专利名称：一种小麦ssr指纹图谱构建方法
技术领域：
本发明涉及一种小麦SSR指纹图谱构建方法，属于农业的小麦育种与应用技术领域。
背景技术：
小麦属于禾本科的小麦属，它是世界上最早栽培的农作物之一。经过长期的发展，已经成为世界上分布最广、面积最大、总产最高、贸易额最多、营养价值最高的粮食作物之一。全世界有43个国家，有35%-40%的人口以小麦为主要粮食。小麦子粒含有丰富的淀粉、较多的蛋白质、少量的脂肪，还有多种矿物质元素和维生素B，是一种营养丰富、经济价值较高的商品粮。因此对商用种子品种的鉴别尤为重要。目前我国对小麦品种进行鉴定主要方法是按照GB/T19557.2《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南小麦》进行田间测定来鉴定的。这种方法存在的主要问题是运用田间测定，鉴定结果·易受环境因素的影响，也常出现不同测试人员对某些性状的认识存在偏差，导致判定结果不一致的问题，同时田间测定周期长，不能及时、快捷地为新品种侵权案件提供鉴定依据。测试性状多、工作量大，无法适用大量品种的测试需求。利用分子标记技术建立DNA指纹图谱(fingerprint)是鉴别品种、品系的有力工具。品种DNA指纹数据库的构建在小麦品种纯度及真实性鉴定、品种权登记保护、区试及审定品种质量监控等方面具有重要应用价值，对理清我国小麦种质的亲缘关系、杂种优势群划分、种质创新及新品种选育具有重要指导意义。目前用于绘制植物DNA指纹图谱的标记技术主要有 RAPD、RFLP、AFLP、SSR 等。简单重复序列(Simple sequence repeat, SSR)也叫微卫星(Microsatellites),是第二代基于PCR技术的分子标记技术。与其它分子标记相比，SSR标记具有多态信息含量高、共显性遗传、技术简单、重复性好、特异性强等特点，已被广泛应用于植物遗传研究和育种实践中。
发明内容
本发明的目的在于:针对目前对大麦品种进行鉴定方法只能在大田里进行，且工作量大等一系列问题，提供一种小麦SSR指纹图谱构建方法，并利用所构建的SSR指纹图谱进行品种鉴定。本发明的目的是这样实现的:一种小麦SSR指纹图谱构建方法，包括提取供试品种DNA、用荧光标记SSR引物进行PCR扩增，电泳检测和指纹图谱构建，其特征在于，所述的荧光标记SSR引物包括13对基本核心SSR荧光标记引物和12对扩展核心SSR荧光标记引物，其中，13对基本核心SSR荧光标记引物为Xgwml55-3A、Xgwm357_lA、Xgwm610_4A、Xgwm513-4B、Xcfd84_4D、Xcfa2155_5A、Xbhwl29_5B、Xcfd8_5D、Xgwm570_6A、Xbarcl4_6B、Xcfd76-6D、Xcfa2028-7A、Xwmc73_7B，其序列依次如序列表 SEQ ID N0.1 26 所示；12 对扩展核心 SSR 荧光标记引物为 Xcfd28-1D、Xbarc7_2B、Xgwm296_2D、Xgwm2_3A、Xcau2_4A、Xgwm495-4B、Xbarcl-5A、Xbarc4-5B、Xgdm43-5D、Xgwm617-6A、Xgwm219-6B、Xcfd33-6D，其序列依次如序列表SEQ ID N0.27 50所示。具体步骤如下:( I)提取供试品种样品的DNA ；(2)用13对基本核心SSR荧光标记引物和12对扩展核心SSR荧光标记引物分别对供试品种模板DNA进行PCR扩增，PCR扩增采用25 μ L的反应体积，含dNTP0.25mmol/L,正向引物、反向引物各0.4ymol/L，Taq DNA聚合酶1.0单位，I XPCR缓冲液(不含Mg2+)，MgCl2L 5mmol/L，样品 DNA10_40ng。反应程序为:94°C预变性 4min ;94°C变性 45s，65°C退火45s，72°C延伸45s，每循环降1°C，共15个循环；94°C变性45s，50°C退火30s，72°C延伸45s，共30个循环；72°C延伸10min，4°C保存。(3) PCR产物经电泳检测构建小麦品种的SSR指纹图谱a.变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物，60W恒功率电泳1.5h，银染显色；以pBR322DNA/MspI为DNA分子量标准，纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X，其中X为该位点等位变异的大小；杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异。小片段在前，大片段在后。无效等位变异的大小记录为0/0;多个位点的数据整合在一起形成不同大白菜品种的SSR指纹图谱。b.毛细管电泳将FAM (蓝色)和HEX (绿色)荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，TAMRA (黑色)和ROX (红色)荧光标记的PCR产物稀释10倍；分别取等体积的上述4种稀释后溶液混合形成混合液，从混合液中吸取I μ L加入0.1 μ L LIZ500分子量内标和8.9 μ L去离子甲酰胺加入到DNA分析仪专用深孔板孔中；然后将其在PCR仪上95°C变性5min，取出，立即置于碎冰上,冷却IOmin以上；瞬时离心IOs后置放到DNA分析仪上进行毛细管电泳检测,用GENEMAPPER进行图像分析和数据采集。以pBR322DNA/MspI为DNA分子量标准，纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X，其中X为该位点等位变异的大小；杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异。小片段在前，大片段在后。无效等位变异的大小记录为0/0 ;多个位点的数据整合在一起形成不同大白菜品种的SSR指纹图谱。除待测样品外，每个SSR位点还应同时包括3 4个参照品种的扩增产物本发明所构建的SSR指纹图谱如表4所示。利用SSR指纹图谱进行小麦品种鉴别:依据25对荧光标记引物的检测结果进行判定:品种间差异位点数>3为不同品种；品种间差异位点数〈3为近似品种，形成鉴定结果。本发明的优点在于:可以在实验室，根据SSR位点的多态性，利用PCR扩增、凝胶电泳和毛细管电泳技术鉴定小麦品种，在时间上充分提高了试验效率，具有快速、准确、操作方便等优势，并且鉴定结果不易受环境影响。
