胃癌标志物与胃癌检测方法

专利名称：胃癌标志物与胃癌检测方法
技术领域：
公开的主体通常涉及胃癌标志物和胃癌检测方法。
背景技术：
注意到了以下现有技术的出版物Busslinger, M. , Klix, N. , Pfeffer, P. , Graninger, P. G. , & Kozmik, Z. (1996).Deregulation of PAX-5 by translocation of the Emu enhancer of the IgH locusadjacent to two alternative PAX-5 promoters in a diffuse large-cell lymphoma(在弥散大细胞淋巴瘤中通过两个可选PAX-5启动子相邻的IgH基因组的Emu增强子的转位而下调 PAX-5). Proc Natl Acad Sci U S A，93 (12)，6129-6134. Livak, K. J. , & Schmittgen, T. D. (2001). Analysis of relative geneexpression data using real-time quantitative PCR and the 2 (-Delta Delta C(T))
(利用实时定量PCR和2(_A AC(T))分析相关基因表达数据)Method. Methods, 25 (4),402-408.Takai, D. , & Jones, P. A. (2002). Comprehensive analysis of CpG islands inhuman chromosomes 21 and 22 (人类染色体 21 和 22 中 CpG 岛的综合分析) Proc NatlAcad Sci U S A，99 (6)，3740-3745.Takai, D. , & Jones, P. A. (2003). The CpG island searcher a new Wffffresource (CpG 岛搜索工具新的网络资源).In Silico Biol, 3 (3), 235-240.Tao, Q. , Huang, H. , Geiman, T. M. , Lim, C. Y. , Fu, L. , Qiu, G H. , et al. (2002).Defective de novo methylation of viral and cellular DNA sequences in ICFsyndrome cells (ICF综合症细胞中病毒和细胞DNA序列的重新甲基化缺陷).Hum MolGenet,11(18),2091-2102.US2004248171Palmisano and Belinsky，于 2004 年 3 月 25 号提交，其中公开了利用PAX5作为肺癌、结肠癌和乳腺癌的标志物。US2010028875 Rhytu et al，于2006年8月19日作为PCT申请提交,其中公开了通过测定甲基化水平来诊断癌症和确定预后的方法。发明概述在一个实施方案中，公开了诊断或确定来自患者的生物样品中胃癌的预后的方法，所述方法包括以下步骤检测所述样品中与由SEQ. ID. NO. 24组成的区域至少95%相似的连续序列中的至少15个连续碱基对的靶DNA序列的甲基化；并且其中显著的甲基化水平指示胃癌的不良预启。在一个实施方案中，所述靶序列的长度可以为至少50个碱基对并含有多个CpG碱基对。在一个实施方案中，所述方法还可以包括将患者样品中靶序列的甲基化水平与非癌细胞的甲基化水平进行比较。在一个实施方案中，所述确定可以包括用能差异性地修饰甲基化的DNA和非甲基化的DNA的试剂处理样品。在一个实施方案中，所述区域可以由SEQ. ID. NO. 11组成。在一个实施方案中，所述确定可以包括用硫酸氢钠处理样品。在一个实施方案中，可以通过COBRA、BGS或MSP进行所述确定。在一个实施方案中，所述样品是血液样品。在一个实施方案中，所述样品是粪便样品。在一个实施方案中，所述确定包括以下步骤使用根据SEQ. ID. NO. 24中的含CpG的基因组序列所选择的引物来扩增用限制性酶处理的DNA ;和将未知样品中基因组序列的扩增部分的水平与非癌样品的甲基化水平进行比较，从而检测胃癌的存在。 