专利名称：一种快速增殖效应淋巴细胞的制备方法及其试剂盒、用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及过继性免疫疗法中快速增殖的效应淋巴细胞以及该细胞的制备方法，试剂盒制备等。本发明涉及的促进淋巴细胞中效应性淋巴细胞增殖，含有细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)的增殖激活，而调节性淋巴细胞增殖被抑制，可用于各类癌症包括实体瘤和血液肿瘤在内以及病毒感染的免疫治疗。
背景技术：
目前，肿瘤或病毒感染患者常规疗法带来的严重机体毒副作用，给以了生活品质不高，以及治疗产生的痛苦，包括化疗和放射疗法等。新的治疗模式-细胞免疫治疗为癌症或病毒患者提供高生活质量、延长生存期和无毒副作用的治疗手段。FMS 样酪氨酸激酶 3 配体(FMS Like Tyrosine Kinase3Ligand, Flt3L)不仅对造血干细胞和造血祖细胞的增生、分化、动员、维持及长期重建具有重要作用，还能明显地促进特别是树突状细胞、淋巴细胞等免疫系统细胞的增生。而且与其它促细胞生长的细胞因子有很好的协同作用(Onai N, Obata-Onai A, Schmid MA, Manz MG.Flt3in regulationof type I interferon-producing cell and dendritic cell development.Ann N Y AcadSc1.2007Jun ；1106:253-61.)，因而Flt3L能用来促进树突状细胞前体细胞分化增殖从而提高效应性淋巴细胞的增生。
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针对输注由体外诱导的细胞毒T细胞(cytotoxic T cell, CTL)或外周血淋巴细胞等在IL-2和抗人CD3抗体的作用下经放大培养得到的细胞因子激活的细胞的免疫疗法中，存在着提高在体外诱导的抗原特异性CTL高效地放大培养并维持细胞毒性的问题，本发明采用了免疫细胞促进因子Flt3L进行高效增殖效应淋巴细胞并具有良好的细胞毒性。
发明内容
在效应性淋巴细胞的放大培养过程中，PBMC分化为多个性质不同的细胞群，因此放大后的细胞中的CIK细胞比例必定不高。另一方面，在分化得到的细胞中还含有具有控制或抑制免疫的功能的细胞群。本发明的目的在于提供一种癌症治疗用细胞的扩增培养方法，以及用于快速增殖效应淋巴细胞的试剂盒。采用所述方法所制备的产品中富含CIK细胞，调节性T细胞含量少。本发明涉及快速增殖的效应淋巴细胞的制备方法，其特征在于，包含如下工序，SP在FMS样酪氨酸激酶3配体单独存在或与抗人CD3单抗共同存在的条件下，培养能快速增殖的效应淋巴细胞。所述效应淋巴细胞扩增倍数达到114以上。另外，作为本发明中使用的Flt3L的优选例子，可与抗人CD3单抗共同存在下实施体外培养。此外，作为本发明的优选方式，还提供在CD3配体、干扰素-Y、白细胞介素-2以及白介素-1 α的共存下实施Flt3L存在下的培养的含有CIK细胞的效应淋巴细胞的制造方法。本发明还提供用于快速增殖的效应淋巴细胞体外培养的试剂盒，其采用本发明所记载的方法使用。所述试剂盒包括:A液:细胞基础培养基；B液:干扰素-Y ；C液:白介素-2;D液:白介素l-α ；还含FMS 样酪氨酸激酶 3 配体(FMS Like Tyrosine Kinase3Ligand, Flt3L)与抗人CD3单抗包被的培养瓶；以及使用说明书；Flt3L固化方法:包被的培养瓶选用25cm2或75cm2培养瓶，或塑料培养皿，或透气性培养袋，优选地，在0.lng-100ng/mL Flt3L和0.lug-20ug/mL抗人0)3单抗存在下(pH值7.4的I X PBS进行稀释)，4°C冰箱过夜，弃包被液，放置超净台中干燥，备用。本发明还提供所述试剂盒在制备效应淋巴细胞中的用途。
