专利名称：定点重组的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及可用于在人基因组中特定的位点进行基因重组的组合物和方法，以及由此产生的基因修饰的细胞。
背景技术：
基因打靶是根据同源重组的原理而设计的一项技术。在这一技术中，体内细胞基因组的某一段DNA序列被视为“靶子”，经精巧构建的欲导入的外源基因DNA序列被视为“弹头”，这样导入的外源基因进入受体细胞后就不再是随机重组，而是“弹头”锚准“靶子”进行准确的定点重组。外源基因导入前必须经过精巧的构建，经构建的外源基因称为打靶载体(targeting vector)。基因打祀的结果有如下可能:(I)祀基因被灭活，即基因敲除，当打革El载体中插入一个特定的DNA序列就可以实现基因敲除(gene knockout)。(2)祀基因被导入的外源基因替代，可以是以正常基因替代突变的基因。(3)在受体细胞基因组中定点引入一个原本不存在的完全新的基因,称之为基因敲入(gene knockin)。历经30多年的发展，研究者们通过逆转录病毒介导、转座子介导、乙烷亚硝基诱变、限制性内切酶产生DNA双链断裂等方法结合位点特异性重组酶进行了大量的基因打靶实践，已经在酵母、果蝇、植物、小鼠、人类干细胞的基因修饰、基因删除、基因替换等方面取得了显著的成果。继2006年诺贝尔医学奖授予让致病基因沉默的RNA干扰技术之后，2007年诺贝尔医学奖又颁 发给了基因敲除技术。两者都属于生物学中极为重要的重组DNA技术领域。然而,传统的基因重组技术,如Cre-1oxP和FLP-FRT基因重组系统等，由于①细胞内的同源重组频率低下( 10_6)，远低于非同源末端连接(二者比例为1: 10 000 1:1000);②外源DNA进入细胞后，绝大多数会借助非同源末端连接途径随机插入基因组，容易造成功能基因断裂、原癌基因激活、染色体缺失、重排，最终外源基因沉默或者细胞癌变；③加之细胞的DNA转化率低(通常1% -5% )，需要大量的处理细胞，以至于在后期的筛选工作中需要耗费大量的人力、物力和时间。这些问题成为当前限制其发展和推广应用的瓶颈。为了解决这些问题，研究者们需要在提高同源重组效率和建立高效的后期筛选方法两个方面进行大量的探索。锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases, ZFN)技术的出现促使基因组靶向修饰技术向前迈进了一大步，主要体现在整合效率由传统技术的0.0001%提高到1% -20%。Sigma公司基于此项技术，开发了使用重组腺相关病毒(rAAV)载体可将外源基因定点引入人19ql3.4 AAVSl位点和鼠Rosa26位点的试剂盒。AAV载体虽然已被证明是唯一具有定点整合特性的载体，然而，其包装能力限制了打靶载体的长度，外源DNA长度为4.1-4.9kb时其包装效率最高。且对于许多研究者而言，设计出特异性靶向基因组目的序列的锌指核酸酶仍然是一个相当大的技术挑战，4-6个月的实验周期将耗费大量的人力和财力。事实上，由于病毒载体发生的随机整合激活了 LM02表达，致使接受2年基因治疗的SCID-XI患者又换上了白血病，已引发了对基因治疗可行性的争议和安全性的重视。现已证实，重组腺相关病毒载体一旦去除R印基因，即会失去定点整合能力，其随机整合便会造成染色体缺失、重排和功能基因被打断等后果。