专利名称：高效表达的猪白细胞介素-2基因及其表达蛋白的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术中基因表达领域，特别涉及一种高效表达的猪白细胞介素-2基因，还涉及其表达蛋白的用途。
背景技术：
猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductive and respiratory syndrome,PRRS),俗称〃猪蓝耳病〃，由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus, PRRSV)引起,病毒感染后可以导致母猪流产、返情、产死胎或弱仔、仔猪死亡及各种年龄的猪不同程度的呼吸道症状，并且能破坏猪的免疫系统，引起混合感染或继发感染。我国于1995年底爆发此病，并迅速蔓延到全国多个省份。在许多规模化猪场，PRRS阳性率很高，有的可达80%以上。自2006年以来，我国部分地区猪场发生了由PRRSV变异株导致的高致病性蓝耳病。该病在临床上以发病猪高热、呼吸困难、皮肤发红为主要特征，具有更高的发病率和死亡率，给我国的养猪业造成了极为严重的经济损失。该病目前有灭活苗使用，但是免疫效果不尽理想。IL-2是由T淋巴细胞产生的一类Thl型细胞因子，又称T细胞生长因子。能够有效地提高机体的免疫功能，促进T、B淋巴细胞的增殖，增强NK细胞、单核巨噬细胞等的杀伤活性。IL-2是机体免疫应答的核心物质，不仅可作为抗病毒、抗肿瘤方面的治疗药剂，而且还可作为佐剂增强疫苗的免疫效果，具有广阔的应用前景。1983年Taniguchi等首次克隆成功人的IL-2基因。1991年Goodall等首次克隆了猪IL-2基因(pIL-2)，随后国内外学者用大肠杆菌、酵母、腺病毒等表达了 pIL-2，对其生物学活性进行了大量研究。本课题组也曾将pIL-2克隆入真核表达载体pVAXl°，转染HEK-293A细胞后pIL-2的表达量和活性较低。
发明内容
为了解决以上猪繁殖与呼吸综合征灭活苗免疫效果不理想、猪白细胞介素-2基因转染后PIL-2的表达量和活性低的问题，本发明提供了一种高效表达的猪白细胞介素-2基因。本发明还提供了将上述序列2的基因通过分子生物学技术克隆至真核表达载体获得的重组质粒。本发明还提供了上述猪白细胞介素-2基因的表达蛋白在增强高致病性PRRSV灭活疫苗体液免疫和细胞免疫应答中的应用。本发明是通过以下措施实现的:
一种闻效表达的猪白细胞介素_2基因，其核昔酸序列如序列表中序列2所不。一种序列2的基因通过分子生物学技术克隆至真核表达载体获得的重组质粒。
一种所述的猪白细胞介素-2基因的合成方法，包括以下步骤 1、将真核质粒pVAXf改造为pMVAX广:由 GenBank 公布的 Rabbit β -Globin Intron II 基因序列 GenBank No: V00882,在上游引入AiI酶切位点和pCMV即刻早期启动子的一段序列，在下游引入T7启动子序列和&oRI酶切位点，人工拼接后的核苷酸序列如序列表中序列I所示,将此段基因序列通过5^1/^boRI酶切位点插入pVAXf载体中，转化感受态细菌，提取质粒经筛选得到SstV双酶切阳性克隆，命名为PMVAXle ；
所述 pCMV 即刻早期启动子的一段序列为:5’ -GTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGC-3，,
所述 17 启动子序列为:5’ -AATACGACTCACTATAGGG-3’ ；
2、构建表达pIL-2的重组真核质粒pMVAXl°-pIL-2:
2.1设计一对扩增pIL-2蛋白的基因序列的特异性引物，引物序列如下: pIL-2-Fwd:5’ -TATGAATTCGGTACCACCATGGATAAGATGCAGC-3’， pIL-2-Rev:5’ -GAGCTCGAGAAGCTTAAGTCAGTGTTGAGTAGATGCTT-3’，
