专利名称：一种大白菜ssr指纹图谱构建方法
技术领域：
本发明涉及一种大白菜SSR指纹图谱构建方法，属于农业的大白菜育种与应用技术领域。
背景技术：
大白菜(B.campestris L.ssp.Pekinensis (Lour).0lsson,染色体组 AA，2n=2x=20)起源于中国，是最具中国特色、分布最广、种植面积最大的重要蔬菜作物。大白菜在中国的种植面积约占蔬菜播种面积的9% 15%，并且先后传入日本、韩国、朝鲜等国家。由于大白菜在中国及东亚国家的蔬菜生产和消费中占有举足轻重的地位，因此对商用种子品种的鉴别尤为重要。目前我国对大白菜品种进行鉴定主要方法是按照GB/T 19557.5-2004《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南大白菜》进行田间测定来鉴定的。这种方法存在的主要问题是运用田间 测定，鉴定结果易受环境因素的影响，也常出现不同测试人员对某些性状的认识存在偏差，导致代码判定结果不一致的问题。同时田间测定周期长，不能及时、快捷地为新品种侵权案件提供鉴定依据。测试性状多、工作量大，无法适用大量品种的测试需求。利用分子标记技术建立DNA指纹图谱(fingerprint)是鉴别品种、品系的有力工具。品种DNA指纹数据库的构建在白菜品种纯度及真实性鉴定、品种权登记保护、区试及审定品种质量监控等方面具有重要应用价值，对理清我国白菜种质的亲缘关系、杂种优势群划分、种质创新及新品种选育具有重要指导意义。目前用于绘制植物DNA指纹图谱的标记技术主要有 RAPD、RFLP、AFLP、SSR 等。简单重复序列(Simple sequence repeat, SSR)也叫微卫星(Microsatellites),是第二代基于PCR技术的分子标记技术。与其它分子标记相比，SSR标记具有多态信息含量高、共显性遗传、技术简单、重复性好、特异性强等特点，已被广泛应用于植物遗传研究和育种实践中。目前，SSR标记也已经应用于大白菜、水稻、小麦、大麦、玉米等作物的指纹图谱构建、品种鉴定和遗传多样性分析。
发明内容
本发明的目的在于:针对目前大白菜品种的鉴定只能在大田里进行，易受环境影响且工作量大等一系列问题，提供一种大白菜SSR指纹图谱构建方法，利用SSR指纹图谱进打品种鉴定。本发明的目的是这样实现的:一种大白菜SSR指纹图谱构建方法，包括提取供试品种DNA、用荧光标记SSR引物进行PCR扩增，电泳检测和指纹图谱构建，其特征在于:所述的荧光标记SSR引物包括29对核心SSR引物，分别是cnu_ml39a、nia_m086a、nia_m098a、nia_ml38a、cnu_m046a、nia_ml21a、cnu_m073a、cnu_m288a、cnu_m316a、cnu_m327a、nia_mlOla、cnu_m252a、Nal0_D09、cnu_m289a、cnu_m442a、cnu_m050a、cnu_ml49a、nia_m037a、nia_m049a、cnu_ml82a、cnu_m295a、cnu_m090a、cnu_m016a、cnu_m530a、cnu_m534a、nia_m038a、nia_m022a、ENA2、nia_m035a，其核苷酸序列依次如序列表SEQ ID N0.1 58所示。具体步骤如下:( I)提取供试品种的DNA ；(2 )用29对核心SSR引物分别对供试品种DNA进行PCR扩增。PCR扩增采用25“1^的反应体积，含(1见13 0.25mmol/L，正向引物、反向引物各0.4ymol/L，Taq DNA聚合酶1.0单位，I XPCR缓冲液(不含Mg2+)，MgCl2L 5mmol/L，样品DNA 10_40ng。反应程序采用 TouchdownPCR:94°C预变性 4min ;94°C变性 45s，65°C退火 45s，72°C延伸 45s，每循环降1°C，共15个循环；94°C变性45s，50°C退火30s，72°C延伸45s，共30个循环；72°C延伸10min，4°C 保存。(3) PCR产物经电泳检测构建大白菜品种的SSR指纹图谱。a.变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物，60W恒功率电泳1.5h，银染显色；以pBR322DNA/MspI为DNA分子量标准，将每一位点待测样品和相应的参照品种扩增片段的带型和移动位置进行比较，根据参照品种的移动位置和扩增片段大小，确定待测样品该位点的等位变异大小，纯合位点的等位变异记录为X/X，杂合位点的等位变异记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异片段大小，小片段在前，大片段在后；无效等位变异记录为0/0 ;多个位点的数据整合在一起形成不同大白菜品种的SSR指纹图谱。b.五色荧光毛细管电泳检测将6-FAM (蓝色)和HEX (绿色)荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，TAMRA(黑色)和ROX (红色)荧光标记的PCR产物稀释10倍；分别取等体积的上述4种稀释后溶液混合形成混合液^lyL混合液加入0.1 μ L LIZ500分子量内标和8.9 μ L去离子甲酰胺加入到DNA分析仪专用深孔板孔中；然后将其在PCR仪上95°C变性5min，取出，立即置于碎冰上,冷却IOmin以上；瞬时离心IOs后置放到DNA分析仪上进行毛细管电泳检测,用GENEMAPPER进行图像分析和数据采集；以pBR322DNA/MspI为DNA分子量标准，将每一位点待测样品和相应的参照品种扩增片段的带型和移动位置进行比较，根据参照品种的移动位置和扩增片段大小，确定待测样品该位点的等位变异大小，纯合位点的等位变异记录为X/X，杂合位点的等位变异记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异片段大小，小片段在前，大片段在后；无效等位变异记录为0/0 ;多个位点的数据整合在一起形成不同大白菜品种的SSR指纹图谱形。除待测样品外，每个SSR位点还应同时包括3 4个参照品种的扩增产物。本发明所构建的SSR指纹图谱如表3所示。
