酸脱氨酶基因工程化至宿 主生物体中（Tseng 等人，Microbial Cell Factories, 2010, 9:96)。
[0213] 在一些实施方案（其需要用于丁二烯合成的乙酰基-CoA和丙酰基-CoA/丙烯酰 基-CoA的缩合）中，可将催化乙酰基-CoA缩合成乙酰乙酰基-CoA的P -酮硫解酶如AtoB 或者PhaA的基因产物弱化。
[0214] 在一些实施方案（其使用天然累积聚羟基烷酸酯的宿主）中，可将聚合物合酶在 宿主株中弱化。
[0215] 在一些实施方案（其需要用于丁二烯合成的乙酰基-CoA的细胞内可用性）中，可 使用缺乏（例如，弱化的活性水平）在乙酸合成途径（acetate synthesis pathway)中的 一种或者多种酶的宿主。例如，可使用缺乏磷酸转乙酰酶（由Pta基因编码）的宿主（Shen 等人，Appl. Environ. Microbio.，2011，77 (9)，2905 - 2915)。
[0216] 在一些实施方案（其需要用于丁二烯合成的乙酰基-CoA的细胞内可用性）中，将 在乙酸合成途径中编码乙酸激酶（acetate kinase)的基因如ack弱化。
[0217] 在一些实施方案（其需要用于丁二烯合成的乙酰基-CoA的细胞内可用性）中，将 编码降解丙酮酸成乳酸的基因如IdhA弱化（Shen等人，Appl. Environ. Microbio.，2011，7 7(9)，2905-2915)。
[0218] 在一些实施方案（其需要用于丁二烯合成的乙酰基-CoA的细胞内可用性）中，将 编码降解磷酸烯醇丙酮酸成琥珀酸的基因如frdBC弱化（参见例如，Shen等人，2011，同 上）。
[0219] 在一些实施方案（其需要用于丁二烯合成的乙酰基-CoA的细胞内可用性）中，将 编码降解乙酰基-CoA成乙醇的基因如adhE弱化（Shen等人，2011，同上）。
[0220] 在一些实施方案（其需要用于丁二烯合成的L-谷氨酸的细胞内可用性）中，将催 化补充柠檬酸循环中间体的添补反应的酶扩增。
[0221] 在一些实施方案（其使用MDD酶促形成第二乙烯基以形成丁二烯）中，tesB的硫 酯酶II基因产物将（R) -3-羟基戊-4-烯酰基-CoA水解成（R) -3-羟基戊-4-烯酸。
[0222] 在一些实施方案（其中途径在合成丁二烯中需要过量NADPH辅助因子）中，吡啶 核苷酸转氢酶基因如UdhA在宿主生物体中过表达（Brigham等人，Advanced Biofuels and Bioproducts，2012, Chapter 39, 1065-1090)。
[0223] 在一些实施方案（其中途径在合成丁二烯中需要过量NADPH辅助因子）中，甘油 醛-3P-去氢酶基因如GapN在宿主生物体中过表达（Brigham等人，2012,同上）。
[0224] 在一些实施方案（其中途径在合成丁二烯中需要过量NADPH辅助因子）中，苹果 酸酶基因如maeA或者maeB在宿主生物体中过表达（Brigham等人，2012，同上）。
[0225] 在一些实施方案（其中途径在合成丁二烯中需要过量NADPH辅助因子）中，葡萄 糖-6-磷酸去氢酶基因如zwf在宿主生物体中过表达（Lim等人，Journal of Bioscience and Bioengineering, 2002, 93(6), 543-549) 〇
[0226] 在一些实施方案（其中途径在合成丁二烯中需要过量NADPH辅助因子）中， 果糖1，6二磷酸酶基因如fbp在宿主生物体中过表达（Becker等人，Journal of Biotechnology, 2007, 132, 99-109)〇
[0227] 在一些实施方案中，通过以基因工程的方式对细胞膜进行结构修饰或者提高丁二 烯的任何相关转运子活性，将丁二烯跨越细胞膜到达细胞外介质的外向通量增强或者扩 大。
[0228] 在一些实施方案中，将降解丁二烯成毒性中间体如1，2-环氧-3-丁烯和 1，2:3, 4-二环氧丁烧的加氧酶在宿主生物体中弱化（参见例如，Sweeney等人，Carcinoge nesis，1997, 18(4)，611 - 625)。
[0229] 本发明将在以下实施例中进一步描述，其不限制权利要求中所述的本发明的范 围。
[0230] 实施例
[0231] 实施例I
[0232] 接受3-羟基戊-4-烯酸作为底物的甲羟戊酸二磷酸脱羧酶的酶活性
[0233] 在含有Luria Broth培养基的摇瓶培养物中的大肠杆菌中，将来自酿酒酵母菌、表 皮葡萄球菌和肺炎链球菌的his标记的MDD基因克隆和表达。
[0234] 将来自每一诱导的摇瓶培养物的沉淀物通过离心收集，然后将沉淀物重新悬浮并 溶解。细胞碎片与上清液通过离心分离，并使用〇. 2 ii m滤器过滤。使用Ni-亲和色谱从上 清液中纯化MDD酶，浓缩并通过使用IOkDa聚醚砜膜超滤至50mM氨基丁三醇缓冲剂（pH = 7. 5)、IOOmM NaCl和5% (v/v)甘油中而进行缓冲交换。