近年，来自Sangamo BioSciences公司和哈佛大学两个研究小组的两篇研究论文发表在同一期的《自然生物技术》(Nature Biotechnology)杂志上,分别介绍了一种类似的基因组祀向修饰技术-TALENs (Transcription Activator-Like Effector Nucleases)技术，即植物病原体中的一种转录激活子样效应因子(transcription activator-like effector, TALE)表现出了 DNA结合特异性，不同于每个锌指蛋白识别特异性的三联体碱基，TALEs上的每个重复可变的d1-residues (RVDs)位点仅能识别一个碱基。将TALE的DNA结合功能域与野生型FokI限制酶引发DNA双链断裂的功能域连接形成重组蛋白，就形成了一种基于引发同源重组的基因组靶向修饰技术。可是，合成出如此多重复序列的TALEs是很困难的，而且其脱靶活性以及基本生物特性包括结构和亲和力等尚待研究。迄今为止，全世界科学家利用基因打靶技术已经对上万种基因的功能进行了研究，由此催生出新的药物(如癌基因靶向治疗药物)以及新的疾病治疗方法(如血友病基因治疗方法)等，并培育了上千种存在不同基因变异的人类疾病动物模型和细胞株模型。但是，基因打靶技术仍然存在诸多不足之处:①由于外源基因整合位点常常不在转录活跃区域，很多基因打靶的敲入基因表达量低且不稳定；②通常基因打靶敲入需要置换体内一些原有的基因，这极有可能影响细胞基因组的稳定性，改变邻近基因的功能，内环境平衡被打破，细胞的生物学特性也将发生改变，基因工程下游的生产工艺优化困难重重；③基因打靶的基因敲入技术利用的同源重组靶位点通常为单拷贝序列，与载体发生同源重组的概率极低，即定点整合效率太低。目前，安全、高效、稳定的基因打靶优选靶位点少见报道，且现有的基因重组技术也有诸多不足之处有待改进。
发明内容
本申请提供了能够在靶核苷酸序列中定点重组外源序列的组合物和方法。在一方面，本申请提供了分离的多核苷酸，其含有高表达位点的至少7个连续核苷酸，其中所述高表达位点存在于人的染色体或基因组中。在某些实施方式中，所述高表达位点选自下组:HumanGenome.1TSl 到 HumanGenome.1TS155。在另一方面，本申请提供了低聚化合物，含有可特异性杂交于靶位点的靶区域，所述靶位点含有高表达位点的至少7个连续核苷酸，其中所述高表达位点存在于人的染色体或基因组中。在某些实施方式中，所述靶区域含有低聚的核苷酸。所述靶区域可以含有至少一个修饰的核苷酸。至少一个所述修饰的核苷酸可以是锁核酸。在某些实施方式中，所述靶区域是5’ 一 3’走向的，且所述靶位点是3’ 一 5’走向的，或者所述靶区域是3’ 一 5’走向的，且所述靶位点是5’ 一 3’走向的。在某些实施方式中，所述靶区域与所述靶位点有50%到100%的互补性。在某些实施方式中，低聚化合物进一步含有能够与第二低聚化合物形成结合的结合区域。所述结合可以是碱基配对、共价键、非共价键、共价接头、或非共价接头。所述结合区域可以连接在所述靶区域的5’上游，或连接在所述靶区域的3’下游。在某些实施方式中，所述结合区域可以含有核苷酸，在某些实施方式中也可以含有至少一个修饰的核苷酸，在某些实施方式中至少一个所述修饰的核苷酸是锁核酸。在另一方面，本申请提供了低聚构建体，其含有:第一低聚化合物，其含有与第一结合区域连接的第一 5’一 3’靶区 域；第二低聚化合物，其含有与第二结合区域连接的第二3’一 5’靶区域；以及在第一结合区域和第二结合区域之间的结合；其中:所述第一 5’一 3’靶区域与第一 3’ 一 5’靶位点可特异性杂交；所述第二 3’ 一 5’靶区域与第二 5’ 一 3’靶位点可特异性杂交；且所述第一 3’ 一 5’靶位点和所述第二 5’ 一 3’靶位点各含有高表达位点的至少7个连续核苷酸，其中所述高表达位点存在于人的染色体或基因组中。在某些实施方式中，所述第二 5’ 一 3’靶位点位于所述第一 3’ 一 5’靶位点在所述高表达位点上的互补序列的5’上游或3’下游。