专利名称：一种多头带绦虫抗原基因及其重组蛋白与用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种寄生虫的基因，确切讲是一种多头带绦虫抗原基因，以及其重组蛋白与用途。
背景技术：
脑多头蝴病(Cerebral coenurosis)俗称脑包虫病，又称眩倒病或蹒跚病(gidor sturdy),是多头带绦虫STaenia mu I ticeps)的中绦期幼虫脑多头蝴iGjemiruscerebral is )寄生于绵羊和山羊等有蹄类反刍动物的脑内引起的一种严重致死性的寄生虫病，人也可作为中间宿主感染。其成虫寄生于犬科肉食兽的小肠。脑多头蝴病的致死率可达100%，给畜牧业生产造成了巨大的经济损失。该病呈全球性分布，是一种重要的人畜共患寄生虫病(参见 Sharma DK and Chauhan PPS.Coenurosis status in Afro-Asian region:a review [J].Small Rumin Res, 2006, 64:197-202.另参见 Scala A and VarcasiaA.Updates on morphobiology, epidemiology and molecular characterization ofcoenurosis in sheep [J].Parassitologia, 2006，48 (1-2):61-63.)。目前，脑多头蝴病的诊断及治疗仍面临技术挑战(参见Scott PR.Diagnosis and treatment of coenurosisin sheep [J].Vet Parasitol, 2012, 189 (I):75-78.)。目前已研制成功的的带科绦虫重组疫苗，包括羊带绦虫、牛带绦虫、猪带绦虫、细粒棘球绦虫等。众所周知，这些疫苗抗原都来自于六钩蝴蛋白45W、16K、18K、Eg95中的一种或多种簇族，而且这些蛋白在不同的绦虫种间具有一定的相似性(Lightowlers MW, Cestode vaccines: origins, current statusand future prospects [J].Parasitology, 2006，133: 27-42.)。尽管这些宿主保护性抗原间的DNA或蛋白序列间仅仅有很低的同源性，但它们的氨基酸序列都有一些共同的特性:一是都具有预测的信号肽序列，二是都具有一个或两个拷贝的保守型的基序(参见Lightowlers MWj Flisser A, Gauci CGj et al.Vaccination against cysticercosisand hydatid disease [J].Parasitol Today, 2000，16: 191-196.)，把这个基序定义为纤维结合蛋白区域 III (Fn III) `(Bork P，Doolittle RF.Fibronectin type IIImodules in the receptorphosphatase CD45 and tapeworm antigens[J].Protein Scij1993，2:1185 -1187.)0上世纪八十年代，已经有脑多头蚴病的免疫预防的报道，免疫抗原常釆用多头带绦虫六钩蝴体外培养物或虫体粗抗原(参见Edwards GT and Herbert IV.Preliminaryinvestigations into the immunization of lambs against infection with Taeniamu I ticeps metacestodes [J].Vet Parasitol, 1982，9 (3-4): 193-199.另参见 VersterA, Tustin RC.Preliminary report on the stimulation of immunity to the larvalstage of Taenia mu I ticeps [J].JS Afr Vet Assoc, 1982，53(3): 175-176.另参见 Verster A and Tustin RC.1mmunization of sheep against the larval stage ofTaenia mu I ticeps [J\.0nderstepoort J Vet Res, 1987，54 (2): 103-105.另参见张文宝，哈江，蔡宏，等.另参见多头带绦虫六钩蚴代谢物对绵羊脑包虫病的免疫效果观察[J].中国兽医科技，1991,21 (12): 35-36.另参见窦兰清，付宝权，柴忠威，等.多头带绦虫抗原特性的研究一囊液和囊壁粗抗原的免疫原性[J].