利用SSR指纹图谱进行大白菜品种鉴别；依据29对核心荧光标记SSR引物的检测结果进行判定:品种间差异位点数> 3为不同品种；品种间差异位点数〈3为近似品种。本发明的有益效果是:本发明建立了快速准确、经济简便、稳定可靠的大白菜DNA指纹鉴定标准实验体系，并在此基础上开发了一种适用于大白菜品种鉴定DNA指纹检测的方法。本发明利用毛细管电泳方法进行大白菜品种鉴定，在时间上充分提高了试验效率，具有快速、准确、操作方便等优势，并且鉴定结果不受环境影响。
图1是50份大白菜品种基于29对核心SSR引物的品种聚类图。
具体实施例方式实施例1I) DNA提取表I50份供试品种
权利要求
1.一种大白菜SSR指纹图谱构建方法，包括提取供试品种DNA、用荧光标记SSR引物进行PCR扩增、电泳检测和指纹图谱构建，其特征在于:所述的荧光标记SSR引物包括29对核心 SSR 引物，分别是 cnu_ml39a、nia_m086a、nia_m098a、nia_ml38a、cnu_m046a、nia_ml21a、cnu_m073a、cnu_m288a、cnu_m316a、cnu_m327a、nia_ml01a、cnu_m252a、Nal0_D09、cnu_m289a、cnu_m442a、cnu_m050a、cnu_ml49a、nia_m037a、nia_m049a、cnu_ml82a、cnu_m295a、cnu_m090a、cnu_m016a、cnu_m530a、cnu_m534a、nia_m038a、nia_m022a、ENA2、nia_m035a，其核苷酸序列依次如序列表SEQ ID N0.1 58所示；所述电泳检测为五色荧光毛细管电泳检测或者变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
2.如权利要求1所述的一种大白菜SSR指纹图谱构建方法，其特征是，所述电泳检测为五色荧光毛细管电泳检测，具体为:将6-FAM和HEX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，TAMRA和ROX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释10倍；分别取等体积的上述4种稀释后溶液混合形成混合液；取I μ L混合液加入0.1 μ L LIZ500分子量内标和8.9 μ L去离子甲酰胺加入到DNA分析仪专用深孔板孔中；然后将其在PCR仪上95°C变性5min，取出，立即置于碎冰上，冷却IOmin以上；瞬时离心IOs后置放到DNA分析仪上进行毛细管电泳检测，用GENEMAPPER进行图像分析和数据采集；将每一位点待测样品和相应的参照品种扩增片段的带型和移动位置进行比较，根据参照品种的移动位置和扩增片段大小，确定待测样品该位点的等位变异大小，纯合位点的等位变异记录为X/X，杂合位点的等位变异记录为X/Y，多个位点的数据整合在一起形成不同大白菜品种的SSR指纹图谱。
3.如权利要求1所述的一种大白菜SSR指纹图谱构建方法，其特征是，所述电泳检测为变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，具体为:采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物，60W恒功率电泳1 .5h，银染显色；以pBR322DNA/MspI为DNA分子量标准，将每一位点待测样品和相应的参照品种扩增片段的带型和移动位置进行比较，根据参照品种的移动位置和扩增片段大小，确定待测样品该位点的等位变异大小，纯合位点的等位变异记录为X/X，杂合位点的等位变异记录为X/Y ;多个位点的数据整合在一起形成不同大白菜品种的SSR指纹图谱。
4.如权利要求2或3所述的一种大白菜SSR指纹图谱构建方法，其特征是，用29对核心SSR引物分别对供试品种DNA进行PCR扩增采用25 μ L的反应体积，该反应体系含dNTP0.25mmol/L，正向引物、反向引物各0.4ymol/L，Taq DNA聚合酶1.0单位，I XPCR缓冲液，MgCl2L 5mmol/L,样品 DNA10_40ng ;反应程序采用 TouchdownPCR:94°C预变性 4min ；94 V变性45s，65 °C退火45s，72 °C延伸45s，每循环降I °C，共15个循环；94 V变性45s，50 V退火30s，72°C延伸45s，共30个循环；72°C延伸10min，4°C保存；所述I XPCR缓冲液不含Mg2+。
5.采用权利要求2或3的方法所构建的大白菜SSR指纹图谱。
6.一种利用权利要求5所述的大白菜SSR指纹图谱进行大白菜品种鉴定的方法，其特征是，依据29对核心荧光标记SSR引物的检测结果进行判定:品种间差异位点数> 3为不同品种；品种间差异位点数〈3为近似品种。
全文摘要
本发明公开了一种大白菜SSR指纹图谱构建方法，属于农业的大白菜育种与应用技术领域。它首先提取供试品种的DNA，然后用如序列表SEQ ID No.1～58所示的29对核心SSR引物分别对供试品种DNA进行PCR扩增；PCR产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测或者五色荧光毛细管电泳检测构建大白菜品种的SSR指纹图谱。本发明建立了快速准确、经济简便、稳定可靠的大白菜DNA指纹鉴定标准实验体系，并在此基础上开发了一种适用于大白菜品种鉴定DNA指纹检测的方法。本发明利用毛细管电泳方法进行大白菜品种鉴定，在时间上充分提高了试验效率，具有快速、准确、操作方便等优势，并且鉴定结果不受环境影响。
文档编号C12Q1/68GK103194537SQ20131008018
公开日2013年7月10日 申请日期2013年3月13日 优先权日2013年3月13日
发明者李汝玉, 张晗, 段丽丽, 王东建, 孙加梅, 李华, 郑永胜, 王雪梅 申请人:山东省农业科学院作物研究所