在另一方面，本申请提供了多核苷酸供体，其含有第一 5’ 一3’同源位点，其含有高表达位点的5’ 一 3’链的至少7个连续核苷酸的同源序列，其中所述高表达位点存在于宿主细胞的染色体或基因组中，并且允许位于所述高表达位点中的基因高度表达。本申请还提供了多核苷酸供体，其含有第一 3’ 一 5’同源位点，其含有高表达位点的3’ 一 5’链的至少7个连续核苷酸的同源序列，其中所述高表达位点存在于宿主细胞的染色体或基因组中，并且允许位于所述高表达位点中的基因高度表达。在某些实施方式中，所述供体进一步含有第二 5’ 一 3’同源位点，其含有所述高表达位点的5’ 一 3’链的至少7个连续核苷酸的同源序列。在某些实施方式中，所述 第一 3’ —5’同源位点位于所述第二 5’ 一3’同源位点在所述供体上的互补序列的5’上游或3’下游。在某些实施方式中，所述供体进一步含有外源序列，所述外源序列两端侧接有所述第一 3’ 一5’同源位点和所述第二 5’ 一3’同源位点。在某些实施方式中，所述外源序列含有外源基因、外源调控序列、和外源限制性克隆位点中的一个或多个。在某些实施方式中，所述外源序列进一步含有选择性标记。在另一方面，本申请提供了在染色体或基因组上含有高表达位点的宿主细胞，其进一步含有本申请提供的低聚构建体。在某些实施方式中，所述宿主细胞进一步含有本申请提供的多核苷酸供体。在某些实施方式中，所述供体进一步含有外源序列，所述外源序列的两端侧接有所述第一 3’ 一 5’同源位点和所述第二 5’ 一 3’同源位点。所述外源序列可以含有一个或多个基因。在某些实施方式中，所述宿主细胞进一步含有能够促进外源序列与高表达位点重组的重组促进剂。所述重组促进剂可以是重组酶、重组酶的编码序列或化合物。在另一方面，本申请提供了人宿主细胞，其在染色体或基因组上含有第一高表达位点，其中所述第一高表达位点处整合了第一外源序列。在某些实施方式中，所述第一外源序列含有一个或多个功能性基因。在某些实施方式中，宿主细胞的染色体上进一步含有第二高表达位点，其中所述第二高表达位点处整合了第二外源序列。在某些实施方式中，所述第二外源序列含有一个或多个功能性基因。所述第一外源序列中的功能性基因和所述第二外源序列中的功能性基因相同或不同。在某些实施方式中，所述第一和/或所述第二外源序列中至少有一个外源基因能够在所述宿主细胞中稳定表达，或稳定高表达。在某些实施方式中，所述宿主细胞传代30代以后，所述第一和/或第二外源序列中至少有一个外源基因的表达与未整合所述外源序列的对照细胞相比至少高10 %、高15 %、高20 %、高30 %、高40%、高50%、高60%、高70%或者更高。所述宿主细胞可以是稳定的细胞系。如果对照细胞中不表达外源基因或者检测不到外源基因的表达，则所述“至少高10%”是指在本发明的整合了外源基因的宿主细胞中能够检测到外源基因的表达。在另一方面，本申请提供了试剂盒，其含有本申请提供的两个低聚化合物，其能够形成如本申请所提供的低聚构建体；以及本申请所提供的多核苷酸供体，其中所述低聚构建体可与所述供体的所述第一同源位点和所述第二同源位点特异性杂交。在另一方面，本申请提供了试剂盒，其含有本申请提供的低聚构建体；以及本申请所提供的多核苷酸供体，其中所述低聚构建体可与所述供体的所述第一同源位点和所述第二同源位点特异性杂交。在另一方面，本申请提供了在宿主细胞的基因组中引入外源序列的方法，所述宿主细胞的染色体或基因组中含有高表达位点，所述方法包括:向所述宿主细胞中引入本申请的低聚构建体，本申请提供的多核苷酸供体，其中所述低聚构建体与所述供体的所述第