在一个实施方案中，所述试剂包括优先切割非甲基化的DNA的酶。在一个实施方案中，所述扩增使用聚合酶链反应。在一个实施方案中，所述检测可以使用选自以下的引物或探针SEQ. ID. NO. 1、2、5、6、7、8、9、10、15、16、17、18、19、20 和 22。在一个实施方案中，公开了分离的核酸序列，其与SEQ. ID. NO. 24的10个连续碱基对的区域至少约95%相似。在一个实施方案中，所述分离的序列与SEQ. ID. NO. 11的约20个连续碱基对的区域至少99%相似。在一个实施方案中，公开了检测患者样品中的胃癌的方法，该方法包括检测所述样品中与SEQ. ID. NO. 13在至少约15个连续碱基上至少95%相似的RNA序列的表达，其中与正常或对照样品(例如从非癌细胞或组织样品、从正常胃粘膜提取的RNA样品)相比，所述序列的mRNA水平显著下调的表达指示胃癌的存在。在一个实施方案中，公开了抑制胃癌细胞发展的方法，所述方法包括以下步骤在所述癌细胞中表达SEQ. ID. NO. 23的生物学有效部分，从而抑制所述细胞的生长。在一个实施方案中，所述表达包括将所述胃癌细胞中与SEQ. ID. NO. 24在至少15个连续碱基对上具有至少95%序列相似性的DNA序列脱甲基。在一个实施方案中，所述表达包括将分离的DNA分子引入所述细胞，所述分离的DNA分子适于表达与SEQ. ID. NO. 23在约50个连续氨基酸上至少约95%相似的蛋白。在一个可选实施方案中，公开了治疗个体中胃癌的方法，该方法可以包括以下步骤用适于在所述癌细胞中表达SEQ. ID. NO. 12,SEQ. ID. NO. 13或SEQ. ID. NO. 23的生物学有效部分的组合物治疗患者，从而抑制所述细胞的生长。在一个可选实施方案中，公开了治疗个体中胃癌的方法，该方法包括在所述癌细胞中表达SEQ. ID. NO. 12,SEQ. ID. NO. 13或SEQ. ID. NO. 23的生物学有效部分，从而抑制所述细胞的生长。在可选实施方案中，可以将所述生物学有效序列直接引入所述癌细胞。在可选实施方案中，公开了试剂盒，所述试剂盒包含本文公开的用于实施本发明的方法的序列或试剂。根据以下所选实施方案的详细描述并结合附图，本发明主题的特征和优点会变得更清楚。应当意识到，所公开的和要求保护的主题能够在不脱离权利要求的范围的情况下在不同方面进行修改。因此，附图和描述应被理解为说明的性质而不是作为限制，主题的全部范围如权利要求所述。附图概述图I显示了一个实施方案中的PAX5CpG岛。图2显示了一个实施方案中细胞系中PAX5 mRNA表达。图3显示了一个实施方案中脱甲基剂对PAX5表达的影响。图4显示了一个实施方案中胃癌细胞和相邻正常组织的配对样品中的相对PAX5表达水平。图5显示了一个实施方案中转染的细胞系中PAX5mRNA的相对水平。
图6显不了一个实施方案中细胞中的外源PAX5表达。图7显示了一个实施方案中PAX5表达对转染的细胞在集落形成测定中的影响。图8显示了一个实施方案中来自肿瘤和正常的人胃组织的甲基化百分比。图9显示了一个实施方案中细胞中PAX5CpG岛的甲基化状态。

图10显示了一个实施方案中PAX5的甲基化的接受者操作特征(ROC)曲线。图11显示了一个实施方案中胃癌患者存活的Kaplan-Meier分析。实施方案详细描述术语在本公开中，以下术语具有下文所示的含义在本公开中，术语“或”通常的含义包括“和/或”，除非文中内容明确表明并非如此。在本公开中，术语“生物标志物”或“标志物”表示与疾病相关的诸如基因的物质或变量测量，所述物质或变量测量可以作为该疾病的指示物或预测物。生物标志物或标志物是参数，从中可以推知疾病的存在或风险，而不是疾病自身的量度标准。在本公开中，术语“核酸”、“核酸序列”以及相似术语表示多核苷酸，其可以是gDNA、cDNA或RNA，并且可以是单链的或双链的。该术语还包括肽核酸(PNA)，或任何化学上的DNA类似物或RNA类似物。“cDNA”是指由细胞中天然存在的mRNA制备而来的拷贝DNA。“gDNA”是指基因组DNA。以上的组合也是可能的(即，部分是gDNA且部分是cDNA的重组核酸)。在本公开中，术语“可操作地相连”和“可操作地连接”表示功能上连接的核酸序列。