[0235]天然酶活性在包含 50mM Tris-HCl (pH = 7. 5)、IOOmM NaCl、5% (v/v)甘油、IOmM MgCl2、15mM ATP和5mM天然底物甲羟戊酸二磷酸（来自Sigma Aldrich)的缓冲液中在30°C 得到证实。酶活性测定反应通过以下方法引发：将10 U L每一纯化的MDD酶添加至含有底 物的测定缓冲液中。所有三种MDD酶接受甲羟戊酸二磷酸作为底物，如经LC-MS所证实。
[0236]非天然酶活性测定在包含 50mM Tris HCl(pH= 7.5)、100mM NaCl、5% (v/v)甘 油、IOmM MgCl2、15mM ATP和4mM非天然外消旋底物3-羟基戊-4-烯酸（纯度>95%，来自 Epison Chimie)的缓冲液中在30°C进行。非天然活性测定在2mL隔膜密封的小瓶中进行， 由此允许丁二烯在顶部空间中的累积。反应通过以下方法引发：将IOu L每一纯化的MDD 酶变体添加至含有底物的测定缓冲液中。
[0237] 对于使用3-羟基戊-4-烯酸作为底物的非天然酶活性测定，来自酿酒酵母菌、表 皮葡萄球菌和肺炎链球菌的三种MDD酶具有相似的色谱图和波谱。
[0238] 丁二烯标准物和测定样品的保留时间在2%内。丁二烯标准物的MS离子峰面积和 样品的MS离子峰面积的比率适合在20%内。此外，离子峰面积高于GC/MS的定量限。
[0239] 来自酿酒酵母菌、表皮葡萄球菌和肺炎链球菌的MDD酶接受3-羟基戊-4-烯酸作 为底物，从而合成丁二烯。
[0240] 实施例2
[0241] 在接受3-羟基戊-4-烯酸作为底物中提高甲羟戊酸二磷酸脱羧酶活性的氨基酸 残基
[0242] 图13提供来自酿酒酵母菌、表皮葡萄球菌和肺炎链球菌的MDD酶的氨基酸序列， 酶的催化裂隙内的保守残基以粗体表示。
[0243] 使用总蛋白质浓度和来自光密度测定法的纯度，来自酿酒酵母菌的纯化的MDD的 酶浓度为385iig/mL以及对于来自肺炎链球菌的纯化的MDD，酶浓度为88iig/mL。
[0244] 假设作为非天然底物的3-羟基戊-4-烯酸不完全转化，来自酿酒酵母菌的MDD 的比转化率为809 [(m/z 54离子的峰面积）Aiig MDD)]以及来自肺炎链球菌的MDD为 3200[(m/z 54离子的峰面积V(ygMDD)]。因此，来自肺炎链球菌的MDD的比转化率约为 来自酿酒酵母菌的MDD的比转化率的四倍。来自表皮葡萄球菌的MDD的比转化率位于来自 肺炎链球菌的MDD的比转化率和来自酿酒酵母菌的MDD的比转化率之间（未计算）。
[0245] 在催化性精氨酸残基的区域（在酿酒酵母菌中在R158,在表皮葡萄球菌中在R144 以及在肺炎链球菌中在R144)中的氨基酸残基揭示了在5个氨基酸残基内增加丝氨酸密 度的趋势。在酿酒酵母菌中的R158在5个氨基酸残基内具有3个丝氨酸残基（残基153、 155,和159)，在表皮葡萄球菌中的R144在5个氨基酸残基内具有4个丝氨酸残基（残基 139、141、143,和145)以及在肺炎链球菌中的R144在5个氨基酸残基内具有5个丝氨酸残 基（残基139、141、142、143，和145)。参见例如图13。
[0246] MDD在接受3-羟基戊-4-烯酸作为非天然底物中的活性随着在催化裂隙的催化性 精氨酸残基的区域内丝氨酸密度增加而增加。
[0247] 实施例3
[0248] 接受反式-2-丁烯基焦磷酸（trans-2-butenylpyrophosphate)作为底物的异戊 二烯合酶的酶活性
[0249] 在含有Luria Broth培养基的摇瓶培养物中的大肠杆菌中，将来自银白杨 (Populus alba)的his标记的异戊二烯合酶（ISPS)基因克隆和表达。
[0250] 将来自每一诱导的摇瓶培养物的沉淀物通过离心收集，然后将沉淀物重新悬浮并 溶解。细胞碎片和上清液经离心分离，并通过〇. 2 i! m滤器过滤。使用Ni-亲和色谱从上清 液中纯化ISPS酶变体，浓缩并使用IOkDa聚醚砜膜缓冲交换至50mM氨基丁三醇缓冲剂（pH =7. 5)、IOOmM NaCl 和 5 % (v/v)甘油中。
[0251]天然酶活性在包含 50mM Tris*HCl(pH = 7.5)、100mM NaCl、5% (v/v)甘油、20mM MgCl；^P5mM天然底物二磷酸二甲基烯丙酯（来自Sigma-Aldrich)的缓冲液中在30°C得到 证实。天然活性测定在2mL隔膜密封的小瓶中进行，由此允许异戊二烯在顶部空间中的累 积。酶活性测定反应通过以下方法引发：将10 U L每一纯化的ISPS酶添加至含有底物的测 定缓冲液中。来自银白杨（P. alba)的ISPS接受焦磷酸二甲基烯丙酯作为底物，如经GC-MS 所证实。