图1是92份小麦品种基于25对核心SSR引物的品种聚类图；图2是引物Xcfa2155_5A对部分小麦品种的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
具体实施方式
实施例1I) DNA 提取表192份小麦品种
权利要求
1.一种小麦SSR指纹图谱构建方法，包括提取供试品种DNA、用荧光标记SSR引物进行PCR扩增，电泳检测和指纹图谱构建，其特征在于，所述的荧光标记SSR引物包括13对基本核心SSR荧光标记引物和12对扩展核心SSR荧光标记引物，其中，13对基本核心SSR荧光标记引物为 Xgwml55-3A、Xgwm357_lA、Xgwm610_4A、Xgwm513_4B、Xcfd84_4D、Xcfa2155_5A、Xbhwl29-5B、Xcfd8_5D、Xgwm570_6A、Xbarcl4_6B、Xcfd76_6D、Xcfa2028_7A、Xwmc73_7B，其序列依次如序列表SEQ ID N0.1 26所示；12对扩展核心SSR荧光标记引物为Xcfd28_lD、Xbarc7_2B、Xgwm296_2D、Xgwm2_3A、Xcau2_4A、Xgwm495_4B、Xbarcl_5A、Xbarc4_5B、Xgdm43-ro、Xgwm617-6A、Xgwm219-6B、Xcfd33-6D，其序列依次如序列表 SEQ ID N0.27 50所示；所述电泳检测为五色荧光毛细管电泳检测或者变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
2.如权利要求1所述的一种小麦SSR指纹图谱构建方法，其特征是，所述电泳检测为五色荧光毛细管电泳检测，具体为:将FAM和HEX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，TAMRA和ROX荧光标记的PCR产物稀释10倍；分别取等体积的上述4种稀释后溶液混合形成混合液，从混合液中吸取I μ L加入0.1 μ L LIZ500分子量内标和8.9 μ L去离子甲酰胺加入到DNA分析仪专用深孔板孔中；然后将其在PCR仪上95°C变性5min，取出，立即置于碎冰上,冷却IOmin以上；瞬时离心IOs后置放到DNA分析仪上进行毛细管电泳检测,用GENEMAPPER进行图像分析和数据采集；以pBR322DNA/MspI为DNA分子量标准，纯合位点的等位变异大小数据 记录为X/X ;杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，多个位点的数据整合在一起形成不同大白菜品种的SSR指纹图谱。
3.如权利要求1所述的一种小麦SSR指纹图谱构建方法，其特征是，所述电泳检测为变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，具体为:采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物，60W恒功率电泳1.5h，银染显色；以pBR322DNA/MspI为DNA分子量标准，纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X ;杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，多个位点的数据整合在一起形成不同大白菜品种的SSR指纹图谱。
4.如权利要求2或3所述的一种小麦SSR指纹图谱构建方法，其特征是，所述用13对基本核心SSR荧光标记引物和12对扩展核心SSR荧光标记引物分别对供试品种模板DNA进行PCR扩增；PCR扩增采用25 μ L的反应体积，含dNTP0.25mmol/L,正向引物、反向引物各0.4ymol/L, Taq DNA 聚合酶 1.0 单位，不含 Mg2+的 I XPCR 缓冲液，MgCl2L 5mmol/L，样品DNA10-40ng ;反应程序为:94°C预变性4min ;94°C变性45s，65°C退火45s，72°C延伸45s，每循环降1°C，共15个循环；941:变性458，501:退火30s，72°C延伸45s，共30个循环；72°C延伸 10min，4°C 保存。
5.采用权利要求2或3的方法所构建的小麦SSR指纹图谱。
6.一种利用权利要求5所述的小麦SSR指纹图谱进行小麦品种鉴定的方法，其特征是，依据25对荧光标记引物的检测结果进行判定:品种间差异位点数> 3为不同品种；品种间差异位点数〈3为近似品种，形成鉴定结果。
全文摘要
本发明公开了一种小麦SSR指纹图谱构建方法，属于农业的小麦育种与应用技术领域。它首先提取供试品种的DNA，然后用如序列表SEQ ID No.1～26所示的13对基本核心SSR荧光标记引物和如序列表SEQ ID No.27～50所示的12对扩展核心SSR荧光标记引物分别对供试品种DNA进行PCR扩增；PCR产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测或者五色荧光毛细管电泳检测构建小麦品种的SSR指纹图谱。本发明可以在实验室根据SSR位点的多态性，利用PCR扩增、凝胶电泳和毛细管电泳技术鉴定小麦品种，在时间上充分提高了试验效率，具有快速、准确、操作方便等优势，并且鉴定结果不易受环境影响。
文档编号C12Q1/68GK103243158SQ20131011995
公开日2013年8月14日 申请日期2013年4月8日 优先权日2013年4月8日
发明者李汝玉, 张晗, 段丽丽, 王东建, 孙加梅, 郑永胜, 王雪梅, 李华 申请人:山东省农业科学院作物研究所