图1表示本发明制备的效应淋巴细胞的流式细胞图；图2表示本发明制备的效应淋巴细胞的FoxP3流式细胞柱状图；图3表示本发明制备效应淋巴细胞与现有技术的细胞增殖倍数对比。
具体实施例方式本发明发现通过在Flt3L的存在下培养骨髓、脐带血或外周血来源的单个核细胞，在得到的效应淋巴细胞中高比例含有在细胞表面表达CD3与CD56两分子的细胞，而更低表达⑶4、⑶25和Fox P3的调节性T细胞，从而完成了本发明。对本发明涉及的快速增殖的效应淋巴细胞的制造方法进行具体说明。本发明涉及富含CIK细胞、即以CD3阳性和CD56阳性为特征的细胞的效应淋巴细胞的制造方法。本发明方法的特征在于，包含如下工序，即:在上述FIt3L的存在下，培养含有能分化为CIK细胞的效应淋巴细胞。作为本发明制造方法中使用的含有能分化为CIK细胞的效应淋巴细胞，可例举，由外周血、骨髓、脐带血等得到的细胞群或从这些材料中分离得到的血细胞系细胞群。上述细胞群无论是从生物体采集的新鲜细胞群或冷冻保存过的细胞群，均可用于本发明。本发明的制造方法中对Flt3L的浓度没有特殊限制，但优选例如为0.1-1OOng/mL、特别是0.5-50ng/mL。Flt3L除了在培养基中溶解而共存外，还可以在合适的固相例如培养皿、烧瓶、袋子等细胞培养用器材(培养用容器；包括开放体系和封闭体系的任一种)或珠子、膜、载玻片等细胞培养用载体上固定化后使用。这些固相的材质只要是可以在细胞培养中使用的材料即可，没有特殊限制。关于纤维连接蛋白的固定化量，根据将上述器材或载体供培养用时，按与将该成分在培养基中溶解使用时所需的浓度相同的比例进行选择，只要能得到所需效果，没有特殊限制。
固定化方法:包被的培养瓶选用25cm2或75cm2培养瓶，或塑料培养皿，或透气性培养袋，优选地，在0.lng-100ng/mL FIt3L存在下(pH值7.4的I XPBS进行稀释)，4°C冰箱过夜，弃包被液，放置超净台中干燥，备用。本发明优选的方式中，在抗人CD3单抗的存在下进行Flt3L存在下的培养。作为CD3单抗，只要是具有CD3结合活性的物质即可，没有特殊限制，可例举，例如抗CD3抗体，特别优选抗CD3单克隆抗体，例如0KT3 [J.1mmunol.，第124卷，第6号，2708 2713 (1980)]。CD3配体在培养基中的浓度没有特殊限制，例如在使用抗CD3单克隆抗体的情况下，优选例如0.1-200 μ g/mL、特别是1-100 μ g/mL。⑶3抗体也可以通过与Flt3L同样的操作在细胞培养用器材或细胞培养用载体上固定化后使用。若将Flt3L、CD3配体在固相上固定化，则培养结束后，只要将细胞与固相分离即可容易地将上述成分与得到的细胞群分离，能防止上述成分混入细胞群。本发明的快速增殖的效应淋巴细胞的制备方法中使用的培养基，没有特殊限制，可以使用淋巴细胞放大培养等中能使用的公知的培养基，例如可以适当地选择使用市售培养基。上述培养基除其原有的构成成分外，还可以含有细胞因子类、适当的蛋白质及其他成分。通常，本发明使用含有IFN-Y、IL-2和IL-1a的培养基。IFN-Y在培养基中的浓度没有特殊限制，可以是50-10000U/mL，更优选100_5000U/mL。IL-2在培养基中的浓度也没有特殊限制，可以是10_5000U/mL，优选50-2000U/mL。IL-1a在培养基中的浓度也没有特殊限制,可以是10-1000U/mL，优选50_500U/mL。