[0252]非天然酶活性测定在包含 50mM Tris ? HCl(pH = 7. 5)、100mM NaCl、5% (v/v) 甘油、20mM MgCl2和5mM非天然底物反式-2- 丁烯基焦磷酸（纯度>90% )(来自DALTON Pharma Services)的缓冲液中在30°C进行。非天然活性测定在2mL隔膜密封的小瓶中进 行，由此允许丁二烯在顶部空间中的累积。酶活性测定反应通过以下方法引发：将10 U L纯 化的ISPS酶添加至含有底物的测定缓冲液中。
[0253] 丁二烯标准物和测定样品的保留时间在2%内。丁二烯标准物的MS离子峰面积和 样品的MS离子峰面积的比率适合在20%内。此外，离子峰面积高于GC/MS的定量限。
[0254] 银白杨的ISPS酶接受反式-2- 丁烯基焦磷酸作为底物，从而合成丁二烯。
[0255] 其它实施方案
[0256] 应理解的是，尽管结合【具体实施方式】描述了本发明，但是前面的描述意图说明本 发明并且不意图限制本发明范围，本发明范围通过所附权利要求的范围限定。其它方面、优 点和修饰在所附权利要求的范围内。
【权利要求】
1. 用于生物合成丁二烯的方法，所述方法包括在丁二烯合成底物中形成两个末端乙烯 基。
2. 权利要求1的方法，其中在所述丁二烯合成底物中酶促形成第一乙烯基，从而产生 选自以下的化合物：2-氧代戊 -4_烯酸、丙烯基-CoA、（R) 3-轻基戊_4_烯酸、2, 4-戊二烯 醜基-[acp]、2, 4_戊二稀醜基-CoA、巴?醜基-CoA，和3_ 丁稀_2_醇。
3. 权利要求1或者权利要求2的方法，其中2-氧代戊-4-烯酸通过以下方法产生：使 用归类在EC 4. 1. 1.77中的4-草酰巴豆酸脱羧酶在（i)4-草酰巴豆酸中形成第一乙烯基， 使用归类在EC 3.7. 1.9中的2-羟基粘康酸-半醛水解酶在（ii)2-羟基粘康酸半醛中形 成第一乙烯基，或者使用归类在EC 3. 7. 1. 14中的2-羟基-6-氧代-2, 4-二烯壬二酸水解 酶在（iii) 2-羟基-6-氧代-2, 4-二烯-1，9-壬二酸中形成第一乙烯基。
4. 权利要求2或者3的方法，其中2-氧代戊-4-烯酸通过以下方法产生：使用归类在 EC 1. 2. 1. 32下的2氨基粘康酸半醛去氢酶将2-羟基粘康酸半醛转化成2-羟基粘康酸，使 用归类在EC 5. 3. 2. 6下的2-羟基粘康酸互变异构酶将2-羟基粘康酸转化成4-草酰巴豆 酸，并使用归类在EC 4. I. 1. 77下的4-草酰巴豆酸脱羧酶将4-草酰巴豆酸转化成2-氧代 戊-4-烯酸。
5. 权利要求3或者权利要求4的方法，其中2-羟基粘康酸半醛通过以下方法产生：使 用归类在EC 1. 13. 11. 2下的儿茶酚2, 3-双加氧酶将儿茶酚转化成2-羟基粘康酸半醛。
6. 权利要求5的方法，其中儿茶酚通过以下方法产生：使用归类在EC 1.14. 12. 1下的 邻氨基苯甲酸1，2-双加氧酶转化邻氨基苯甲酸或者使用归类在EC 4. I. 1. 63下的原儿茶 酸脱羧酶转化原儿茶酸。
7. 权利要求6的方法，其中邻氨基苯甲酸通过以下方法产生：使用归类在EC 4. 1. 3. 27 下的邻氨基苯甲酸合酶转化分支酸。
8. 权利要求5的方法，其中原儿茶酸通过以下方法产生：使用归类在EC 4. 2. 1.118下 的3-去氢莽草酸脱水酶转化3-去氢莽草酸。
9. 权利要求3或者4的方法，其中2-羟基粘康酸半醛通过以下方法产生：使用5-羧 基-2-轻基粘康酸-6-半醒脱羧酶转化5-羧基-2-轻基粘康酸-6-半醒。
10. 权利要求9的方法，其中所述5-羧基-2-羟基粘康酸-6-半醛脱羧酶由praH编 码。
11. 权利要求8或者9的方法，其中5-羧基-2-羟基粘康酸-6-半醛通过以下方法产 生：使用原儿茶酸2, 3-双加氧酶转化原儿茶酸。
12. 权利要求11的方法，其中所述原儿茶酸2, 3-双加氧酶由praA编码。
13. 权利要求3的方法，其中2-羟基-6-氧代-2, 4-二烯-1，9-壬二酸通过以下方法 产生：使用归类在EC 1. 13. 11. 16下的3-羧基乙基儿茶酚2, 3-双加氧酶转化2, 3-二羟基 苯基丙酸。
14. 权利要求13的方法，其中2, 3-二羟基苯基丙酸通过以下方法产生：使用归类在EC 1. 3. 1. 87下的3-(顺式-5, 6-二羟基环己-1，3-二烯-1-基）丙酸去氢酶转化顺式-3-(羧 基-乙基）_3, 5-环-己_稀-1，2- _醇。
15. 权利要求14的方法，其中顺式-3-(羧基-乙基）-3,5-环-己二烯-1,2-二醇通 过以下方法产生：使用归类在EC 1. 14. 12. 19下的3-苯基丙酸双加氧酶转化3-苯基-丙 酸。
16. 权利要求15的方法，其中3-苯基-丙酸通过以下方法产生：使用归类在EC 1. 3. 1. 31下的2-烯酸还原酶转化E-肉桂酸。