一3’ 一 5’同源位点和所述第二 5’ 一 3’同源位点特异性杂交，以及培养所述宿主细胞以允许所述外源序列重组到所述宿主细胞的所述高表达位点中。所述方法可以进一步包括向所述宿主细胞中弓I入重组促进剂。在另一方面，本申请提供了在宿主细胞的基因组中表达外源基因的方法，所述宿主细胞的染色体或基因组中含有高表达位点，所述方法包括:向所述宿主细胞中引入本申请提供的低聚构建体，本申请提供的多核苷酸供体，其中所述低聚构建体与所述供体的所述第一 5’ 一 3’同源位点和所述第二 3’ 一 5’同源位点特异性杂交，其中所述多核苷酸供体含有的所述外源序列是 外源基因，以及培养所述宿主细胞以允许所述外源基因重组到所述宿主细胞的所述高表达位点中。
图1显示低聚构建体的示意图。(a)中的低聚构建体中，两个低聚化合物中的靶区域位于结合区域的3’下游，当结合区域形成结合后，两个靶区域分别位于各自低聚化合物的3’端；(b)中的低聚构建体中，两个低聚化合物中的靶区域位于结合区域的5’上游，当结合区域形成结合后，两个靶区域分别位于各自低聚化合物的5’端。图2为定点重组方法的原理图。简单地说，本申请的一对低聚化合物可以形成低聚构建体，低聚构建体中的靶区域可以与靶核苷酸序列中的靶位点特异性杂交，也可以与多核苷酸供体中的同源位点特异性杂交。这样的特异性杂交使得多核苷酸供体的同源位点附近产生了单链结构，靶核苷酸的靶位点附近也产生了单链结构。在这些单链结构之间可以进行重组，使得多核苷酸供体的同源位点附近的序列能够重组到靶核苷酸的靶位点附近。可选地，可以使用重组促进剂来提高重组效率。图3是PCR分析的电泳结果，其中的图片通过软件处理反色显示。图中M是DNAIOObpladder marker ’第1_5泳道是高表达位点iTS45_l的扩增片段，第6泳道是外源基因GPR4的扩增片段。图4为对照和重组HEK293细胞的RT-PCR产物的琼脂糖电泳检测结果，其中的图片通过软件处理反色显示。M是DNA IOObp ladder marker,第I泳道代表在对照组HEK293细胞中，GPR4基因的RT-PCR结果；第2_4泳道是在HEK293宿主细胞(第I代)的iTS45_l位点处进行GPR4基因重组后，GPR4基因的RT-PCR结果。图5为PCR分析的电泳结果，其中的图片通过软件处理反色显示，“Marker”表示分子标记，“iTS45-2”和“iTS117”分别表示iTS45_2和iTS117扩增片段。图6为PCR分析的电泳结果，其中的图片通过软件处理反色显示，“Marker”表示分子标记，“itS118”表示iTS118扩增片段。图7是PCR分析的电泳结果，其中的图片通过软件处理反色显示，“Marker”表示分子标记，“S0X2”表示外源基因S0X2的扩增片段，约为lOOObp。图8为检测GPR4基因整合在HEK293宿主细胞中(第30代)iTS45_l位点处表达水平的Elisa结果图。在挑选出的细胞克隆中检测到GPR4蛋白的表达，特别是在第4、8、
12、16、33和35个细胞克隆中，检测到显著高水平的GPR4蛋白表达。图9为Western Blot图，检测了在第I代细胞克隆中，整合在HEK293宿主细胞中1TS45-1和iTS45-2位点处的S0X2基因的表达水平。图10为Western Blot图，检测了在第I代细胞克隆中，整合在HEK293宿主细胞中iTS-117和iTSl 18位点处的S0X2基因的表达水平。图11为Western Blot图，检测了在第10代细胞克隆中，整合在HEK293宿主细胞中iTS45-l、iTS45-2、iTS117和iTS118位点处的S0X2基因的表达水平。图12为Western Blot图，检测了在第20代细胞克隆中，整合在HEK293宿主细胞中iTS45-l、iTS45-2位点、iTSl 17和iTSl 18处的S0X2基因的表达水平。图13为pROSE质粒的D NA序列。