在培养基中可以添加血清或血浆进行培养。它们在培养基中的添加量不受特殊限制，如大于O容量％至20容量％，且可以根据不同的培养阶段而改变血清或血浆的用量。例如，可以阶段性减少血清或血浆浓度来使用。另外，作为血清或血浆的来源，可以是自己(意味着与所培养的细胞来源相同)或非自己(意味着与所培养的细胞的来源不同)中的任一种，从安全性的观点出发，优选自己来源的血清或血浆。另外，也可以添加如人血清白蛋白之类经分离纯化的血清成分。本发明的快速增殖的效应淋巴细胞的制备除了使用Flt3L外，使用上述各种成分及培养基来实施。本发明中使用的培养开始时的细胞数没有特殊限制，例如优选
IX 104cells/mL_l X 108cells/mL、更优选 I X 105cells/mL_5 X 107cells/mL。另外，培养条件也没有特殊限制，可以使用通常的细胞培养中使用的条件。例如，可在37°0、5%0)2等条件下培养。还可以实施如下等操作:间隔适当的时间添加新鲜培养基来稀释细胞培养液，或更换培养基，或更换细胞培养用器材等。本发明的制备方法中可以使用例如培养皿、烧瓶、袋子、大型培养槽、生物反应器等细胞培养用器材(容器)。作为袋子，优选细胞培养用CO2气体透过性袋子。在需要大量细胞的情况下，可以使用大型培养槽。培养可以在开放体系或封闭体系中的任一体系中实施，但优选在封闭体系中实施培养。本发明的快速增殖的效应淋巴细胞的制备方法中，对培养期没有特殊限制，例如可以实施总天数为4 30天、优选6 21天的培养。在本发明的制造方法中，Flt3L存在下的培养可以是培养期的整个期间，也可以是任意的一部分期间。即，只要在细胞培养工序的一部分中包含Flt3L存在下的培养工序的培养即属于本发明。特别优选整个培养期的至少初期阶段在Flt3L的存在下实施培养，更优选在Flt3L的存在下开始培养。最好是将本发明的有效成分存在下的培养在培养开始后至少实施I天以上、更优选2天以上。当培养时使用CD3配体时，其使用时期没有特殊限制，例如在Flt3L使用时使CD3配体共存。
本发明的一个优选方式中，仅在整个培养期的初期阶段使用Flt3L和CD3配体。在本发明中没有特别限定，例如，从培养开始时到第7天为止，优选从培养开始时到第5天为止，在Flt3L和⑶3配体的共同存在下实施培养，之后在这两种成分均不存在的条件下继续培养,制备快速增殖的效应淋巴细胞。本发明优选的一个技术方案为:包被的培养瓶选用75cm2培养瓶，使用pH值7.4的I XPBS稀释的15ng/mLFlt3L单独存在或与0.5ug/mL抗人CD3单抗共同存在下，4°C冰箱过夜，弃包被液，放置超净台中干燥，制得已固定化75cm2培养瓶，备用。采集50mL外周血或脐带血，采用Ficoll密度梯度离心分离得到的单个核细胞2-10X 108cells，重悬悬在含有1000U/mL IFN-Y和10%自体血浆的RPMI1640培养基中，至3-10X 106cells/mL,添加到上述已固定化75cm2培养瓶中，每瓶30mL,在5 % CO2中在37°C下开始培养(培养第I天)。第2天(培养开始的次日)，向各培养瓶添加20mL含1200U/mL IL_2、400U/mLIL-1 α以及40%自体血浆的RPMI1640培养基，继续培养。第4天，向各培养瓶添加IOmL的完全RPMI1640培养基(含300U/mLIL_2、100U/mLIL-1a以及10%自体血浆)，继续培养。第6天,将 各培养瓶内的细胞悬浮在培养基中全部收集,转移到未固定化的150cm2培养瓶中或透气性培养袋。此时，添加完全RPMI1640培养基使每个培养瓶或每只袋子分别为IOOmL和600mL，在5% CO2中在37°C下培养。