在上游引物pIL-2-Fwd的5’端引入&0RI限制性内切酶位点和Kozak序列，在下游引物pIL-2-Rev的5’端引入通ol限制性内切酶位点；
2.2从猪的脾淋巴细胞提取RNA，经反转录后得到cDNA，采用RT-PCR技术扩增出pIL_2蛋白基因的PCR产物；
2.3用feoRI/ZAoI双酶切pMVAXf，胶回收得包含序列I的载体基因片段1，pIL-2蛋白基因的PCR产物经feoRI/ZAoI双酶切并胶回收得到编码pIL-2蛋白的基因片段2，将载体基因片段I和基因片段2连接，转化感受态细菌，培养，挑取菌落于卡那霉素抗性的培养基中培养，提取质粒，进行feoRI/ZAoI双酶切鉴定，筛选出阳性克隆，得pMVAXl°-pIL-2，相比较于真核质粒pVAXl°，pMVAXl°-pIL-2中插入的基因核苷酸序列如序列表中序列2所示。步骤2.2 中 PCR 反应体系为 25μ ，含 cDNA lPL，Mg2+ 1.5mmol/L,dNTP 200Mmol/L,IOXLA PCR Buffer 2.5μ ，pIL-2-Fwd 和 pIL-2-Rev 浓度均为 400nmol/L，TaKaRa LA Taq2U;反应条件为:预变性95° C 5min，然后进行35个循环，循环条件为95° C45s，61° C45s, 72° C Imin ;然后72° C延伸lOmin，取出产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳。一种所述的猪白细胞介素-2基因的表达蛋白在增强高致病性PRRSV灭活疫苗体液免疫和细胞免疫应答中的应用。本发明的有益效果是:
(1)含有序列表中序列2的真核质粒pMVAXl°-pIL-2表达pIL_2蛋白基因，突破了通过pVAXl°载体表达pIL-2过程中遇到的表达量较低和活性较差的局限性，表达量提高了 5.7倍;
(2)猪体试验证明，序列表中序列2基因的表达蛋白pIL-2表达活性很高，能够显著增强高致病性PRRSV灭活疫苗的体液免疫和细胞免疫应答，专用于对高致病性PRRSV引起的疾病的预防及减少猪场的经济损失。
图1为改造真核质粒pVA Xl°为pMVAXl°及克隆pIL-2蛋白基因入pMVAXl°的示意图； 图2为重组质粒pMVAXfAtVEco^l双酶切鉴定图谱，其中 M 为 DL2, 000 DNA Marker,
I为重组阳性质粒ρΜνΑΧΓ的5^1/^boRI双酶切结果；图3为重组质粒pMVAXl°-pIL-2的&0RI/ZA0I双酶切鉴定图谱，其中 M 为 DL2, OOO DNA Marker,
I和2为两个不同重组阳性质粒pMVAXf-pIL-2的&0RI/ZA0I双酶切结果；
图4为重组质粒pMVAXf-pIL-2表达的pIL_2的Western_blot检测，其中 泳道I为空载体质粒PVAXf转染HEK-293A后Western-blot检测条带，
泳道2为改造的空载体质粒pMVAXf转染HEK-293A后Western-blot检测条带，
泳道 3 为 pVAXf-pIL-2 转染 HEK-293A 后 Western-blot 检测条带，
泳道 4 为 pMVAXf-pIL-2 转染 HEK-293A 后 Western-blot 检测条带；
图5为通过MTT法测定的重组质粒pMVAXf-pIL-2表达的pIL_2的生物学活性；
图6为重组质粒pMVAXl°-pIL-2表达的pIL_2对PRRSV灭活疫苗中和抗体的增强作
用；
图7为通过外周血淋巴细胞增殖试验测定的重组质粒pMVAXf-pIL-2表达的pIL_2对PRRSV灭活疫苗细胞免疫的增强作用。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明的猪白细胞介素-2基因进行进一步说明。
.将真核质粒ρνΑΧΓ改造为PMVAXle 1.1插入基因的人工合成