17. 权利要求16的方法，其中E-肉桂酸通过以下方法产生：使用归类在EC 4. 3. 1. 24 下的苯基丙氨酸脱氨酶转化L-苯基丙氨酸。
18. 权利要求1或者权利要求2的方法，其中所述丁二烯合成底物为丙酰基-CoA。
19. 权利要求2或者权利要求18的方法，其中丙烯酰基-CoA是通过以下方法产生的化 合物：使用归类在EC 1.3. 8.1下的丁酰基-CoA去氢酶或者归类在EC 1.3. 8. 7下的中链酰 基-CoA去氢酶在（i)丙酰基-CoA中形成第一乙烯基，使用归类在EC 4. 2. 1. 54下的乳酰 基-CoA脱水酶在（ii)乳酰基-CoA中形成第一乙烯基，或者使用归类在EC 4. 2. 1. 116下 的3-羟基丙酰基-CoA脱水酶在（iii) 3-羟基丙酰基-CoA中形成第一乙烯基。
20. 权利要求18的方法，其中丙酰基-CoA通过以下方法产生：使用归类在EC 2. 1. 3. 1 下的甲基丙二酸单酰基-CoA羧基转移酶或者归类在EC 4. I. 1. 41下的甲基丙二酸单酰 基-CoA脱羧酶转化（2S)-甲基丙二酸单酰基-CoA。
21. 权利要求20的方法，其中（2S)-甲基丙二酸单酰基-CoA通过以下方法产生：使用 归类在EC 5. 1.99. 1下的甲基丙二酸单酰基-CoA差向异构酶转化（2R)-甲基丙二酸单酰 基 _CoA。
22. 权利要求21的方法，其中（2R)-甲基丙二酸单酰基-CoA通过以下方法产生：使用 归类在EC 5. 4. 99. 2下的甲基丙二酸单酰基-CoA变位酶转化琥珀酸单酰基-CoA。
23. 权利要求18的方法，其中丙酰基-CoA通过以下方法产生：使用归类在EC 2. 3. 1.-下的2-酮丁酸甲酸裂解酶转化2-氧代-丁酸。
24. 权利要求23的方法，其中所述2-酮丁酸甲酸裂解酶由tdcE编码。
25. 权利要求23或者权利要求24的方法，其中2-氧代-丁酸通过以下方法产生：使 用归类在EC 4. 3. 1. 19下的苏氨酸脱氨酶转化L-苏氨酸。
26. 权利要求18的方法，其中丙酰基-CoA通过以下方法产生：使用丙醛去氢酶转化丙 醇。
27. 权利要求26的方法，其中所述丙醛去氢酶由pduP编码。
28. 权利要求26的方法，其中丙醇通过以下方法产生：使用归类在EC 4. 2. 1.28下的 丙二醇脱水酶转化1，2-丙二醇。
29. 权利要求18的方法，其中丙酰基-CoA由3-乙酰丙酸通过以下方法产生：使用归 类在EC 2. 3. 1.-下的转移酶转化3-乙酰丙酰基-CoA。
30. 权利要求29的方法，其中3-乙酰丙酰基-CoA通过以下方法产生：使用归类在EC 6. 2. 1.-下的酰基-CoA合成酶或者连接酶转化3-乙酰丙酸。
31. 权利要求19的方法，其中乳酰基-CoA通过以下方法产生：使用归类在EC 2. 8. 3. 1 下的丙酸CoA-转移酶转化L-乳酸。
32. 权利要求31的方法，其中L-乳酸通过以下方法产生：使用归类在EC 1.1. 1.27下 的L-乳酸去氢酶转化丙酮酸。
33. 权利要求19的方法，其中3-羟基丙酰基-CoA通过以下方法产生：使用归类在EC 3. 1. 2. 4下的3-羟基异丁酰基-CoA水解酶转化3-羟基丙酸。
34. 权利要求19的方法，其中3-羟基丙酰基-CoA通过以下方法产生：使用归类在EC 1. I. 1. 59下的3-羟基丙酸去氢酶转化丙二酸半醛。
35. 权利要求35的方法，其中丙二酸半醛通过以下方法产生：使用归类在EC 1. 2. 1. 75 下的丙二酸单酰基-CoA还原酶转化丙二酸单酰基-CoA。
36. 权利要求2或者权利要求19的方法，其中丙酰基-CoA通过以下方法产生：使用归 类在EC 1. 3. 8. 1下的丁酰基-CoA去氢酶或者归类在EC 1. 3. 8. 7下的中链酰基-CoA去氢 酶转化丙烯酰基-CoA。
37. 权利要求2的方法，其中（R) 3-羟基戊-4-烯酸丙烯酰基-CoA通过以下方法产生： 使用去饱和酶/单氧化酶或者细胞色素 P450在（R) 3-羟基戊酸中形成第一乙烯基。
38. 权利要求37的方法，其中（R)3-羟基-戊酸通过以下方法产生：使用归类在EC 3. 1. 2.-下的硫酯酶转化（R) 3-羟基戊酰基-CoA。
39. 权利要求38的方法，其中（R)3-羟基戊酰基-CoA通过以下方法产生：使用归类在 EC I. I. 1. 36下的乙酰乙酰基-CoA还原酶转化3-氧代戊酰基-CoA。
40. 权利要求39的方法，其中3-氧代戊酰基-CoA通过以下方法产生：使用归类在EC 2. 3. 1. 16下的乙酰基-CoA C-酰基转移酶转化丙酰基-CoA。
41. 权利要求2的方法，其中2, 4-戊二烯酰基_[acp]通过以下方法产生：使用酰 基-[acp]去氢酶在戊_2_烯醜基_acp中形成第一乙烯基。