第8天和第10天，各培养瓶添加完全RPMI1640培养基进行扩瓶，每个培养瓶的培养液为150ml ;或向各袋子中添加完全RPMI1640培养基300mL进行继续培养至第16天。最终每只袋子的培养液为1500mL。培养到第16天，获得快速增殖的效应淋巴细胞，进行细胞活率和细胞表型检测；培养到第16天，获得快速增殖的效应淋巴细胞，进行细胞活率和细胞表型检测；其中，优选的细胞活率的测试方法为:计算培养最后一天的活细胞数，与培养开始时的细胞数进行比较，算出放大培养率；取ImL最后一天培养的培养液，1000rpm、4°C下离心10分钟，细胞用RPMI1640培养基重悬，取20ul细胞液用I X PBS稀释20倍，稀释液加入I倍体积的苔盼兰溶液，混匀后加入到细胞计数板，于倒置显微镜下观察计数，蓝色染色的为死细胞，不染色的为活细胞；，所述效应淋巴细胞扩增倍数达到114以上；优选的取苔盼兰染色计数后的3X106细胞，分三组，第一组分别添加到有20 μ LFITC标记鼠抗人⑶25单抗、20 μ LPE标记鼠抗人⑶4单抗和20 μ LPerCP标记鼠抗人⑶3单抗的离心管中；第二组分别添加20 μ LFITC标记鼠抗人⑶8单抗、20 μ L PE标记鼠抗人⑶56单抗和20 μ L PerCP标记鼠抗人⑶3单抗；第三组为同型对照，分别添加到有20 μ LFITC标记鼠IgGl、20 μ L PE标记鼠IgGl和20 μ L PerCP标记鼠IgGl ;置于4°C冰箱染色30分钟，然后用ImL的I X磷酸盐缓冲液PBS洗涤三次，最后用0.5mL的I XPBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur基本型流式细胞仪检测。本发明还提供用于快速增殖的效应淋巴细胞的试剂盒，其采用本发明所记载的方法使用。所述试剂盒包括:
A液:细胞基础培养基；B液:干扰素-Y ；C液:白介素-2;D液:白介素l-α ；还含FMS 样酪氨酸激酶 3 配体(FMS Like Tyrosine Kinase3Ligand, Flt3L)与抗人CD3单抗包被的培养瓶；以及使用说明书；Flt3L固化方法:包被的培养瓶选用25cm2或75cm2培养瓶，或塑料培养皿，或透气性培养袋，优选地，在0.lng-100ng/mL Flt3L和0.lug-20ug/mL抗人0)3单抗存在下(pH值7.4的I X PBS进行稀释)，4°C冰箱过夜，弃包被液，放置超净台中干燥，备用。本发明提供用上述本发明的快速增殖的效应淋巴细胞的试剂盒得到的含有CIK细胞的效应淋巴细胞。本发明的含有CIK细胞的效应淋巴细胞与用以往方法制得的含有CIK细胞的效应淋巴细胞相比，由于高比例地含有⑶3+⑶56+细胞，因此在生物体内发挥更强的细胞毒性，达到很好的治疗效果。此外，上述效应淋巴细胞还具有如下优点，即具有抑制细胞性免疫作用的调节性·T细胞(regulatory T cells ;Treg细胞)的含量低，因此非常利于在治疗上应用。以下，结合实施例对本发明做更具体的描述，但本发明不限于此。实施例一使用Flt3L包被的快速增殖的效应淋巴细胞体外培养:包被的培养瓶选用75cm2培养瓶(Corning公司)，使用pH值7.4的I XPBS稀释的15ng/mL Flt3L单独存在或与0.5ug/mL抗人⑶3单抗共同存在下，4°C冰箱过夜，弃包被液，放置超净台中干燥，备用。采集50mL正常捐献者外周血或脐带血(与其签署知情同意书)，采用Ficoll密度梯度离心分离得到的单个核细胞2-10X IO8ceIls,重悬悬在含有lOOOU/mLIFN-Y (美国Peprotech公司)和10 %自体血衆的RPMI1640培养基(美国Gibco公司)中，至
