专利名称：与肾上腺脑白质营养不良症相关的基因突变及其检测试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及与肾上腺脑白质营养不良症相关的基因突变、检测该突变所使用的引物、探针、抗体和试剂盒。
背景技术：
肾上腺脑白质营养不良(adrenoleukodystrophy, ALD)是一种遗传性疾病，其特点是进行性弥漫性脑白质硬化，伴有肾上腺皮质功能减退。X染色体连锁性的ALD是最常见的一种类型，其临床表现具有高度异质性。ALD儿童患者仅见于男性，进行性神经性失能，10岁前发病，平均发病年龄7.2+/-1.7岁(2.75-10岁)，3岁前多数发育正常，无精神运动障碍。86%病例先出现神经系统症状，其中85%对ACTH兴奋显示皮质醇分泌不足，追问病史曾有不能解释的恶心、呕吐、脱水、无力、皮肤色素沉着等肾上腺皮质功能减退的表现，早期的神经精神症状表现为情绪不稳定，学习成绩不良，继而快速发展为顶颞叶功能障碍，语言辨别能力和实体觉丧失，体全觉差；1/3早期病例视觉丧失,约1/3有全身性和局限性癫痫，短期内成为植物人(1.9+/-2年)。青春期ALD，起病介于10-21岁，症状类似儿童ALD，但进展慢，表现类似AMN，常伴有性功能障碍。通常，该疾病的可靠诊断是培养纤维母细胞中显示极长链饱和脂肪酸(VLCFAS)浓度增高。产前诊断可作羊膜穿刺细胞培养，但VLCFAS检查技术上极其困难。CT扫描和MRI有较大价值，病变部位显示低密度，造影剂加强后低密度区邻近有花环状造影剂堆积。MRI较CT扫描更具有诊断价值。分子生物学研究表明，X连锁性ALD是由于位于X染色体长臂28区的AB⑶I基因发生突变。AB⑶I基因由10个外显子和9个内含子组成，编码区序列长度为2238个碱基(如SEQ ID N0.1所示)。AB⑶I基因编码的跨膜转运蛋白包括745个氨基酸(如SEQ IDN0.2所示)，该蛋白的作用是将长链脂肪酸转运至过氧化物酶体。当AB⑶I基因发生突变时，其编码的蛋白的一级序列可能发生改变，从而无法正常发挥作用，造成极长链饱和脂肪酸在脏器堆积，导致发病。目前国内外均有多个中心可对AB⑶I基因进行基因突变的检测，已发现400多种基因突变类型可导致X连锁隐性ALD，但大多数家系都具有同一种特殊的基因型。不同家系的表现型差异很大，这一特征与各种修饰基因或其它一些尚未了解清楚的因素有关。
发明内容
本发明的目的是提供一种导致肾上腺脑白质营养不良症的ABCDl基因的突变，并提供能够检测该突变的引物、探针、抗体、试剂盒等，从而为诊断肾上腺脑白质营养不良症提供一种新的方式。
本发明的第一个方面是提供一种AB⑶I基因突变体，其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。所述基因突变体是ABCDl基因的编码序列第657、658位的胞嘧啶缺失所形成的。发明人通过基因测序的方法对ALD病患进行检测，发现该病患的AB⑶I编码基因第657、658位胞嘧啶缺失，该位点位于ABCDl基因的第一外显子中。进一步分析其家庭成员的AB⑶I基因序列，病患父亲的AB⑶I基因正常，病患母亲的AB⑶I基因为杂合子，是该突变的携带者，但母亲没有发病。该突变是首次在中国ALD病患中发现，之前未见文献报导，为检测和判断ALD病患提供一种新的方式。本发明提供的基因突变体或包括缺失位点的基因突变体片段可以作为分子标记，在检测ABCDl编码基因是否存在突变时作为标准，供相关人员分析。在一种优选的实施方式中，所述包括缺失位点的ABCDl基因突变体片段包含SEQID N0.3中的至少10个连续核苷酸，并且所述至少10个连续核苷酸包含SEQ ID N0.3的第656、657、658位核苷酸。这样的基因突变体片段的长度可以是10-700个核苷酸，例如20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650 等任意长度。在一种优选的实施方式中，所述包括缺失位点的ABCDl基因突变体片段是上述片段的反向互补序列。由于本发明的ABCDl基因突变体缺失了两个胞嘧啶，导致其编码的氨基酸序列发生变化，无法翻译出能够行使正常功能的跨膜转运蛋白，从而导致发生ALD。因此，本发明的第二个方面是提供一种多肽，所述多肽具有如SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列，所述氨基酸序列由SEQ ID N0.3的核苷酸序列编码。