参考GenBank公布的 Rabbit β -Globin Intron II 基因序列(GenBank No: V00882),在上游引入AiI酶切位点和pCMV即刻早期启动子的一段序列，在下游引入Τ7启动子序列和&0RI酶切位点，将这段基因序列拼接在一起交由TaKaRa公司人工合成，具体编码的包含Rabbit β -Globin Intron II基因的核苷酸序列见序列表中序列I,并克隆入T载体。所述pCMV 即刻早期启动子的一段序列为 5’ -GTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGC-3，,
所述 17 启动子序列为 5’ -AATACGACTCACTATAGGG-3’ ；
1.2 pMVAXf的构建及鉴定
从T载体上5^1/^boRI双酶切目的基因并胶回收，与同样经过5^1/^boRI双酶切的真核质粒pVAXl°并胶回收的载体片段在16° C过夜连接，转化DH5a感受态细菌，37° C过夜培养16h。挑取菌落于卡那霉素抗性的LB培养基中37° C过夜振荡培养，第二天提取质粒，进行双酶切鉴定，鉴定为阳性的质粒命名为pMVAXl° (鉴定结果见图2)，交由TaKaRa公司测序，插入的基因片段序列与序列表中序列I相吻合。.pIL-2蛋白的基因克隆入pMVAXf 2.1引物的设计及合成
根据GenBank公布的pIL_2的基因序列(GenBank n0.NM_213861),设ii 对扩增pIL-2蛋白的基因序列的特异性引物，在上游引物pIL-2-Fwd的5’端引入&0RI限制性内切酶位点和Kozak序列，在下游引物pIL-2-Rev的5’端引入通ol限制性内切酶位点，引物序列如下:
pIL-2-Fwd:5’ -TATGAATTCGGTACCACCATGGATAAGATGCAGC-3’，pIL-2-Rev:5’ -GAGCTCGAGAAGCTTAAGTCAGTGTTGAGTAGATGCTT-3’，两条引物pIL-2-Fwd和pIL-2-Rev横跨pIL_2蛋白编码区，预计扩增片段长度为496bp,引物由TaKaRa公司合成。2.2猪脾淋巴细胞的分离培养、诱导及总RNA的提取
无菌采集约克猪的脾，用淋巴细胞分离液分离脾淋巴细胞，用10%胎牛血清的1640液在37° C、含CO2 5v%的培养箱中培养lh，然后加入50(^g/mL的植物血凝素(PHA)刺激12h后，用TRIzoI试剂提取总RNA，作为RT-PCR的模板。2.3 RT-PCR 扩增
以RNA经反转录酶Oligo (!⑴反转录得到的cDNA为模板，pIL_2_Fwd和pIL-2-Rev为引物进行 PCR 扩 增，PCR 反应体系为 25μ ，含 cDNA μ , Mg2+ 1.5mmol/L, dNTP 200Mmol/L, IOXLA PCR Buffer 2.5μ , pIL-2-Fwd 和 pIL-2-Rev 的浓度均为 400nmol/L, TaKaRa LATaq 2U。反应条件为:预变性95° C 5min ;然后进行35个循环，循环条件为95° C 45s,61° C 45s, 72° C Imin ;然后72° C延伸lOmin，取出产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，胶回收获得PIL-2蛋白基因的PCR产物。2.4重组真核表达质粒的构建及鉴定
用feoRI/ZAoI双酶切pMVAXl°，胶回收得到包含序列I的载体基因片段1，pIL-2的蛋白基因的PCR产物经feoRI/ZAoI双酶切并胶回收得到编码pIL-2蛋白的基因片段2，将载体基因片段I和基因片段2连接，转化DH5a感受态细菌，37° C过夜培养16h。挑取菌落于卡那霉素抗性的LB培养基中37° C过夜振荡培养，第二天提取质粒，进行feoRI/ZAoI双酶切鉴定。鉴定为阳性的质粒pMVAXl°-pIL-2(鉴定结果见图3)交由TaKaRa公司测序。用Vector NTI和DNAStar软件分析所插入的基因序列和推导氨基酸序列，插入基因过程示意图见图1。相比较于真核质粒pVAXl°，pMVAXl°-pIL-2中插入的核苷酸序列如序列表中序列