3-10 X IO6ceIls/mL，添加到已固定化75cm2培养瓶(Flt3L单独及其与抗人CD3单抗共同固定化)中，每瓶30mL，在5% CO2中在37°C下开始培养(培养第I天)。第2天(培养开始的次日)，向各培养瓶添加20mL含1200U/mL IL_2、400U/mLIL-1 α以及40%自体血浆的RPMI1640培养基，继续培养。第4天，向各培养瓶添加IOmL的完全RPMI1640培养基(含300U/mL IL-2U00U/mL IL-1a以及10%自体血浆)，继续培养。第6天,将各培养瓶内的细胞悬浮在培养基中全部收集,转移到未固定化的150cm2培养瓶(Corning公司)中或透气性培养袋(宝日医生物技术(北京)有限公司)。此时，添加完全RPMI1640培养基使每个培养瓶或每只袋子分别为IOOmL和600mL，在5% CO2中在37°C下培养。第8天和第10天，各培养瓶添加完全RPMI1640培养基进行扩瓶，每个培养瓶的培养液为150ml ;或向各袋子中添加完全RPMI1640培养基300mL进行继续培养至第16天。最终每只袋子的培养液为1500mL。培养到第16天，获得快速增殖的效应淋巴细胞，进行细胞活率和细胞表型检测；
计算培养最后一天的活细胞数，与培养开始时的细胞数进行比较，算出放大培养率。取ImL最后一天培养的培养液，1000rpm、4°C下离心10分钟，细胞用RPMI1640培养基重悬，取20ul细胞液用lXPBS(pH7.4)稀释20倍，稀释液加入I倍体积的苔盼兰溶液，混匀后加入到细胞计数板,于倒置显微镜下观察计数,蓝色染色的为死细胞,不染色的为活细胞。结果如图3所示，图3中表明本实施例快速增殖的效应淋巴细胞扩增倍数达到114.3倍。取苔盼兰染色计数后的3X 106细胞，分三组，第一组分别添加到有20 μ L FITC标记鼠抗人⑶25单抗、20 μ L PE标记鼠抗人⑶4单抗和20 μ L PerCP标记鼠抗人⑶3单抗的离心管中；第二组分别添加20yL FITC标记鼠抗人⑶8单抗、20 μ L PE标记鼠抗人⑶56单抗和20 μ L PerCP标记鼠抗人⑶3单抗；第三组为同型对照，分别添加到有20 μ LFITC标记鼠IgGl、20 μ LPE标记鼠IgGl和20 μ LPerCP标记鼠IgGl (BD公司)。置于4°C冰箱染色30分钟，然后用ImL的IX磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三次，最后用0.5mL的IXPBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur基本型流式细胞仪检测。取苔盼兰染色计数后的3X 106细胞，分三组，第一组分别添加到有20 μ L FITC标记鼠抗人⑶25单抗 、20 μ L PE标记鼠抗人⑶4单抗和20 μ L PerCP标记鼠抗人⑶3单抗的离心管中；第二组分别添加20yL FITC标记鼠抗人⑶8单抗、20 μ L PE标记鼠抗人⑶56单抗和20 μ L PerCP标记鼠抗人⑶3单抗；第三组为同型对照，分别添加到有20 μ L FITC标记鼠IgGl、20 μ L PE标记鼠IgGl和20 μ L PerCP标记鼠IgGl ;置于4°C冰箱染色30分钟，然后用ImL的I X磷酸盐缓冲液PBS洗涤三次，最后用0.5mL的I XPBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur基本型流式细胞仪检测。图1结果显示，⑶3+和⑶56+双阳性细胞大于40%，而⑶4+和⑶25+双阳性细胞小于3 %，表明通过本发明技术得到的效应淋巴细胞中含高比例的CIK细胞，而含调节性T细胞很低。实施二本发明所述制备方法获得效应淋巴细胞中调节性T细胞FoxP3检测取苔盼兰染色计数后的2 X 106细胞，分两管，每管加入2ml0.4%多聚甲醛，混匀后室温避光处理lOmin。500g离心5min，弃上清去除固定剂；每管再加入2mlI XPBS (pH7.4)洗涤，500g离心5min，弃上清，轻轻吹打重悬细胞于剩余的IXPBS中；破膜处理:每管加入