具体实施例方式定点重组在一方面，本申请提供的组合物和方法可用于定点重组外源序列，例如，在靶核苷酸序列中定点重组外源序列。“定点重组”，在本申请中是指，将外源序列通过非随机的方式整合到靶核苷酸序列的特定的靶位点处。例如，可以整合到某特定靶位点的5’上游、3’下游、或两个特定靶位点之间。“外源序列”在本申请中是指，期望被定点重组到靶位点处的核苷酸序列。外源序列可以是靶核苷酸序列中不存在的序列，或者可以是存在于靶核苷酸序列中、但是不存在于靶位点处的序列。“靶核苷酸序列”在本申请中是指，含有靶位点的任何多核苷酸序列，其能够容纳外源序列在靶位点处的整合。在某些实施方式中，靶核苷酸序列是双链的DNA序列。示例的靶核苷酸序列包括，但不限于，细胞的基因组中的多核苷酸序列、细胞基因组外的多核苷酸序列(例如线粒体基因组)、质粒、和双链的多核苷酸。优选地，靶核苷酸序列是染色体或基因组本身，或其中的序列，更优选地，是人类染色体或基因组中的序列。在某些实施方式中，靶核苷酸序列是人类染色体或基因组本身，或其中的序列。“靶位点”在本申请中是指，在靶核苷酸中任何一段感兴趣的核苷酸序列。靶位点的选择可以不受任何限制，在靶核苷酸中任何感兴趣的核苷酸序列都可以作为靶位点。在某些实施方式中，靶位点可以存在于人类的基因组或染色体的高表达位点中，或该高表达位点中的某个区段或片段。不受理论的限制，认为通过碱基互补原则，可以设计出与靶位点具有足够互补度的本申请的组合物(如低聚化合物或低聚构建体)，使其能够通过碱基互补的方式识别靶核苷酸序列上的靶位点。同时，也可以根据靶位点的碱基序列，设计出与靶位点具有足够同源度的同源序列，使得本申请的组合物也能够通过碱基互补的方式识别同源序列。这样，一方面，本申请的组合物结合靶位点序列，另一方面，本申请的组合物也结合同源序列，由此促使同源序列与靶位点序列之间的同源重组(例如，见图2)。当同源序列还连接有外源序列时，可以通过本申请的组合物，将该外源序列定点重组到所选择的靶位点处。理论上，根据碱基互补的原则，可以对靶核苷酸序列中任何感兴趣的靶位点设计出本申请的组合物，从而实现外源序列在这些靶位点处的定点重组。高表达位点在一方面，本申请提供的组合物和方法可用于在哺乳动物细胞，特别是人类细胞中定点重组外源序列。在某些实施方式中，可以在人类细胞的高表达位点中定点重组外源序列。“高表达位点”在本申请中是指，存在于宿主细胞的染色体或基因组中的一段多核苷酸区域，当某基因位于该区域时，其表达水平提高或表达效率提高。例如，当某基因位于高表达位点中时，其产生的基因产物的量(如转录的RNA拷贝数，或表达的蛋白的量)高于当相同拷贝数的该基因位于染色体的非高表达位点时、或者随机整合入染色体时产生的基因产物的量，例如，至少高约I倍、高约2倍、高约5倍、高约10倍、高约20倍、高约30倍、高约40倍、高约50倍、高约60倍、高约70倍、高约80倍、高约90倍、高约100倍、高约200倍、高约300倍、高约400倍、高约500倍、或高约1000倍。在某些实施方式中，高表达位点可以是本领域公知的基因表达水平较高的任何区域(gegion of Increased Gene Expression, RIDGE)。本领域公知，在染色体或基因组中，位于某些区域中的基因能够被高表达，这样的区域被称为RIDGE (见，例如，Caron等，Science, 291 (5507): 1289-1292 (2001))。可以通过本领域已知的方法识别出RIDGE，例如，通过将基因组中的表达序列标签(Expression Sequence Tag7EST)与在组织或细胞中的转录产物文库(如，Serial Analysis of Gene Expression, SAGE文库)进行比较,识别出高表达的EST并找到它们在基因组上聚集的区域，S卩RIDGE。