2所示，推导氨基酸序列如序列表中序列3所示。重组真核质粒表达的pIL-2的高效表达鉴定
3.1重组质粒pMVAXf-pIL-2转染人胚肾上皮细胞HEK-293A
实验组:具体操作按Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司)说明书进行。转染在6孔细胞板上进行，在转染的前一天，消化HEK-293A细胞，用10%的胎牛血清DMEM (不含抗生素)稀释细胞，使其密度达到2.5 X IO5个细胞/mL，在6孔细胞板上每孔接种2.5mL，于37° C、含C025v%的培养箱中培养。在灭菌的1.5mL的离心管中先加入500μ 37° C预热的OPT1-MEM无血清培养基，然后加入1.θμδ的重组质粒pMVAXf-pIL_2，轻轻混匀；在另一个灭菌的1.5mL的离心管中先加入500μ 37° C预热的OPT1-MEM无血清培养基，然后加入2.5μ Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀，在室温放置5min ;然后将两个1.5mL的离心管中的液体混匀在一起，室温放置20min -J人CO2培养箱中取出细胞板，弃去上清，把液体混合物轻轻加入到细胞面上，然后立即把细胞板放入CO2培养箱中；温育6h后，吸掉上清，轻轻加入2.0mL 37° C预热的10%的胎牛血清DMEM，放入CO2培养箱继续培养24h，然后反复冻融细胞转染物2次，12000rpm离心5min，得到冻融裂解上清，待检。对照组1:将实验组的pMVAXl°-pIL-2替换为空载体质粒pVAXl°，其余方法同实验组一致，作为对照。对照组2:将实验组的pMVAXl°-pIL-2替换为改造的空载体质粒pMVAXl°，其余方法同实验组一致，作为对照。
对照组3:将实验组的pMVAXl°-pIL-2替换为pVAXl°-pIL_2，其余方法同实验组一致，作为对照。所述pVAXl°-pIL-2为真核质粒载体pVAXl°中只插入pIL-2基因，而不插入Rabbitβ -Globin Intron II 基因。3.2 重组质粒 pMVAXl°-pIL-2 表达的 pIL_2 的 Western-blot 检测
参照Bio-Rad公司半干转印仪操作说明进行电转印，然后进行免疫检测。将丽春红染色后的NC膜转移至封闭液中，室温轻摇Ih后4° C封闭过夜；倾去封闭液，用洗涤液TBST洗膜5次,每次5 min,然后加入猪IL-2的单克隆抗体(Invitrogen公司),室温下振荡Ih ；再用TBST洗膜5次，每次5min，然后加入以封闭液1:5000稀释的羊抗小鼠IgG-HRP，室温振荡Ih ;再用TBST洗膜5次,每次5min,最后用化学发光显色试剂盒(Supersignal WestPico Trial Kit)进行显色，在X胶片上曝光、显影和定影观察。试验同时设立β-actin对照，一抗为β-actin单克隆抗体(Santa Cruz公司)，二抗为1:5000稀释的羊抗小鼠IgG-HRP。检测检测结果见图4，从图中可以看到，pIL-2得到了正确的表达，分子量约17kD。pMVAXf-pIL-2 表达的 pIL-2 明显高于 pVAXf-pIL-2。经过 Bio-Rad ChemiDoc XRS System分析，pMVAXf-pIL-2表达的pIL-2的量是pVAXf-pIL-2的6.7倍(提高了 5.7倍)。3.3重组质粒pMVAXf-pIL-2表达的pIL_2生物学活性检测