0.5ml破膜剂，混匀后室温避光处理30min ;用IXPBS洗涤细胞两次；胞内染色:第I管加入20ul同型对照Mouse IgGl-PerCP，第6管加入20ul鼠抗人FoxP3_PerCP抗体，室温避光染色30min ;用IXPBS洗涤细胞两；重悬细胞于300 μ 10.4%多聚甲醛，4°C保存，于24小时内分析上机分析。图2结果显示，Fox P3阳性细胞均小于3%，表明通过本发明技术得到的效应淋巴细胞中含调节性T细胞比例很低。实施三本发明技术方法与现有技术对比分析本发明技术方法按照实施例一中所述的制备流程；现有技术1，实施例1中培养瓶不进行Flt3L或及其与抗人⑶3单抗包被，即未固定化的培养瓶；具体制备方法见参考文献:Shi Y, Yu J，Cen X, ZhuP7Ma M.Large-capacityexpanded cytoline-1nduced killer cells and its cytotoxic activity.Sheng Wu YiXue Gong Cheng Xue Za Zh1.2001Mar ；18(1):94-6.
现有技术2，具体制备方法见参考文献:专利文献CN2009801129125:含有细胞因子诱导杀伤细胞的细胞群的制造方法。图3中结果表明本发明技术方法得到的效应淋巴细胞增殖倍数要明显高于现有技术。实施四本发明提供的用于快速增殖的效应淋巴细胞体外培养的试剂盒，所述试剂盒包括:A液:细胞基础培养基；B液:干扰素-Y ；C液:白介素-2;D液:白介素l-α ；还含FMS 样酪氨酸激酶 3 配体(FMS Like Tyrosine Kinase3Ligand, Flt3L)与抗人CD3单抗包被的培养瓶；以及使用说明书；试剂盒组分分装:试剂盒规格为I次/盒，各组分的量为:A液2000ml/l瓶，B液lml/1瓶，C液5ml/l瓶，D液lml/1瓶；分装后进行包装，得到快速增殖的效应淋巴细胞的
试剂盒。 试剂盒使用方法参见实施例一中培养得到效应淋巴细胞的制备流程。
权利要求
1.一种快速增殖的效应淋巴细胞的制备方法，其特征在于，包括如下工序:在FMS样酪氨酸激酶3配体单独存在或与抗人CD3单抗共同存在的固定化条件下，体外培养能快速增殖的效应淋巴细胞，所述效应淋巴细胞扩增倍数达到114以上。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在干扰素-Y、白介素-2和白介素-1 α存在下，以及FMS样酪氨酸激酶3配体和抗人CD3单抗的固定化条件下实施体外培养。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，固定化方法:包被的培养瓶选用25cm2或75cm2培养瓶，或塑料培养皿，或透气性培养袋，在0.1ng-lOOng/mL Flt3L和0.lug-20ug/mL抗人⑶3单抗存在下，4°C冰箱过夜，弃包被液，放置超净台中干燥，备用。