再例如，Versteeg等总结了 RIDGE的特征，包括:基因以较高密度聚集、内含子短、富含SINE重复序列，和/或LINE重复序列少等(见，例如，Versteeg et al,Genome Res.,13:1998-2004(2003))。本领域技术人员基于这些特征，也可以在染色体或基因组中进行筛选，从而找到对应的RIDGE。再例如，Zhou等列出了在染色体上，特别是在肿瘤细胞的染色体上高表达的区域(见下表1，摘自Zhou等,Cancer Research,63:5781_5784(2003))。本领域人员根据已知的染色体命名规则(例如，ISCN 2005:aninternational system for human cytogenetic nomenclature(2005):recommendations of theInternational Standing Committee on Human CytogeneticNomenclature, published by KargerPublishers, 2005),可以很容易地找到表 I 中所列出的这些染色体上的高表达位点。 表1、不例性的基因表达升闻的区域
权利要求
1.分离的多核苷酸，其含有高表达位点的至少7个连续核苷酸，其中所述高表达位点存在于人的染色体或基因组中。
2.如权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中所述高表达位点选自下组:HumanGenome.1TSl 至Ij HumanGenome.1TS155。
3.低聚化合物，含有可特异性杂交于靶位点的靶区域，所述靶位点含有高表达位点的至少7个连续核苷酸，其中所述高表达位点存在于人的染色体或基因组中。
4.如权利要求3所述的低聚化合物，其中所述靶位点含有所述高表达位点的3’一 5’链的至少7个连续核苷酸,所述高表达位点选自下组:HumanGenome.1TSl到HumanGenome.1TS155。
5.如权利要求3所述的低聚化合物，其中所述靶位点含有所述高表达位点的5’一3’链的至少7个连续核苷酸,所述高表达位点选自下组:HumanGenome.1TSl到HumanGenome.1TS155。
6.如权利要求3-5任一所述的低聚化合物，进一步含有能够与第二低聚化合物结合的结合区域，所述结合区域与靶区域连接。
7.如权利要求6所述的低聚化合物，其中所述第二低聚化合物含有第二靶区域和第二结合区域。
8.如权利要求7所述的低聚化合物，其中所述第二靶区域与第二靶位点特异性杂交，所述第二靶位点含有在人染色体或基因组中存在的高表达位点的至少7个连续核苷酸，其中所述第一靶位点和所述第二靶位 点在所述高表达位点的相反链上。
9.低聚构建体，含有: 第一低聚化合物，其含有与第一结合区域连接的第一 5’ 一 3’靶区域； 第二低聚化合物，其含有与第二结合区域连接的第二 3’ 一5’靶区域；以及 在第一结合区域和第二结合区域之间的结合； 其中: 所述第一 5’ 一 3’靶区域与第一 3’ 一 5’靶位点可特异性杂交；所述第二 3’ 一 5’靶区域与第二 5’ 一 3’靶位点可特异性杂交；且 所述第一 3’ 一 5’靶位点和所述第二 5’ 一 3’靶位点各含有高表达位点的至少7个连续核苷酸，其中所述高表达位点存在于人的染色体或基因组中。
10.如权利要求9所述的低聚构建体，其中所述第一5’一 3’靶区域与所述第一 3’一 5’靶位点有50%到100%互补性，和/或所述第二 3’ 一 5’靶区域与所述第二 5’ 一 3’靶位点有50 %到100 %互补性。