将该基因突变体编码 的氨基酸序列(SEQ ID N0.4)与正常AB⑶I基因编码的氨基酸(SEQ ID N0.2)进行比对可见，由于本发明的基因突变体核苷酸序列中缺失对应于正常AB⑶I基因编码序列的第657、658位核苷酸，使得其编码的氨基酸序列(SEQ ID N0.4)从第220位起开始发生变化，并且第299位氨基酸由组氨酸变成终止密码子。该基因突变体所编码的蛋白质无法实施正常跨膜蛋白的转运功能。同样，本发明提供的多肽或多肽片段可以作为分子标记，用于在检测该跨膜蛋白是否存在突变时作为对照品。在一种优选的实施方式中，所述多肽片段包括SEQ ID N0.4的第220位至第298位中的至少10个连续氨基酸。所述多肽片段的长度可以是1(T298个氨基酸。在进一步优选的实施方式中，所述多肽片段是PGRG⑶FLHPASGGP (SEQ ID N0.11)。本发明的第三个方面是提供能够扩增出SEQ ID N0.3所示序列的第657、658位核苷酸的引物，利用所述引物通过测序的方法检测ABCDl基因的序列。设计引物的原则包括:(I)可以扩增出SEQ ID N0.3所示序列的第657、658位核苷酸(S卩，ABCDl基因编码序列的第657、658位核苷酸)；(2)在核酸序列的保守区内设计，同时需要具有特异性；(3)利用所述引物扩增出的产物不能形成二级结构；(4)引物长度一般在15 30个碱基；(5)G+C含量为40% 60% ； (6)引物与靶序列作用的Tm值以60°C左右最佳；(7)碱基要随机分布；(8)单向引物自身不能有连续4个碱基互补；(9)双向引物之间不能有连续4个碱基互补；(10)引物5'端可以修饰；(11)引物3'端不可修饰；(12)引物3'端要避开密码子的第3位。在一种优选的实施方式中，本发明提供的扩增引物是:上游引物:ABCD1-F:5，-CCACGCCTACCGCCTCTACTT-3，(SEQID N0.5)；下游引物:ABCD1-R:5’-AGACTGTCCCCACCGCTC-3’(SEQ ID N0.6)。
利用弓丨物扩增-测序方法检测ABCDl基因的步骤是本领域技术人员公知的。例如，采集待测样本的血液，提取DNA ; WDNA为模板，利用本发明提供的引物进行扩增；对得到的产物进行测序分析；将所得的序列与正常的ABCDl基因序列比较，判断待测样本中的ABCDl基因是否存在第657、658位核苷酸缺失。本发明的第四个方面是提供能够检测SEQ ID勵.3所示序列的第657、658位核苷酸(即，ABCD1基因编码序列第657、658位核苷酸)的探针。本领域技术人员已知，通过杂交的方法，利用探针是否能够与待测序列(如基因或基因片段或扩增产物)结合来检测待测序列是否存在变异。本领域中已知有多种利用探针检测序列的方法。在已知检测位点是ABCDl基因编码序列第657、658位核苷酸缺失的情况下，本领域技术人员能够充分了解如何设计探针。在一种实施方式中，本发明的探针是Taqman探针，该探针的设计原则包括:(I)探针与扩增产物间有完全互补的序列；(2)探针位置尽可能靠近扩增引物(扩增产物50-150bp)上游，但不能与引物重叠；(3)探针序列不易形成二级结构；(3) Tm值高于引物(10°C)，退火温度Tm控制在68-70°C左右；(4)探针的5’端第一个碱基不能是鸟嘌呤(G);
(5)避免同一碱基重复过多，特别是连续4个或更多的G ； (6)检测SNP或突变时，区分位点尽量位于探针中央；(7) G-C含量控制在40-80%左右；(8)探针序列中含有比较多的碱基C0在一种优选的实施方式中，所述探针序列为:对照组:5’-AGCCACTCCTGGACGT-3’ (SEQ ID N0.7)；突变组:5’-AGCCACTTGGACGT-3，(SEQ ID N0.8)。在另一种实施方式中，所述探针为MLPA方法的探针，探针序列为:正向:5’-CTGACCAAGCCACT-3’ (SEQ ID N0.9)；反向:5’-GTCACAGCCACGTCCA-3’ (SEQ ID N0.10)。在另一种实施方式中，所述探针为基因芯片的探针，探针序列为:5，-AGCCACTTGGACGT-3，(SEQ ID N0.8)。本发明的第五个方面是提供抗本发明的多肽或多肽片段的抗体，特别是抗包含SEQ ID N0.4的第220位至第298位中的至少10个连续氨基酸的多肽片段的抗体。在一种优选的实施方式中，本发明的抗体是抗PGRG⑶FLHPASGGP多肽片段的抗体。