42. 权利要求2的方法，其中2, 4-戊二烯酰基-CoA通过以下方法产生：使用归类在EC 4. 2. 1.-下的5-羟基戊酰基-CoA脱水酶在（i) 5-羟基戊酰基-CoA中形成第一乙烯基或者 使用归类在EC 1. 3. 1. 34下的2, 4-二烯酰基辅酶A还原酶在（ii)戊-3-烯酰基-CoA中 形成第一乙烯基。
43. 权利要求42的方法，其中所述5-轻基戊酰基-CoA脱水酶来源于Clostridium viride。
44. 权利要求2的方法，其中巴豆酰基-CoA通过以下方法产生：使用归类在EC 4. I. 1. 70下的戊烯二酸单酰基-CoA脱羧酶在（i)戊烯二酸单酰基-CoA中形成第一乙烯 基，使用归类在EC 4. 2. 1. 120下的4-羟基丁酰基-CoA脱水酶和归类在EC 5. 3. 3. 3下的 乙烯基乙酰基-CoA异构酶在（ii) 4-羟基丁酰基-CoA中形成第一乙烯基，或者使用归类在 EC 4. 2. 1. 119下的烯酰基-CoA水合酶在（iii) (R)3-羟基丁酰基-CoA中形成第一乙烯基。
45. 权利要求2的方法，其中3-丁烯-2-醇通过以下方法产生：使用去饱和酶或者单 氧化酶在2- 丁醇中形成第一乙烯基。
46. 权利要求1的方法，其中所述第二乙烯基在（R)3-羟基戊-4-烯酸中通过甲羟戊酸 二磷酸脱羧酶（MDD)酶促形成。
47. 权利要求1的方法，其中所述第二乙烯基在2- 丁烯-1-醇二磷酸酯或者3- 丁 烯-2-醇二磷酸酯中通过异戊二烯合酶（ISPS)酶促形成。
48. 权利要求1的方法，其中所述第二乙烯基在3- 丁烯-2-醇或者2- 丁烯-1-醇中通 过酶种类EC 4. 2. 1.-中的脱水酶酶促形成。
49. 权利要求48的方法，其中所述脱水酶为芳樟醇脱水酶（EC 4. 2. 1. 127)、奇维 酮水化酶（EC 4. 2. 1.95)、油酸水合酶（EC 4. 2. 1.53)或者类胡萝卜素1，2-水合酶（EC 4. 2. 1. 131)。
50. 权利要求41的方法，其中戊-2-烯酰基-[acp]通过以下方法产生：使用归类在EC 4. 2. 1. 59下的3-羟基酰基_[acp]脱水酶转化（R) 3-羟基戊酰基-[acp]。
51. 权利要求50的方法，其中（R)3-羟基戊酰基-[acp]通过以下方法产生：使用归类 在EC I. I. 1. 100下的3-氧代酰基-[acp]还原酶转化3-氧代戊酰基-[acp]。
52. 权利要求18和权利要求51的方法，其中3-氧代戊酰基-[acp]通过以下方法产 生：使用归类在EC 2. 3. 1. 41下的β -酮酰基-[acp]合酶I和酰基-转移酶如tcsA转化 丙醜基_CoA。
53. 权利要求41的方法，其中戊-2-烯酰基-[acp]通过以下方法产生：使用酰基转移 酶转化戊-2-烯酰基-CoA。
54. 权利要求53的方法，其中戊-2-烯酰基-CoA通过以下方法产生：使用归类在EC 4. 2. I. 119下的烯酰基-CoA水合酶转化（R) 3-羟基戊酰基-CoA。
55. 权利要求54的方法，其中（R)3-羟基戊酰基-CoA通过以下方法产生：使用归类在 EC I. I. 1. 36下的乙酰乙酰基-CoA还原酶转化3-氧代戊酰基-CoA。
56. 权利要求18和权利要求55的方法，其中3-氧代戊酰基-CoA通过以下方法产生： 使用归类在EC 2. 3. 1. 16下的乙酰基-CoA C-酰基转移酶转化丙酰基-CoA。
57. 权利要求42和权利要求54的方法，其中戊-3-烯酰基-CoA通过以下方法产生： 使用归类在EC 5. 3. 3. 8下的异构酶转化戊-2-烯酰基-CoA。
58. 权利要求42的方法，其中5-羟基戊酰基-CoA通过以下方法产生：使用归类在EC 2. 8. 3. 14下的5-羟基戊酸CoA-转移酶转化（i) 5-羟基戊酸或者使用细胞色素 P450转化 (ii)戊酰基-CoA。
59. 权利要求58的方法，其中所述细胞色素 P450是CYP153A6的基因产物。
60. 权利要求58的方法，其中5-羟基戊酸通过以下方法产生：使用5-羟基戊酸去氢 酶转化5-氧代戊酸。
61. 权利要求60的方法，其中所述5-羟基戊酸去氢酶是cpnD的基因产物或者来自 Clostridium viride 的去氢酶。
62. 权利要求60的方法，其中5-氧代戊酸通过以下方法产生：使用归类在EC 2. 6. 1. 48下的5-氨基戊酸转氨酶转化5-氨基戊酸。
63. 权利要求6262的方法，其中5-氨基戊酸通过以下方法产生：使用归类在EC 1. 21. 4. 1下的D-脯氨酸还原酶转化D-脯氨酸。
64. 权利要求63的方法，其中D-脯氨酸通过以下方法产生：使用归类在EC 5. 1. 1.4下 的脯氨酸消旋酶转化L-脯氨酸。
65. 权利要求64的方法，其中L-脯氨酸通过以下方法产生：使用归类在EC 1.5. 1.2下 的吡咯啉-5-羧酸还原酶转化（S) -1-吡咯啉-5-羧酸。