无菌采集约克猪的脾脏，用Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich公司)分离脾单核细胞，用刀豆素A (ConA)刺激24h后，再用Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich公司)分离一次细胞，收获活的细胞，制成5 X IOfVmL的细胞悬液，转入96孔细胞培养板(100μ 7孔)，加入2倍梯度稀释的冻融裂解上清(IOOPL/孔)，培养48h，每个样品设3个重复。每孔加入5mg/mL的MTT溶液20uL，培养4h。然后每孔加入ΙΟΟμ 含0.0lmol/L HCl的异丙醇，40° C反应8h，室温下放置20min，读取OD57t`lnm的光密度值。OD570nm (pIL-2) /OD570nm (阴性对照)彡1.5判为阳性。检测结果见图5，从图中可以看出，pMVAXf-pIL-2表达的pIL_2具有很高的生物学活性，且为剂量依赖性，刺激T淋巴细胞增殖的最小剂量为1:800稀释，而pVAXl°-pIL-2表达的pIL-2刺激T淋巴细胞增殖的最小剂量为1:100稀释，约为pMVAXf-pIL-2的1/8。重组真核质粒表达的pIL-2对高致病性PRRSV灭活疫苗免疫应答的增强作用
4.1猪体实验分组
选取3周龄的健康仔猪(猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒和猪传染性胸膜肺炎放线杆菌等均为抗原阴性和抗体阴性)50头，每组5头。实验组:将pMVAXf-pIL-2 500ug/头与高致病性PRRSV灭活疫苗(SD-JN株，由本实验室自行制备，制备方法同高致病性猪蓝耳病灭活苗NVDC-JXAl株)1头份合用免疫3周龄的健康仔猪，颈部肌肉注射。一免后28天，以相同的剂量方法加强免疫一次。于一免后28天(二免前)、一免后42、56天分别采血测定中和抗体；一免后42、56天分别采集肝素抗凝血，用PRRSV SD-JN株浓缩抗原进行刺激，MTT法测定外周血淋巴细胞增殖活性。对照组1:将实验组的pMVAXl°-pIL-2替换为pVAXl°-pIL_2，其余方法同实验组一致。对照组2:将实验组的pMVAXl°-pIL-2替换为PBS，其余方法同实验组一致。
对照组3:将实验组的pMVAXl°-pIL-2替换为空载体质粒pVAXl°，其余方法同实验
组一致。对照组4:将实验组的pMVAXl°-pIL-2替换为改造的空载体质粒pMVAXl°，其余方法
同实验组一致。对照组5:仅注 射PBS，不注射灭活苗。对照组6:仅按照500ug/头的剂量注射空载体质粒pVAXl°，不注射灭活苗。对照组7:仅按照500ug/头的剂量注射空载体质粒pMVAXl°，不注射灭活苗。对照组8:仅按照500ug/头的剂量注射pVAXf-pIL-2，不注射灭活苗。对照组9:仅按照500ug/头的剂量注射pMVAXf-pIL-2，不注射灭活苗。4.2体液免疫反应检测
检测结果见图6，一免后42、56天实验组的中和抗体显著高于对照组1，平均中和抗体在一免后42天实验组为1:15，对照组I为1:8 ;在一免后56天实验组为1:24，对照组I为1:12 ;对照组2-4产生的中和抗体很低，为灭活疫苗产生的中和抗体，一免后42天为1:4，一免后56天为1:8，对照组5-9无中和抗体产生。4.3细胞免疫反应检测
检测结果见图7，一免后42、56天实验组的PRRSV特异性的外周血淋巴细胞增殖活性显著高于对照组1，而对照组I也显著高于对照组2-9。
权利要求
1.一种闻效表达的猪白细胞介素-2基因,其核昔酸序列如序列表中序列2所不。
2.—种权利要求1所述序列2的基因通过分子生物学技术克隆至真核表达载体获得的重组质粒。
