专利名称：一株能促进木麻黄根系生长的曲霉菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株能促进木麻黄根系生长的曲霉菌株。
背景技术：
植物内生菌的研究始于19世纪末,Vogl从黑麦草Lolium temulentum L.种子中分离出第一株内生菌[1]。但真正开始大量研究植株中的内生菌起始于上世纪八十年代，主要是在温带地区、亚热带地区和热带地区的植被中开展研究。前人从大部分植物中都能分离出内生菌，因此可以推测内生菌在植株中是普遍存在的。在全世界范围内至少在80多个属290多种的禾本科农作物中发现了内生菌[2]。目前从植物中分离的内生菌根据其具有的独特功能可以分为:固氮菌、固钾菌、固磷菌等植物促生菌[3~4]、具有抗病虫害的生防菌[5~8]和具有促进植物对不良环境的修复能力的抗性菌。木麻黄科植物是兼有Frankia菌、内生菌根菌和外生菌根菌的共生营养型植物，因此，关于木麻黄真菌学方面的研究方向目前较多涉及弗兰克氏菌、丛枝状菌根(简称AM菌根)、青枯菌、青枯假单胞杆菌等，虽然木麻黄人工接种菌根菌后的促生效果已毋庸置疑，但是仅停滞于根瘤菌根菌的研究，木麻黄内生真菌方面的研究尚未见报道前人的研究中应用菌株，多为外生真菌，同时也没有从促进根系生长的根本因素去寻找内生真菌，提高其科学性和可靠性[11]。证实能促进根系生长的内生菌方面尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一株能促进木麻黄根系生长的曲霉菌株。本发明提供的一株能促进木麻黄根系生长的曲霉菌株，为曲霉
sp.)木麻黄根际真菌63，已于2012年6月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC N0.6311。该菌的分离、纯化包括:
A、材料:将采集得到不同年份的根、枝条、鳞状叶小枝分成三个部分，用自来水清洗干净，分装到自封袋内，于4°C冰箱保存；
B、消毒:70%酒精浸泡30s——无菌水浸洗一次——10%次氯酸钠浸泡7min——无菌水浸洗一次。当样品最后一次浸洗后的水盛于灭菌的小烧杯中，在平板上划线作为对照，以检验样品的消毒是否彻底，若干天后如有菌落生成，则表明样品表面消毒不彻底，需继续调整消毒方法[12,]；
C、接种部位的选择:鳞状叶小枝:分取植株的上、中、下三个部分的鳞状叶小枝，每个鳞状叶小枝又分为枝尖部、枝中部和枝基部3个处理；枝条:上中下分为3部位，其中第3部位为枝莖交接处；根部:分为根尖和根基2个部分；
D、接种:将消毒后的外植体用接种刀切开，铺放在培养基表面，于28°C恒温培养箱内培养5— 7天后观察菌落生长状况。有的菌株繁殖迅速，可先将其产生的菌株进行分离纯化；生长缓慢且数量较少的菌株可延长观察时间，直到其生长稳定后纯化。
固体培养:使用改良马丁固体培养基，配方为蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、琼脂14.0g/L、其它为无菌水，pH值
6.4±0.2，培养温度为28°C，培养方式为平板培养，培养时间为48h ；
E、将分离繁殖出的不同种类的内生真菌接入平板培养基进行纯化，经过2-3次点接纯化、转接后得到单一菌种的上述的Aspergillus sp.功能菌株；
其在平面培养基上，菌落为圆形白色短绒毛，最外层呈水润透明状；背部为乳白色，生长速度极慢。分生孢子梗直立，简单，顶端球形，顶部着生小梗；分生孢子(梗孢子)单孢，球形；参照真菌鉴定手册将其鉴定为曲霉属(Aspergillus sp.),保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.6311。上述的一种能促进木麻黄根系生长的曲霉菌株应用菌液的制备方法，是将上述的菌株接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为28°C，培养时间48 72h，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成1.0-9.0X 106Cfu/ml即为成品备用；液体培养基:为改良马丁培养基，其中蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH值6.4±0.2。