利用本发明提供的抗体检测ALD的方式有:1)用抗正常AB⑶I蛋白的抗体检测，若在样本中未现阳性信号，则说明该样本不表达或表达的ABCDl蛋白有异常；2)用抗突变型ABCDl蛋白的抗体检测，若样本中出现阳性信号，则说明该样本发生异常；3)用抗正常ABCDl和突变型ABCDl蛋白的抗体同时检测，若在样本中两者都出现阳性信号，则样本为携带者；若只抗正常AB⑶I的抗体出现阳性信号，则为正常；反之，则为患者。具体的检测方法可选用ELISA法，试纸条法等。这些方法的过程和结果判断方式都是本领域技术人员已知的。本发明的第六个方面是提供能够检测SEQ ID N0.3所示序列的第657、658位核苷酸的试剂盒，所述试剂盒包括本发明的引物和/或探针，以及为进行PCR实验或杂交实验所必需的试剂。在另一种实施方式中，所述试剂盒能够检测SEQ ID N0.4的多肽，包括本发明的抗体以及为进行抗体抗原免疫反应实验所必需的试剂。所述PCR实验、杂交实验和抗体抗原免疫反应实验都是本领域的公知技术，本领域技术人员毫无疑义地知道做这些实验必需哪些试剂。因此，本发明的第七个方面是提供本发明的引物、探针或抗体在制备检测ABCDl基因突变体的试剂中的应用。本发明提供的核苷酸序列是ABCDl基因编码序列缺失了两个胞嘧啶，从而导致编码的蛋白从第220位开始发生氨基酸序列改变，且第299位的组氨酸变成终止密码子，形成无义突变。该突变导致编码的蛋白无法发挥跨膜转运的作用，使极长链饱和脂肪酸在脏器堆积，发生肾上腺脑白质营养不良病。因此，本发明提供的核苷酸序列、氨基酸序列、引物、探针、抗体、试剂盒等能够准确检测是否发生该突变，从而诊断待测个体是否患有肾上腺脑白质营养不良病或预测待测个体的患病风险。
图1是正常AB⑶I基因第652-665位核苷酸的测序峰图；图2是母亲AB⑶I基因(杂合子)的第652-665位核苷酸的测序峰图；图3是父亲AB⑶I基因(正常半合子)的第652-665位核苷酸的测序峰图；图4是病患AB⑶I基因(突变半合子)的第652-665位核苷酸的测序峰图；图5a和5b是母亲AB⑶I基因(杂合子)的两条染色体的第652-665位核苷酸测序峰图，图5a是突变半合子，图5b是正常半合子；图6是目标碱基扩增片段电泳图；图7是兔抗A肽、B肽和C肽的多克隆抗体的纯化结果图，其中M为分子标记；图8是抗体检测试纸条及检测结果图；图9是抗体芯片及检测结果图；图1Oa-1Oc是MLPA检测结果图；其中，图1Oa是正常人(父亲)的MLPA结果图，图1Ob是携带者(母亲)的MLPA结果图，图1Oc是患者(病患)的MLPA结果图；图11是基因芯片检测结果图。
具体实施例方式先结合具体实施例说明本发明。若无特别说明，实施例中使用的试剂和仪器均为市售产品。一些具体的试剂和仪器如下所示:试剂:DNA 提取试剂盒(Tiangen，DP304_02);感受态细胞(Takara，DH5 a , D9057A)；pGEM T 载体(Takara, D101A);引物(Invitrogen 合成)；dNTP (Fermentas, EP0192) ;Taq 酶(Fermentas, EP0402);琼脂糖(Klontech);氨节青霉素(Klontech) ;T4 连接酶(TaKaRa)；DNA纯化试剂盒(Tiangen，DP214-03);质粒提取试剂盒(Tiangen，DP103-03);胰化蛋白胨(0X0ID, LP0042);酵母提取物(0X0ID，LP0021)。仪器: 生物安全柜(BioBase);水浴锅(上海精宏实验设备有限公司，DS-S24)；NanoDrop 紫外分光光度计(Thermo, ND2000) ;PCR 仪(ABI9700);测序仪(ABI3500);摇床(Thermo, MAXQ4000) ；NaCl (国药，10019318)。培养基:LB培养基:胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCllOg，调pH至7.0后，用去离子水定容到IOOOml。LB培养平板:胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCllOgJl^ 15g,调pH至7.0后,用去离子水定容至Ij IOOOml0以下实施例中受试的个体是病患及其父母双亲。平行地对三个受试个体进行检测分析。实施例1:取血利用真空采血针从待测个体的静脉取血，并立即将真空采血针的另一端插入EDTA抗凝的采血管中，收集血样。将采血管上下轻轻颠倒混匀5-10次，切勿用力振摇，用于下一步检测。实施例2:提取DNAI)将血样加入至标本管中，用振荡器振荡，振荡速率为1800/min下点三次，使全血混匀。2)向离心管中加入20iiL蛋白酶K、200iiL血样、200iiL缓冲液GB，盖紧盖子，振荡速率为2200/min，充分混匀；70°C水浴lOmin，自然冷却至室温；简短离心(达到5 X IOOOrpm)去除管盖内壁的水珠。3)加入200 ii L无水乙醇，充分振荡，振荡速率为2500_3000/min，点三下，简短离