66. 权利要求65的方法，其中（S)-I-吡咯啉-5-羧酸通过以下方法产生：L-谷氨酸 5-半醒的自发转化。
67. 权利要求66的方法，其中L-谷氨酸5-半醛通过以下方法产生：使用归类在EC 1. 2. 1. 41下的谷氨酸-5-半醛去氢酶转化L-谷氨酰基-5-磷酸。
68. 权利要求67的方法，其中L-谷氨酰基-5-磷酸通过以下方法产生：使用归类在EC 2. 7. 2. 11下的谷氨酸5-激酶转化L-谷氨酸。
69. 权利要求54和权利要求58的方法，其中戊酰基-CoA通过以下方法产生：使用归 类在EC 1. 3. 1. 38下的反式_2_稀醜基-CoA还原酶转化戊_2_稀醜基_CoA。
70. 权利要求44的方法，其中戊烯二酸单酰基-CoA通过以下方法产生：使用归类在EC 4. 2. 1.-下的脱水酶转化2-羟基戊二酸单酰基-CoA。
71. 权利要求70的方法，其中2-羟基戊二酸单酰基-CoA通过以下方法产生：使用归 类在EC 2. 8. 3. 12下的戊烯二酸CoA-转移酶转化2-羟基戊二酸。
72. 权利要求71的方法，其中2-羟基戊二酸通过以下方法产生：使用归类在EC I. 1. 99. 2下的2-羟基戊二酸去氢酶转化2-氧代戊二酸。
73. 权利要求44的方法，其中3-羟基丁酰基-CoA通过以下方法产生：使用归类在EC 1. I. 1. 36下的3-羟基丁酰基-CoA去氢酶转化乙酰乙酰基-CoA。
74. 权利要求73的方法，其中乙酰乙酰基-CoA通过以下方法产生：使用归类在EC 2. 3. 1. 9下的乙酰基-CoA C-乙酰基转移酶转化乙酰基-CoA。
75. 权利要求44的方法，其中4-羟基丁酰基-CoA通过以下方法产生：使用CoA-转移 酶转化4-羟基丁酸。
76. 权利要求75的方法，其中所述CoA-转移酶是Ck-cat2的基因产物。
77. 权利要求75的方法，其中4-羟基丁酸通过以下方法产生：使用归类在EC I. I. 1. 61下的4-羟基丁酸去氢酶转化琥珀酸半醛。
78. 权利要求77的方法，其中琥珀酸半醛通过以下方法产生：使用归类在EC 1. 2. 1. 76 下的琥珀酸-半醛去氢酶转化琥珀酸单酰基-CoA。
79. 权利要求45的方法，其中2-丁醇通过以下方法产生：使用归类在EC LI. 1.B4下 的（R)-特异性仲醇去氢酶转化丁酮。
80. 权利要求79的方法，其中丁酮通过以下方法产生：使用归类在EC 4. 2. 1.28下的 丙二醇脱水酶转化2, 3 丁二醇。
81. 权利要求80的方法，其中2, 3 丁二醇通过以下方法产生：使用归类在EC 1.1. 1.4 下的（R，R)-丁二醇去氢酶转化（R)-3-羟基丁酮。
82. 权利要求81的方法，其中（R)-3-羟基丁酮通过以下方法产生：使用归类在EC 4. I. 1. 5下的乙酰乳酸脱羧酶转化2-乙酰乳酸。
83. 权利要求82的方法，其中2-乙酰乳酸通过以下方法产生：使用归类在EC 2. 2. 1.6 下的乙酰乳酸合酶转化丙酮酸。
84. 权利要求46的方法，其中（R) 3-羟基戊-4-烯酸通过以下方法产生：使用归类在 EC 3. 1. 2.-下的硫酯酶转化3-羟基戊-4-烯酰基-CoA。
85. 权利要求84的方法，其中3-羟基戊-4-烯酰基-CoA通过以下方法产生：使用归 类在EC 4. 2. 1.下的烯酰基-CoA脱水酶2转化2, 4-戊二烯酰基-CoA。
86. 权利要求85的方法，其中2, 4-戊二烯酰基-CoA通过以下方法产生：使用2-羟基 异己酰基-CoA脱水酶转化2-羟基戊-4-烯酰基-CoA。
87. 权利要求86的方法，其中所述2-羟基异己酰基-CoA脱水酶是起始子HadI和 HadBC的基因产物。
88. 权利要求86的方法，其中2-羟基戊-4-烯酰基-CoA通过以下方法产生：使用 CoA-转移酶转化2-羟基戊-4-烯酸。
89. 权利要求88的方法，其中所述CoA-转移酶是GctAB的基因产物。
90. 权利要求88的方法，其中2-羟基戊-4-烯酸通过以下方法产生：使用（R)-2-羟 基异己酸去氢酶转化2-氧代戊-4-烯酸。
91. 权利要求90的方法，其中所述（R)-2-羟基异己酸去氢酶是来自艰难梭菌的LdhA 的基因产物。
92. 权利要求46的方法，其中（R)-羟基戊-4-烯酸通过以下方法产生：使用归类在EC 3. 1. 2.-下的硫酯酶转化（R) 3-羟基戊-4-烯酰基-CoA。
93. 权利要求92的方法，其中（R) 3-羟基戊-4-烯酰基-CoA通过以下方法产生：使用 归类在EC I. I. 1. 36下的乙酰乙酰基-CoA还原酶转化3-氧代戊-4-烯酰基-CoA。
94. 权利要求93的方法，其中3-氧代戊-4-烯酰基-CoA通过以下方法产生：使用归 类在EC 2. 3. 1. 16下的β -酮硫解酶转化丙烯酰基-CoA。
