专利名称：一种新的胃癌标志物及其检测方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于胃癌检测技术领域，涉及一种胃癌血清多肽标志物及其检测方法和应用。
背景技术：
目前全球每年新增胃癌患者93.4万，其中有近40万在中国内地。患病率和死亡率均超过世界平均水平的两倍。胃癌的发病率随年龄的增加而显著升高，发病的高峰年龄在50岁 80岁。近5年研究发现，中青年人的胃癌发病率迅速增加，19岁至35岁青年人胃癌发病率比30年前翻了一番。胃癌的主要治疗方法有早期切除、二期切除、局部消融、介入治疗及化疗、生物治疗、中药等综合治疗。绝大多数患者在确诊时已属晚期。术后易复发转移，放化疗效果也不理想，预后多不佳。因此，急需探索新的早期诊断和早期治疗的手段。血清诊断被认为是早期诊断癌症最新、最有效的方法。它是通过寻找血液中的肿瘤标志物特别是其中的蛋白标志来评判肿瘤的发生和发展情况，从而实现对肿瘤早期诊断。人类血清中存在大量蛋白和多肽，其中部分蛋白和多肽的存在和缺失以及表达的高低与人类健康程度密切相关，成为疾病诊断的生物标志物。而目前比较公认的肿瘤标记物有CEA、CA19-9、CA125、AFP、PSA等，但其对胃癌的筛查缺乏敏感性和特异性，因此并不能用于胃癌的诊断。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种胃癌血清多肽标志物及其检测方法和应用，该分子多肽为线粒体烯醇化酶超家族成员I (ENOSFl)的一个片段，是新的胃癌血清标志物。本发明是通过以下技术方案来实现:一种胃癌血清多肽分子，其氨基酸序列如SEQ.1D.N0.1所示。所述的胃癌血清多肽标志物，其血清当中的检测参数为0.67 0.78ng/mL。所述的胃癌血清多肽标志物作为胃癌血清诊断药物的靶点的应用。与所述的胃癌血清多肽标志物相结合的分子在胃癌血清诊断药物的制备的应用。ENOSFl蛋白作为胃癌血清诊断药物的靶点的应用。与ENOSFl蛋白相结合的分子在胃癌血清诊断药物的制备的应用。所述胃癌血清诊断药物为ELISA检测胃癌血清多肽标志物的药物。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果:本发明公开了一种胃癌血清多肽分子，其氨基酸序列如SEQ.1D.N0.1所不，该分子称为EN0SF1-A。ENOSFl-A为线粒体烯醇化酶超家族成员I (EN0SF1)的一个片段，其精确分子量为533 4.7道尔顿。ENOSFl-A在胃癌患者血清检测中呈现特异性的高表达:而在正常对照人群中血清中表达范围为:0.41 0.54ng/mL ;在胃溃疡病人血清中表达范围为:0.45 0.54ng/mL ;在胃癌患者血清中表达范围为:0.67 0.78ng/mL，且不同组间的表达具有极显著差异(P〈0.001)。
鉴于ENOSFl-A在胃癌血清中特异性高表达，那么EN0SF1-A就可以作为胃癌血清诊断标志物；且其母本蛋白ENOSFl在胃癌患者血清中呈现特异性的高表达，因此，ENOSFl可应用于胃癌患者血清诊断:用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(MALD1-T0F-MS)检测ENOSFl-A或ELISA方法测检测ENOSFl的表达水平，可作为胃癌患者检测的方法。而针对ELISA检测胃癌血清诊断，ENOSFl就可以作为ELISA检测药物的新的靶点。
图1为同一胃癌患者血清样本的三次重复的蛋白多肽图谱(IKDa IOKDa)；图2为蛋白多肽峰m/z:5335在胃癌患者和正常对照组中的蛋白多肽表达差异；图3为胃癌患者血清蛋白多肽混合物的凝胶色谱分离图；图4为ENOSFl-A的MS/MS质谱鉴定图谱；图5为不同组别中ENOSFl蛋白的表达水平。
具体实施例方式本发明提供的·胃癌血清多肽分子，是一种新筛选的胃癌血清诊断标志物，其表达具有特异性，可应用于胃癌诊断。下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。具体的该胃癌血清诊断标志物的筛选为:首先应用液体蛋白芯片技术分离提取胃癌患者和正常对照人群血清蛋白多肽，应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术捕获胃癌患者和正常对照人群蛋白多肽图谱，并且采用ClinPr0T00ls2.1软件对比分析胃癌患者和正常人群血清蛋白多肽谱图差异，找出组间显著差异表达的蛋白多肽分值，在胃癌患者血清中显著高表达的蛋白多肽峰值中筛出胃癌血清肿瘤标志物。对于所筛选的胃癌血清诊断标志物的验证为:应用HPLC将胃癌患者血清分离的蛋白多肽混合物分为20 30个组分，在对其进行二级质谱的鉴定，并且对鉴定出的蛋白多肽采用酶联免疫法进行血清回归分析，结果血清回归验证证明其在胃癌患者血清中显著高表达，具有特异性，可以作为胃癌患者血清筛查的生物标志物。1、样本的采集与处理:采集自西安交通大学第一附属医院肿瘤外科(2008年12月至2009年6月)的64例(男性32例；女性32例；平均年龄59岁)病理确诊的胃癌患者和32例正常对照人群(男性16例；女性16例；平均年龄56岁)。样本考虑年龄、性别、采集时间、储存条件是否一致、有无基础疾病等因素。被采集者晨起空腹采血，用真空采血管(黄帽、有隔离胶)采集全血5mL，室温静置30min ;室温离心5min (3000g)，将上层血清分装成100 μ L/管，立即保存于-80°C，避免反复冻融。1.2试剂与仪器血清蛋白的提取采用德国布鲁克公司的磁珠试剂盒“弱阳离子型”(MB-WCX)，以及光谱纯(HPLC级)乙腈、三氟乙酸(德国Merck公司)、α -氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)(美国Sigma公司)。