11.如权利要求9所述的低聚构建体，其中所述第一3’一 5’靶位点含有所述高表达位点的3’ 一 5’链的至少7个连续核苷酸,所述高表达位点选自下组:HumanGenome.1TSl到HumanGenome.1TS155。
12.多核苷酸供体,含有第一5’ 一3’同源位点，所述同源位点含有高表达位点的5’一 3’链的至少7个连续核苷酸的同源序列，其中所述高表达位点存在于人的染色体或基因组中。
13.多核苷酸供体,含有第一3’ 一5’同源位点，所述同源位点含有高表达位点的3’一 5’链的至少7个连续核苷酸的同源序列，其中所述高表达位点存在于人的染色体或基因组中。
14.如权利要求13所述的供体，其中所述供体进一步含有第二5’一 3’同源位点，其含有所述高表达位点的5’ 一 3’链的至少7个连续核苷酸的同源序列。
15.如权利要求12-14任一所述的供体,其中所述高表达位点选自下组:HumanGenome.1TSl 至Ij HumanGenome.1TS155。
16.如权利要求14所述的供体，进一步含有外源序列，所述外源序列两端侧接有所述第一 3’ 一 5’同源位点和所述第二 5’ 一 3’同源位点。
17.试剂盒，含有: 如权利要求6所述的两个低聚化合物，其能够形成如权利要求9所述的低聚构建体；以及 如权利要求14所述的多核苷酸供体， 其中所述低聚构建体可与所述供体的所述第一同源位点和所述第二同源位点特异性杂交。
18.试剂盒，含有: 如权利要求9所述的低聚构建体；以及 如权利要求14所述的多核苷酸供体， 其中所述低聚构建体可与所述供体的所述第一同源位点和所述第二同源位点特异性杂父。
19.在染色体或基因组上含有高表达位点的宿主细胞，进一步含有如权利要求9所述的低聚构建体。
20.如权利要求19所述的宿主细胞，进一步含有如权利要求14所述的多核苷酸供体。
21.如权利要求20所述的宿主细胞，其中所述供体进一步含有外源序列，所述外源序列的两端侧接有所述第一 3’ 一 5’同源位点和所述第二 5’ 一 3’同源位点。
22.如权利要求21所述的宿主细胞，进一步含有能够促进外源序列与高表达位点重组的重组促进剂。
23.人宿主细胞，在染色体或基因组上含有第一高表达位点，其中在所述第一高表达位点处整合了第一外源序列。
24.在宿主细胞的基因组中引入外源序列的方法，所述宿主细胞的染色体或基因组中含有高表达位点，所述方法包括: 向所述宿主细胞中引入如权利要求9所述的低聚构建体，如权利要求21所述的多核苷酸供体， 其中所述低聚构建体与所述供体的所述第一 3’ 一 5’同源位点和所述第二 5’ 一 3’同源位点特异性杂交，以及 培养所述宿主细胞以允许所述外源序列重组到所述宿主细胞的所述高表达位点中。
25.在宿主细胞中表达外源基因的方法，所述宿主细胞的染色体或基因组中含有高表达位点，所述方法包括: 向所述宿主细胞中引入如权利要求9所述的低聚构建体，如权利要求21所述的多核苷酸供体， 其中所述低聚构建体与所述供体的所述第一 5’ 一 3’同源位点和所述第二 3’ 一 5’同源位点特异性杂交， 其中所述多核苷酸供体含有的所述外源序列是外源基因，以及 培养所述宿主细胞以允许所述外源基因重组到所述宿主细胞的所述高表达位点中。
全文摘要
本申请提供了能够在靶核苷酸序列中定点重组外源序列的组合物和方法，特别地，在靶核苷酸序列的高表达位点中定点重组外源序列的组合物和方法。其中，所述靶核苷酸序列可以是人的基因组。本申请还提供了在染色体上含有高表达位点的宿主细胞。在所述宿主细胞中含有本申请提供的定点重组的组合物，或者在其染色体的高表达位点中定点重组了外源序列。
文档编号C12N5/10GK103215260SQ201310020358
公开日2013年7月24日 申请日期2013年1月18日 优先权日2012年1月20日
发明者凌建群, 凤阁 申请人:江苏吉锐生物技术有限公司