95. 权利要求46的方法，其中（R)-羟基戊-4-烯酸通过以下方法产生：使用归类在EC 3. 1. 2.-下的硫酯酶转化（R) 3-羟基戊-4-烯酰基-CoA。
96. 权利要求95的方法，其中（R) 3-羟基戊-4-烯酰基-CoA通过以下方法产生：使用 (R) -3-羟基酰基-ACP: CoA转酰酶转化（R) -3-羟基戊-4-烯酰基-[acp]。
97. 权利要求96的方法，其中所述（R)-3-羟基酰基-ACP: CoA转酰酶是phaG的基因产 物。
98. 权利要求96的方法，其中（R)-3-羟基戊-4-烯酰基-[acp]通过以下方法产生： 使用归类在EC 4. 2. 1. 59下的3-羟基酰基-[酰基-载体-蛋白]脱水酶转化2, 4戊二烯 酰基- [acp]。
99. 权利要求95的方法，其中（R) 3-羟基戊-4-烯酰基-CoA通过以下方法产生：使用 归类在EC 4. 2. I. 119下的烯酰基-CoA脱水酶2转化2, 4-戊二烯酰基-CoA。
100. 权利要求47的方法，其中2-丁烯-1-醇二磷酸酯通过以下方法产生：使用归类在 EC 2. 7. 4. 2下的磷酸甲羟戊酸激酶或者使用归类在EC 2. 7. 6.-下的二磷酸激酶转化2-丁 烯-1-醇磷酸酯。
101. 权利要求100的方法，其中2-丁烯-1-醇磷酸酯通过以下方法产生：使用归类在 EC 2. 7. 1. 36下的甲羟戊酸激酶转化2- 丁烯-1-醇。
102. 权利要求101的方法，其中2-丁烯-1-醇通过以下方法产生：使用归类在EC I. I. 1. 54下的丙烯醇去氢酶转化2- 丁烯-1-醛。
103. 权利要求102的方法，其中2-丁烯-1-醛通过以下方法产生：使用归类在EC 1. 2. 1. 48下的长链醛去氢酶转化巴豆酸。
104. 权利要求103的方法，其中巴豆酸通过以下方法产生：使用归类在EC 6. 2. 1. 5下 的琥珀酸-CoA连接酶转化巴豆酰基-CoA。
105. 权利要求100和102的方法，其中2- 丁烯-1-醇二磷酸酯通过以下方法产生：使 用归类在EC 2. 7. 6.-下的二磷酸激酶转化2- 丁烯-1-醇。
106. 权利要求100或者105的方法，其中所述二磷酸激酶是归类在EC 2. 7. 6. 2下的硫 胺素二磷酸激酶。
107. 权利要求47的方法，其中3- 丁烯-2-醇二磷酸酯通过以下方法产生：使用归类 在EC 2. 7. 6.-下的二磷酸激酶转化3- 丁烯-2-醇或者使用归类在EC 2. 7. 4. 2下的磷酸 甲羟戊酸激酶转化3- 丁烯-2-醇磷酸酯。
108. 权利要求107的方法，其中3- 丁烯-2-醇磷酸酯通过以下方法产生：使用归类在 EC 2. 7. 1. 36下的甲羟戊酸激酶转化3- 丁烯-2-醇。
109. 前述权利要求中的任一项的方法，其中所述方法使用分离的酶进行。 11 〇.前述权利要求中的任一项的方法，其中所述方法使用包含所述酶的细胞溶胞产物 进行。
111. 前述权利要求中的任一项的方法，其中所述方法在重组宿主中进行。
112. 权利要求111的方法，其中将所述重组宿主厌氧地、微需氧地或者需氧地培养。
113. 权利要求112的方法，其中在发酵期间将所述重组宿主细胞保留在陶瓷中空纤维 膜中，从而维持高细胞密度。
114. 权利要求112的方法，其中供给至所述发酵的主要碳源来源于生物或者非生物给 料。
115. 权利要求114的方法，其中所述生物给料来自于或者衍生自单糖类、二糖类、木质 纤维素、半纤维素、纤维素、木质素如3-乙酰丙酸和糠醛、木质素、甘油三酯类如甘油和脂 肪酸、农业废物或者城市废物。
116. 权利要求114的方法，其中所述非生物给料来自于或者衍生自天然气、合成气、 C02/H2、甲醇、乙醇、或者来自环己烷氧化工艺的非挥发性残留物（NVR)或碱洗废液流。
117. 权利要求46的方法，其中所述归类在EC 4. 1. 1.33下的甲羟戊酸二磷酸脱羧酶的 氨基酸序列在催化裂隙的催化性精氨酸残基的任一侧的五个残基内包含四个丝氨酸残基 的最小数值。
118. 权利要求46的方法，其中所述甲羟戊酸二磷酸脱羧酶来源于链球菌属或者葡萄 球菌属。
119. 权利要求111的方法，其中所述宿主微生物是原核生物或者真核生物。
120. 权利要求1199的方法，其中所述宿主微生物是原核生物，所述原核生物来自埃希 氏菌属如大肠杆菌；来自梭状芽胞杆菌属如杨氏梭菌、自产乙醇梭菌或者克鲁佛梭菌；来 自棒状杆菌属如谷氨酸棒状杆菌；来自贪铜菌属如钩虫贪铜菌或者耐金属贪铜菌；来自假 单胞菌属如荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌或者食油假单胞菌；来自代尔夫特菌属如食酸代 尔夫特菌；来自芽孢杆菌属如枯草芽胞杆菌；来自乳杆菌属如德氏乳杆菌；或者来自乳球 菌属如乳酸乳球菌。