磁珠分离器、600/384AnchorChip祀板和AutoFlex III基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix Assisted Laser Desorption 1nization Time of Flight MassSpectrometry, MALD1-TOF-MS)(德国 Bruker Daltonics 公司)。2、血清蛋白样本的制备运用弱阳离子(MB-WCX)磁珠捕获血清蛋白多肽，具体操作步骤如下:①用混勻器完全混勻磁珠悬浮液Imin ；②加10 μ L MB-WCX结合液以及10 μ L MB-WCX磁珠至PCR管，混匀后加5 μ L血清，混勻至少5次,静置5min ；③将PCR管放入磁柱分离器，使磁珠贴壁lmin，液体清澈后弃上清液；④加100 μ L MB-WCX冲洗液，在磁柱分离器上前后移动10次PCR管，磁珠贴壁后弃上清液，重复步骤③、④两次；⑤加5 μ L MB-WCX洗脱液洗涤贴壁的磁珠，并反复吹打10次，磁珠贴壁2min，将上清液移入干净的尚心管；⑥加5yL MB-WCX稳定液至离心管并混匀，提取的蛋白多肽可以用于直接MALD1-TOF-MS检测或者冻存于_20°C冰箱24h之内质谱分析。2.2质谱分析将分离收集得到的蛋白样本IyL与IOyL的基质α -氰基-4-羟基肉桂酸混勻，取I μ L点在Anchorchip祀板上(德国Bruker公司),每个样本分别点三个祀点以作三次重复。待室温干燥后将靶板放入质谱仪进行飞行时间质谱分析，采用FleXContro12.0软件进行标准品校正后开始样本检测，每个样本要经过总共300次激光打靶(5次点靶，每次打靶2X30次)之后生成质谱图，获得由不同质核比(m/z)组成的蛋白多肽谱图。采用ClinProTools2.1软件结合遗传算法等生物统计学和生物信息学方法分析两组血清样本的蛋白多肽图谱。进行归一化平滑处理总离子流图，消除化学及电物理噪声；分析组间差异蛋白并计算差异大小，按差异大小由大到小排列，找出组间表达具有显著差异的蛋白多肽峰值(Ρ〈0.001)。将胃癌患者组和正常对照组血清样本采用磁珠分离系统处理后，经过MALD1-T0F-MS分析后，对胃癌患者组和正常对照组的每个样本进行蛋白多肽图谱绘制，在分子量范围IOOODa IOOOODa共检测到81个蛋白多肽峰图，且每个样本的三次重复稳定性较高，三个样本的检测结果如图1所示。采用ClinProTools〗.1软件对质谱捕获的胃癌患者和正常对照组的血清蛋白多肽图谱进行分析，将胃癌患者血清多肽谱图与正常人群进行比较分析，共检测到13个具有极显著差异的蛋白多肽峰图(P〈0.001)，其中13个蛋白多肽峰图在两组间具有极显著差异(P〈0.001)，其中7 个蛋白多肽在胃癌患者中表达显著下调，其余6个蛋白多肽在胃癌患者中表达显著上调，具体如表I所示。
权利要求
1.一种胃癌血清多肽标志物，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ.1D.N0.1所示。
2.如权利要求1所述的所述的胃癌血清多肽标志物，其特征在于，其血清当中的检测参数为 0.67 0.78ng/mL。
3.权利要求1所述的胃癌血清多肽标志物作为胃癌血清诊断药物的靶点的应用。
4.与权利要求1所述的胃癌血清多肽标志物相结合的分子在胃癌血清诊断药物的制备中的应用。
5.ENOSFl蛋白作为胃癌血清诊断药物的靶点的应用。
6.与ENOSFl蛋白相结合的分子在胃癌血清诊断药物的制备的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述胃癌血清诊断药物为ELISA检测胃癌血清多肽分子的药物。
全文摘要
本发明公开了一种新的胃癌标志物及其检测方法。其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。该分子称为ENOSF1-A，为线粒体烯醇化酶超家族成员1(ENOSF1)的一个片段，其精确分子量为5334.7道尔顿ENOSF1-A在胃癌患者血清检测中呈现特异性的高表达，用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)检测ENOSF1-A或ELISA方法测检测ENOSF1的表达水平，可作为胃癌血清的检测方法。
文档编号C12N9/88GK103224922SQ201310126020
公开日2013年7月31日 申请日期2013年4月11日 优先权日2013年4月11日
发明者杨娟, 黄辰, 宋土生, 倪磊 申请人:西安交通大学