3.—种权利要求1所述的猪白细胞介素-2基因的合成方法，其特征是包括以下步骤: (1)将真核质粒pVAXf改造为pMVAX广:由 GenBank 公布的 Rabbit β -Globin Intron II 基因序列 GenBank No: V00882,在上游引入AiI酶切位点和pCMV即刻早期启动子的一段序列，在下游引入T7启动子序列和&oRI酶切位点，人工拼接后的核苷酸序列如序列表中序列I所示,将此段基因序列通过5^1/^boRI酶切位点插入pVAXf载体中，转化感受态细菌，提取质粒经筛选得到SstV双酶切阳性克隆，命名为PMVAXle ； 所述 pCMV 即刻早期启动子的一段序列为:5’ -GTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGC-3，, 所述 17 启动子序列为:5’ -AATACGACTCACTATAGGG-3’ ； (2)构建表达pIL-2的重组真核质粒pMVAXf-pIL-2: ①设计一对扩增PIL-2基因序列的特异性引物，引物序列如下:pIL-2-Fwd:5’ -TATGAATTCGGTACCACCATGGATAAGATGCAGC-3’，pIL-2-Rev:5’ -GAGCTCGAGAAGCTTAAGTCAGTGTTGAGTAGATGCTT-3’， 在上游引物pIL-2-Fwd的 5’端引入&0RI限制性内切酶位点和Kozak序列，在下游引物pIL-2-Rev的5’端引入通ol限制性内切酶位点； ②从猪的脾脏提取RNA，经反转录后得到cDNA，采用RT-PCR技术扩增出pIL_2基因的PCR产物； ③用feoRI/ZAoI双酶切pMVAXl°，胶回收得包含序列I的载体基因片段1，pIL-2基因的PCR产物经feoRI/ZAoI双酶切并胶回收得到编码pIL-2蛋白的基因片段2，将载体基因片段I和基因片段2连接，转化感受态细菌，培养，挑取菌落于卡那霉素抗性的培养基中培养，提取质粒，进行feoRI/ZAoI双酶切鉴定，筛选出阳性克隆，得pMVAXl°-pIL-2，真核质粒PVAXl0中插入的基因核苷酸序列如序列表中序列2所示。
4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于步骤②中PCR反应体系为25μ ，含cDNA μ , Mg2+ 1.5mmol/L, dNTP 200Mmol/L，10X LA PCR Buffer 2.5μ ，pIL-2-Fwd 和pIL-2-Rev浓度均为 400nmol/L，TaKaRa LA Taq 2U ;反应条件为:预变性95。C 5min，然后进行35个循环，循环条件为95° C 45s，61° C 45s, 72° C Imin ;然后72° C延伸lOmin，取出产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳。
5.一种权利要求1所述的猪白细胞介素-2基因的表达蛋白在增强高致病性PRRSV灭活疫苗体液免疫和细胞免疫应答中的应用。
全文摘要
本发明涉及基因表达领域，特别涉及高效表达的猪白细胞介素-2基因，核苷酸序列见序列2。序列2的基因克隆至真核表达载体获得的重组质粒。猪白细胞介素-2基因的表达蛋白对猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗具有明显的免疫增强作用。含有序列表中序列2的真核质粒pMVAX1 -pIL-2表达pIL-2蛋白基因，突破了通过pVAX1 载体表达pIL-2过程中遇到的表达量较低和活性较差的局限性，表达量提高了5.7倍；猪体试验证明，序列表中序列2基因的表达蛋白pIL-2表达活性很高，能够显著增强高致病性PRRSV灭活疫苗的体液免疫和细胞免疫应答，专用于对高致病性PRRSV引起的疾病的预防及减少猪场的经济损失。
文档编号C12N15/85GK103194454SQ20131011903
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月8日 优先权日2013年4月8日
发明者杜以军, 齐静, 王金宝, 吴家强, 黄保华, 孙文博, 丛晓燕, 郭立辉, 任素芳, 陈蕾, 李俊, 时建立, 吕伟 申请人:山东省农业科学院畜牧兽医研究所