上述的一种能促 进木麻黄根系生长的曲霉菌株应用菌液的应用方法，是应用该菌株的菌液，苗木栽植前期蘸根和用于林地浇根。上述的一种能促进木麻黄根系生长的曲霉菌株应用菌液的应用方法，是用9.0X105cfu/ml菌液，按每株IOOml在林地浇于每株木麻黄的根际。上述的一种能促进木麻黄根系生长的曲霉菌株应用菌液的应用方法，是应用该菌株的菌液5.0X 105Cfu/ml在水培苗栽植前将苗蘸根lOmin。本发明涉及的菌株是从木麻黄植株中分离纯化得到的，目标菌株为曲霉(Aspergillus sp.)木麻黄根际真菌63,已于2012年6月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏编号为CGMCC N0.6311。将木麻黄根际真菌63接种于木麻黄水培苗，根据根系生长的各项指标综合评判，进一步证实其对根系生长具有促进作用，寻找到对促进根系生长有益的功能内生真菌可应用于生产。菌株63号处理植株较对照苗木根系总表面积增加了 71.97%，根系总长增加了47.90%, ( 0.25mm径级下较对照增加37.98%, 0.25 0.5mm径级下较对照显著增加59.59%，0.5^0.75 mm>0.75^1 mm和彡I mm根系径级下,菌株63号苗木的根长均显著高于对照苗木。因此，菌株63号处理下的木麻黄苗木较对照CK所有径级下的根长增幅达到最大。表明其对于促进植株的根系生长具有极显著效果。
具体实施例方式1、水培繁殖中的应用
取配制好的上述内生真菌应用菌液，制成5.0X 105Cfu/ml菌液，在水培苗栽植前蘸根IOmin0可提高植苗成活率10%以上。2、根际土壤浇施应用
试验材料为惠安一号水培苗，苗木于2011年7月盆栽于福建农林大学森林生态研究所田间试验地。水培苗根系长齐后，将其移入黄心壤土和沙以3:1的比例混合的土壤，并分装于约500个直径22cm，高15cm的花盆中。每盆放入相等质量的3.36KG混合土壤，为了保证后期苗木接菌的准确性，往每盆土壤中滴入1(T15滴甲醛(福尔马林)消毒液，并用塑料薄膜封盖盆口，消毒时间为24h。待土壤内甲醛渗透消毒完全，除去塑料薄膜，将剩余的甲醛蒸发，以免影响幼苗的移植成活率。经过一个月的恢复性生长，在木麻黄根际施入菌株浓度为9.0X 105cfu/ml的菌液100ml，重复3次，用蒸馏水溶液处理作为空白对照。菌液的制备:将木麻黄根际真菌63 (菌株63)接入液体培养基，培养基为改良马丁培养基，每L含蛋白胨5.0g、酵母浸出粉2.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾1.0g、硫酸镁0.5g，其它为无菌水，pH值6.4±0.2。经过24h的培养，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成1.0X 106cfu/ml至9.0X 106cfu/ml备用。接种后30天后进行根系生长等指标的测定，检测方法和结果如下:
2.1菌株烧施后木麻根系生长参数分析
为了研究内生真菌接种对木麻黄苗木根系的效应，试验将栽有木麻黄苗木的花盆倾倒，取出带有土壤和沙砾的整株苗木，用清水反复冲洗后晾干，剪下地下部分，分别装入信封袋中备用，分S和P接菌方式下的15株菌株处理，每个处理采3株苗木。应用爱普生(10000XL，Epson Inc.,北京)根系扫描仪，将完整的根系图像扫描存入计算机，应用(WinRHIZ0 2009)专业根系形态和结构分析系统软件(Regent Instruments Canada Inc.)对根系总表面积、根系总长以及根系径级(根系平均直径分级)进行定量分析15]，取3个重复值的平均值作为该处理苗木的根系特征值。同一接菌方式下，接菌苗木和未接菌苗木之间的比较采用ANOVA分析,不同菌株处理之间采用Duncan多重比较,并用字母标记法表示。结果分析
3.1不同处理对苗木根系总表面积的影响