心去除管盖内壁上水珠。4)将溶液加入到对应的一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中，吸附柱柱盖上标注流水号)，8000rpm离心60s，将吸附柱CB3放入新收集管中，弃废液及原收集管。5)向吸附柱中加入500 u L缓冲液⑶(使用前检查是否已加入无水乙醇)，8000rpm离心60s，将吸附柱CB3放入新收集管中，弃废液及原收集管。6)向吸附柱中加入600 ii L漂洗液PW(使用前检查时候已加入无水乙醇)，12000rpm离心3min，将吸附柱CB3放入去盖的离心管中，弃废液及原收集管，吸附柱开盖并置于室温下5-10分钟，晾干残余的漂洗液。7)向吸附柱中间位置悬空滴加200 ii L洗脱缓冲液TE，盖上盖。室温放置2_5min，IOOOOrpm离心60s，将溶液收集到离心管中。8)测定DNA浓度，同时记录0D26(l/0D28(l的比值。实施例3 =PCR扩增反应利用提取的DNA作为模板，扩增包含AB⑶I基因的编码序列第657、658位核苷酸的片段。反应物及试剂:
PCR Master Mix2 (自制，含 Mg2+、Taq 酶、dNTP 等)|20y L
权利要求
1.一种AB⑶I基因突变体，其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
2.—种AB⑶I基因突变体片段，包含SEQ ID N0.3中的至少10个连续核苷酸，并且所述至少10个连续核苷酸包含SEQ ID N0.3的第656、657、658位核苷酸；或者是其反向互补序列。
3.根据权利2所述的基因突变体片段，其特征在于，所述基因突变体片段用作检测SEQ ID N0.3的第657、658位核苷酸的探针；优选地，所述基因突变体片段是5， -AGCCACTTGGACGT-3，。
4.用于扩增SEQID N0.3所示序列的第657、658位核苷酸的引物；优选地，所述引物是: 上游引物:ABCD1-F:5’ -CCACGCCTACCGCCTCTACTT-3’ ； 下游引物:ABCD1-R:5，-AGACTGTCCCCACCGCTC-3，。
5.一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。
6.一种多肽片段，包括SEQ ID N0.4的第220位至第298位中的至少10个连续氨基酸；优选地，所述多肽片段的氨基酸序列是PGRGCDFLHPASGGP。
7.一种抗权利要求5所述的多肽或权利要求6所述的多肽片段的抗体。
8.一种试剂盒，包括检测SEQ ID N0.3所示序列的第657、658位核苷酸或检测SEQ IDN0.4的多肽的试剂，其中，检测SEQ ID N0.3所示序列的第657、658位核苷酸的试剂包括权利要求3所述的基因突变体片段或权利要求4所述的引物，检测SEQ ID N0.4的多肽的试剂包括权利要求7所述的抗体。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述检测SEQID N0.3的第657、658位核苷酸的试剂是探针，所述探针序列为: 对照组:5’ -AGCCACTCCTGGACGT-3’ ； 突变组:5’ -AGCCACTTGGACGT-3’ ；或者 正向:5，-CTGACCAAGCCACT-3’ ；反向:5’ -GTCACAGCCACGTCCA-3，。
10.权利要求3的基因突变体片段、权利要求4所述的引物或权利要求7所述的抗体在制备检测ABCDl基因突变体的试剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种与肾上腺脑白质营养不良症相关的基因突变、检测该突变所使用的引物、探针、抗体和试剂盒。本发明为检测肾上腺脑白质营养不良症提供了一种新的方式。
文档编号C12N15/12GK103146707SQ20131004971
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月7日 优先权日2013年2月7日
发明者陈子江, 高媛, 高选, 黄色新, 曹永芝, 王谢桐 申请人:国家辅助生殖与优生工程技术研究中心