4.一种快速增殖的效应淋巴细胞的制备方法，其特征在于，其过程如下，包被的培养瓶选用75cm2培养瓶，使用pH值7.4的I X PBS稀释的15ng/mL Flt3L单独存在或与0.5ug/mL抗人⑶3单抗共同存在下，4°C冰箱过夜，弃包被液，放置超净台中干燥，制得已固定化75cm2培养瓶，备用； 采集50mL外周血或脐带血，采用Ficoll密度梯度离心分离得到的单个核细胞2-10X 108cells，重悬悬在含有1000U/mL IFN-Y和10%自体血浆的RPMI1640培养基中，至3-10X 106cells/mL,添加到上述已固定化75cm2培养瓶中，每瓶30mL,在5 % CO2中在37°C下开始培养，此时记为第I天； 第2天，向各培养瓶添加20mL含1200U/mL IL_2、400U/mL IL-1 α以及40%自体血浆的RPMI1640培养基，继续培养；第4天，向各培养瓶添加IOmL的含300U/mL IL_2、100U/mL IL-1 α以及10%自体血浆的完全RPMI1640培养基，继续培养； 第6天，将各培养瓶内的细胞悬浮在培养基中全部收集，转移到未固定化的150cm2培养瓶中或透气性培养袋；此时，添加完全RPMI1640培养基使每个培养瓶或每只袋子分别为IOOmL和600mL，在5% CO2中在37°C下培养； 第8天和第10天，各培养瓶添加完全RPMI1640培养基进行扩瓶，每个培养瓶的培养液为150ml ;或向各袋子中添加完全RPMI1640培养基300mL进行继续培养至第16天；最终每只袋子的培养液为1500mL ； 培养到第16天，获得快速增殖的效应淋巴细胞，进行细胞活率和细胞表型检测； 其中，细胞活率的测试方法为:计算培养最后一天的活细胞数，与培养开始时的细胞数进行比较，算出放大培养率；取11^最后一天培养的培养液，1000rpm、4°C下离心10分钟，细胞用RPMI1640培养基重悬，取20ul细胞液用I XPBS稀释20倍，稀释液加入I倍体积的苔盼兰溶液，混匀后加入到细胞计数板，于倒置显微镜下观察计数，蓝色染色的为死细胞，不染色的为活细胞；所述效应淋巴细胞扩增倍数达到114以上； 细胞表型的测试方法为:取苔盼兰染色计数后的3X IO6细胞，分三组，第一组分别添加到有20 μ L FITC标记鼠抗人⑶25单抗、20 μ L PE标记鼠抗人⑶4单抗和20 μ L PerCP标记鼠抗人⑶3单抗的离心管中；第二组分别添加20 μ LFITC标记鼠抗人⑶8单抗、20 μ L PE标记鼠抗人⑶56单抗和20 μ L PerCP标记鼠抗人⑶3单抗；第三组为同型对照，分别添加到有20 μ L FITC标记鼠IgGl、20 μ L PE标记鼠IgGl和20 μ L PerCP标记鼠IgGl ;置于4°C冰箱染色30分钟，然后用ImL的I X磷酸盐缓冲液PBS洗涤三次，最后用0.5mL的I XPBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur基本型流式细胞仪检测。
5.一种用于快速增殖的效应淋巴细胞体外培养的试剂盒，其特征在于，其采用如权利要求1-4中任一项所述的方法使用。
6.权利要求5所述试剂 盒在制备效应淋巴细胞中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种快速增殖的效应淋巴细胞的制备方法，其中包括如下工序在FMS样酪氨酸激酶3配体单独存在或与抗人CD3单抗共同存在的固定化条件下，培养能快速增殖的效应淋巴细胞，其扩增倍数达到114以上。本发明还提供了一种试剂盒，其中含通过上述方法而得到的试剂盒产品及其在制备快速增殖的效应淋巴细胞的用途。
文档编号C12N5/078GK103160464SQ201310118509
公开日2013年6月19日 申请日期2013年4月8日 优先权日2013年4月8日
发明者黄启明, 刘家森 申请人:宁波高新区世纪开元生物技术有限公司