中国兽医技，1996,26(12):5-7.另参见窦兰清，付宝权，柴忠威，等.另参见多头带绦虫抗原特性的研究一原头节及其排泄分泌抗原的免疫原性[J].中国兽医科技，1997，27(8):9-11.)。近年，多头带绦虫Tml6和Tml8重组疫苗绵羊攻虫试验也显示了它们的有效性(参见Gauci C，Vural G, Oncel T, etal.Vaccination with recombinant oncosphere antigens reduces the susceptibilityof sheep to infection with Taenia mu I ticeps [J].1nt J Parasitol, 2008, 38(8-9): 1041-1050.另参见 Varcasia A, Tosciri G, Coccone GN, et al.Preliminaryfield trial of a vaccine against coenurosis caused by Taenia multiceps [J].Vet Parasitol, 2009, 162(3-4):285-289.)D通过构建cDNA文库从中筛选基因是获取抗原性基因行之有效的手段，国外学者从羊带绦虫六钩蝴cDNA文库中筛选到保护性抗原基因45W,成功地研制了羊囊尾蝴基因重组疫苗(Johnson KS, Harrison GB, LightowlersMW, et al.Vaccination against ovine cysticercosis using a defined recombinantantigen [J].Nature，1989，338，585-587.)。近年来国内学者成功构建了猪带绦虫、亚洲带绦虫cDNA质粒文库并进行了 EST测序分析，获得了成虫表达基因数据(黄江,胡旭初，包怀恩，等.亚洲带绦虫成虫全长cDNA质粒文库的构建及EST测序[J].热带医学杂志，2007,7(2):116-118.另参见黄江，胡旭初，徐劲，等.猪带绦虫成虫cDNA质粒文库的构建及EST测序[J],中国人兽共患病学报，2008，24 (12):1126-1128.)。
发明内容
本发明提供一种多头带绦虫抗原性基因，以及这一基因所编码蛋白的制备方法和可能的用途。本发明的一种多头带绦虫绵羊脑多头蝴抗原基因为Tm82，其氨基酸序列为SEQ Na I，其核苷酸序列为SEQ Na 2.本发明的多头带绦虫绵羊脑多头蝴抗原基因Tm82是对脑多头蝴cDNA文库的EST(Expression sequence Tag,表达序列标签)进行测序分析,发现标号为Tm82的基因序列与多头带绦虫已知抗原性基因Tml6编码的蛋白具有相似性，然后通过去除载体序列及polyA尾巴，得到具有完整ORF编码框的Tm82序列。本发明的Tm82重 组基因的制备方法是以以脑多头蝴cDNA表达文库为模板，用SEQ Na 3和SEQ Na 4为引物进行PCR扩增后进行纯化处理，再将经纯化处理后的产物与PGEX-4T-1质粒分别用I ,Xho I进行双酶切，回收产物以T4 DNA连接酶连接，转化DH5a感受态细胞，获得重组表达质粒pGEX-Tm82，再转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，挑取单个菌落接种于含有氨苄青霉素(100 μ g/mL)的LB液体培养基培养，收集菌体进行SDS-PAGE将大量增菌诱导表达的菌体离心富集细菌培养物沉淀，用pH7.4 PBS缓冲液悬浮，反复冻融3次后超声裂解表达菌，分别收集裂解液的上清及沉淀，用SDS-PAGE分析重组蛋白的表达形式后用GST琼脂糖树脂纯化，得目标蛋白。本发明的多头带绦虫抗原基因Tm82可用于制备脑多头蝴的免疫疫苗。相关的实验表明，本发明的基因为多头带绦虫的抗原性基因。用本发明的Tm82重组蛋白受试羊只进行免疫后，可对羊脑多头蝴病感染产生一定的保护作用。
图1是实施例一 Tm82基因所编码蛋白的跨膜区预测结果
ProtScale分析蛋白亲疏水性分析(窗口大小默认值为9)时，结果表明该蛋白质存在2个高分值(Scare>l.5，当Scare>0时表示疏水性)分别分布在5 15，85 95域；而低分值(Scare < O)表示亲水性峰则位于20、40、50、70、100、130氨基酸位点附近，表明该蛋白总体亲水性较高，ProtScale图形输出见图1。图2是Tm82基因所编码蛋白序列的信号肽预测