121. 权利要求119的方法，其中所述宿主微生物是真核生物，所述真核生物来自曲霉 菌属如黑曲霉菌；来自酵母菌属如酿酒酵母菌；来自毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母；来自 耶罗维亚酵母属如解脂耶罗维亚酵母；来自伊萨酵母属如东方伊萨酵母；来自德巴利酵母 属如汉逊德巴利酵母；来自Arxula属如Arxula adenoinivorans ;或者来自克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母菌。
122. 权利要求19、37、41或者42的方法，其中催化丙酰基-CoA和乙酰基-CoA的水解 的酶在宿主生物体中弱化。
123. 权利要求19、37、41或者42的方法，其中经柠檬酸甲酯循环消耗丙酰基-CoA的酶 在宿主生物体中弱化。
124. 权利要求19、37、41或者42的方法，其中消耗丙酰基-CoA成丙酮酸的酶在宿主生 物体中弱化。
125. 权利要求19、37、41或者42的方法，其中消耗丙酰基-CoA成丙二酸单酰基-CoA 的酶在宿主生物体中弱化。
126. 权利要求19、37、41或者42的方法，其中将抗反馈苏氨酸脱氨酶基因工程化至宿 主生物体中。
127. 权利要求19、37、41或者42的方法，其中将催化乙酰基-CoA缩合成乙酰乙酰 基-CoA的β -酮硫解酶如AtoB或者phaA的基因产物弱化。
128. 权利要求119的方法，其中将在天然累积聚羟基烷酸酯的宿主株中的聚合物合酶 弱化。
129. 权利要求19、37、41、42或者44的方法，其中将编码磷酸转乙酰酶的基因如？丨&弱 化。
130. 权利要求19、37、41、42或者44的方法，其中将编码降解丙酸的乙酸激酶的基因如 ack弱化。
131. 权利要求19、37、41、42或者44的方法，其中将编码降解丙酮酸成乳酸的基因弱 化。
132. 权利要求19、37、41、42或者44的方法，其中将编码降解磷酸烯醇丙酮酸成琥珀酸 的基因如frdBC弱化。
133. 权利要求19、37、41、42或者44的方法，其中将编码降解乙酰基-CoA成乙醇的基 因如adhE弱化。
134. 权利要求42的方法，其中将催化补充柠檬酸循环中间体的添补反应的酶扩增。
135. 权利要求19、37、41、42或者44的方法，其中将吡啶核苷酸转氢酶基因如UdhA在 宿主生物体中过表达。
136. 权利要求19、37、41、42或者44的方法，其中将甘油醛-3P-去氢酶基因如GapN在 宿主生物体中过表达。
137. 权利要求19、37、41、42或者44的方法，其中将苹果酸酶基因如maeA或者maeB在 宿主生物体中过表达。
138. 权利要求19、37、41、42或者44的方法，其中将葡萄糖-6-磷酸去氢酶基因如zwf 在宿主生物体中过表达。
139. 权利要求19、37、41、42或者44的方法，其中将果糖1，6二磷酸酶基因如fbp在宿 主生物体中过表达。
140. 权利要求19、37、41、42或者44的方法，其中通过以基因工程的方式对细胞膜进行 结构修饰，将丁二烯跨越所述细胞膜到达细胞外介质的外向通量增强或者扩大。
141. 权利要求120或者权利要求121的方法，其中通过以基因工程的方式使用于丁二 烯的任何相关的转运子活性增加，将丁二烯跨越细胞膜到达细胞外介质的外向通量增强或 者扩大。 权利要求120或者权利要求121的方法，其中将降解丁二烯成毒性中间体如1，2_环 氧-3- 丁烯和1，2:3, 4-二环氧丁烷的加氧酶在宿主生物体中弱化。
142. 权利要求38、84、92,或者95的方法，其中所述硫酯酶是tesB的基因产物。
143. 权利要求39、55,或者93的方法，其中所述乙酰乙酰基-CoA还原酶是phaB的基 因产物。
144. 权利要求40或者56的方法，其中所述乙酰基-CoA C-酰基转移酶是BktB的基因 产物。
145. 权利要求44或者54的方法，其中所述烯酰基-CoA水合酶是phaj的基因产物。
146. 权利要求37或者45的方法，其中所述去饱和酶是MdpJ的基因产物。
147. 权利要求37或者45的方法，其中所述细胞色素 P450是CYP4家族的基因产物。
148. 权利要求52的方法，其中所述β -酮酰基_[acp]合酶I是tcsB的基因产物。
149. 权利要求52的方法，其中所述酰基-转移酶是tcsA的基因产物。
【文档编号】C12P5/02GK104321434SQ201280068870
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2012年11月30日 优先权日:2011年12月2日
【发明者】P.S.珀尔曼, C.陈, A.波特斯, A.V.E.康拉蒂 申请人:英威达技术有限责任公司