根系表面积的大小影响着植株根系与土壤间营养物质的交换，其与植物水分吸收能力紧密联系，能够大致反映苗木对土壤环境的利用现状，若根系表面积越大，则根系分布就越广，植物能更好地吸收利用土壤中的养分，同时，根系的大小和深浅也决定着植物根系的发达程度，与植物的抗风性能、耐旱性和生活力密切相关，特别对沿海或水土保持防风固沙植
物也有重要的影响[16_19]。通过单因素方差分析和邓肯多重比较，不同菌株处理间的根系总表面积有着显著的差异(S:sig=0.000 ；P:sig=0.000)，不同处理的根系总面积，菌株63号与对照处理相比达到显著差异，较对照苗木根系总表面积增加了 71.97%。不同处理对苗木根系总长的影响
植株根系的总长度同样作为描述根系特征的重要参数，其值的大小还决定着根系表面积的大小和根系遍布的深浅。单因素方差分析表明，不同接菌方式各菌株处理间的根系总长均有显著差异(S:sig=0.000 ；P:sig=0.000)，菌株63号与对照达到显著差异，较对照苗木根系总长增加了47.90%o\.不同处理对苗木根系径级的影响
试验通过WinRHIZO根系分析软件按直径分级(最小分辨单位0.01mm)对每株植物的根系进行细致统计，由于本试验中，木麻黄幼苗均为无性系水培苗木，其根系均为直径< 2mm的细根，因此将木麻黄水培幼苗的根系划分为五个径级区间 .( 0.25,0.25、.5、
0.5 0.75,0.75 1、≥ 1(单位:mm)。众所周知，木麻黄生长在年降水量充沛的亚热带等地区，树种本身具有一定的抗错性，Osundina研究发现,在淹水情况下，木麻黄能够通过增加暴露于水面之上的不定根数量，从而缓解木麻黄水涝时根系的缺氧状况，因此，植物的根系，特别是直径< 2mm的细根对所处土壤环境资源的状况有着敏感的响应[2°_22];通过植株根系总表面积和根系总长的大小可以直观地反映植物地下部分的生物量状况和所消耗的光合产物的多少，为了进一步研究接种内生真菌对木麻黄幼苗细根构型以及功能特征的影响，本试验通过根系分析软件统计了不同径级下各接菌处理苗木较对照的增长情况，以初步寻找接菌与苗木根系各径级产量变化的规律。不同接菌方式不同菌株处理下苗木根系不同径级的特征值。由表I的数据可以看出，菌种63处理下，(0.25mm径级下，菌株63号处理苗木的根长增幅最大，较对照增加37.98% ；0.25、.5mm径级下，菌株63号处理苗木的根长较对照显著增加59.59% ;0.5、.75 mm、0.75 I mm和>1 mm根系径级下。因此，63号处理下的木麻黄苗木较对照CK所有径级下的根长增幅达到最大。表I不同处理对木麻黄苗木根系各径级根系长度的影响
权利要求
1.一株能促进木麻黄根系生长的曲霉菌株，为曲霉577.)木麻黄根际真菌63，已于2012年6月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC N0.6311。
2.一种如权利要求1所述的功能内生真菌的应用菌液，其特征在于:所述应用菌液的制备方法，是将所述的曲霉{Aspergillus sp.)木麻黄根际真菌63接入液体培养基,摇床振荡培养，培养温度为28°C，培养时间48 72h，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成1.0-9.0X106Cfu/ml，备用；液体培养基:为改良马丁培养基，其中蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH 值 6.4±0.2。
3.—种如权利要求2所述的应用菌液的用途，其特征在于:所述应用菌液用于林地浇根或苗木栽植前期蘸根。 ·
全文摘要
本发明涉及一株能促进木麻黄根系生长的曲霉菌株，为曲霉(Aspergillus sp.)木麻黄根际真菌63，已于2012年6月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.6311。将木麻黄根际真菌63接种于木麻黄水培苗，根据根系生长的各项指标综合评判，进一步证实其对根系生长具有促进作用，寻找到对促进根系生长有益的功能内生真菌可应用于生产。
文档编号C12R1/66GK103194396SQ20131006875
公开日2013年7月10日 申请日期2013年3月5日 优先权日2013年3月5日
发明者林燕青, 洪伟, 吴承祯, 谢安强 申请人:福建农林大学