SignalP分析表明Tm82蛋白第I位到第17位氨基酸残基的信号肽分值为0.762 (域值为0.450)，说明该蛋白含有信号肽序列，见图2。图3是Tm82蛋白结构域预测及与其它已知绦虫保护性抗原的结构域比对 SMART分析可以看出，Tm82蛋白与Tml6蛋白的结构域最为相似，见图3。图4至图6是实施例中Tm82基因在不同发育时期的转录情况核酸电泳图，其中: 图4是提取的总RNA。图中M: DL2000 DNA Marker ;1:成虫；2:脑多头蝴；3:六钩
蝴；
图5是Tm82基因的RT-PCR电泳图。图中M: DL2000 DNA Marker ;1:成虫；2:脑多头蝴；3:六钩蝴；4:阴性对照；
图6是actin基因的RT-PCR电泳图。图中M: DL2000 DNA Marker ; 1:成虫；2:脑多头蝴；3:六钩蝴；4:阴性对照。图7是实施例三去除信号肽序列后Tm82基因序列的PCR扩增电泳图 图中M: DNA分子质量标准；1: Tm82基因PCR ; 2:阴性对照。图8是实施例三Tm82重组蛋白的表达
图中M:蛋白质标准分子量标准，1:空载体菌诱导前；2 3:空载体菌诱导后；4:空载体菌表达纯化后；5: Tm82重组菌诱导前；6 7: Tm82重组菌诱导后；8: Tm82重组菌表达纯化后。
具体实施例方式本发明以下结合实施例作进一步详述。一、Tm82基因序列分析 1.Tm82基因编码蛋白的大小
Tm82基因组成的长度为402 bp开放阅读框，共编码133个氨基酸，其氨基酸序列见SEQ Na 1，碱基序列见SEQ Na 2。2.Tm82蛋白理化性质分析
应用ProtParam分析，Tm82基因编码133个氨基酸残基组成的多肽的理论分子质量为14834.3 ku，理论等电点为9.37，原子组成是C67tlHltl79N183O186S5。该蛋白由19种氨基酸组成，其中Ala最为丰富，Cys和Gln含量最少。负电荷残基(Asp，Glu) 16个，正电荷残基(Arg，Lys) 20个。不稳定系数(instability index)为40.69 (大于40为不稳定),表明该蛋白状态不稳定。ProtScale分析蛋白亲疏水性分析(窗口大小默认值为9)时，结果表明该蛋白质存在2个高分值(Scare>l.5，当ScareX)时表示疏水性)分别分布在5 15，85 95域；而低分值(Scare < O)表示亲水性峰则位于20、40、50、70、100、130氨基酸位点附近，表明该蛋白总体亲水性较高。
3.跨膜区及信号肽预测
TMHMM预测Tm82不产生跨膜螺旋。SignalP分析表明Tm82蛋白第I位到第17位氨基酸残基的信号肽分值为0.762 (域值为0.450)，说明该蛋白含有信号肽序列。4.Tm82结构域的预测及与其它已知绦虫保护性抗原的比对
从SMART分析图可以看出，Tm82蛋白与Tml6蛋白的结构域最为相似。SMART分析Tm82蛋白与其它已知带科绦虫宿主保护性抗原均含有纤维结合蛋白III型结构域(fibronectin type III domain, Fn III ),且大多数也都含有信号肽序列,详见表1:
表I Tm82蛋白结构域与其它已知绦虫保护性抗原的结构域比对
权利要求
1.一种多头带绦虫绵羊脑多头蝴抗原基因Tm82，其特征在于Tm82氨基酸序列为SEQNa I。
2.权利要求1所述的多头带绦虫绵羊脑多头蝴抗原基因Tm82的制备方法，其特征是以脑多头蝴cDNA表达文库为模板，用SEQ Na 3和SEQ Na 4为引物进行PCR扩增后进行纯化处理，再将经纯化处理后的产物与PGEX-4T-1质粒分别用I ,Xho I进行双酶切，回收产物以T4 DNA连接酶连接，转化DH5 α感受态细胞，获得重组表达质粒pGEX_Tm82，再转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，挑取单个菌落接种于含有氨苄青霉素(100 μ g/mL)的LB液体培养基培养，收集菌体进行SDS-PAGE将大量增菌诱导表达的菌体离心富集细菌培养物沉淀，用PH7.4 PBS缓冲液悬浮，反复冻融3次后超声裂解表达菌，分别收集裂解液的上清及沉淀，用SDS-PAGE分析重组蛋白的表达形式后用GST琼脂糖树脂纯化，得目标蛋白。
3.权利要求1所述的 多头带绦虫抗原基因Tm82用于制备脑多头蝴的免疫疫苗。
全文摘要
本发明公开一种多头带绦虫抗原基因及其重组蛋白与用途。本发明的一种多头带绦虫绵羊脑多头蚴抗原基因是氨基酸序列为SEQ№1的Tm82。本发明的多头带绦虫抗原基因Tm82可用于制备脑多头蚴的免疫疫苗。
文档编号C12N15/70GK103184225SQ20131007626
公开日2013年7月3日 申请日期2013年3月11日 优先权日2013年3月11日
发明者李文卉, 付宝权, 曲自刚, 盖文燕, 谢志宙, 刘静宜 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所