在本公开中，术语“严紧的杂交条件”和“高严紧性”是指探针与其靶标子序列杂交而不与其它序列杂交时的条件，所述靶标子序列通常处于核酸的复合混合物中。严紧的条件是序列依赖性的，并且在不同情况下会不同。较长的序列在较高的温度下特异性地杂交。核酸杂交的广泛指导见于 Ti jssen, Techniques in Biochemistry and MolecularBiology—Hybridization with Nucleic Probes (生物化学和分子生物学技术-核酸探针的杂交)，"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleicacid assays (杂交原理和核酸测定策略的概述)"(1993),并且会被本领域技术人员容易理解。通常，将严紧的条件选择为低于在限定的离子强度、PH下具体序列的热熔点(Tm)约5-10°C。Tni是平衡时与靶标互补的探针中的50%与靶序列杂交的温度(在限定的离子强度、PH和核酸浓度下)(因为靶序列是过量存在的，所以在Tni下，在平衡时，50%的探针被占据)。添加例如甲酰胺的去稳定剂也可以实现严紧的条件。对于选择性杂交或特异性杂交，阳性信号至少是背景的2倍，优选为10倍于背景的杂交。示例性的严紧杂交条件可以如下50% 甲酰胺，5XSSC和 1% 303，421下孵育，或5\33(，1% SDS，65°C下孵育，在 65°C下0. 2X SSC和0. 1% SDS中洗涤。对于在严紧的条件下不彼此杂交的核酸，如果它们编码的多肽是基本上相同的，则所述核酸仍然是基本上相同的。例如，当使用遗传密码所允许的最大密码子简并性产生核酸拷贝时，会发生这种情况。在这些情况下，所述核酸通常在中等严紧的杂交条件下杂交。示例性的“中等严紧的杂交条件”包括在37°C下、40%甲酰胺、IM NaCl、l%SDS的缓冲液中杂交，以及在45°C下IXSSC中洗涤。阳性杂 交至少是背景的两倍。本领域技术人员会容易地认识到，可选的杂交和洗涤条件可以用于提供相似的严紧性条件。用于确定杂交参数的其它指导在很多参考文献中提供，例如，Current Protocols in MolecularBiology (现代分子生物学实验方法)，ed. Ausubel, et al.。对于PCRJ^ 36°C的温度通常用于低严紧性扩增，但是根据引物长度，退火温度可以在约32°C _48°C变化。对于高严紧性PCR扩增，通常是约62°C的温度，但是根据引物长度和特异性，高严紧性退火温度可以为约50°C -约65°C。高和低严紧性扩增的通常的循环条件包括持续30秒-2分钟的90°C -95°C的变性期，持续30秒-2分钟的退火期，和持续1_2分钟的约72°C的延伸期。低和高严紧性扩增反应的方法和指导是本领域公知的，并且提供于，例如 Innis et al. (1990)PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications (PCR手册_方法和应用指南)，Academic Press, Inc. N. Y.。在本公开中，术语“多肽”表示由核酸分子编码的多肽。在本公开中，术语“基因表达”和“蛋白表达”表示并包括涉及样品中存在的基因转录本或蛋白的量的任何信息，以及关于基因、RNA或蛋白表达或积累或降解的速率的信息(例如，报告基因数据、核失控实验的数据、脉冲追踪数据等)。某些种类的数据可以视为与基因和蛋白表达都有关。例如，细胞中的蛋白水平反映蛋白水平以及转录水平，并且意图将这样的数据包括在短语“基因或蛋白表达信息”中。可以以每个细胞的量，相对于对照基因或蛋白的量，无单位测量等形式给出这样的信息；术语“信息”不应限制为任何特定表示手段，并且意图表示提供相关信息的任何表示。术语“表达水平”是指基因或蛋白表达数据中反映出的或从基因或蛋白表达数据中推断出的量，无论该数据是关于基因转录本积累或蛋白积累或蛋白合成速率等。在本公开中，术语“多肽”表示由两个或更多个氨基酸、优选多于三个氨基酸组成的分子。其确切的大小取决于很多因素。在本公开中，术语“寡核苷酸”表示由两个或更多个核苷酸，优选多于三个核苷酸组成的分子。寡核苷酸确切的大小取决于很多因素，反过来，这些因素取决于寡核苷酸的最终功能和用途。在具体实施方案中，寡核苷酸的长度可以为约10个核苷酸-100个核苷酸或10和100之间的任何整数。在实施方案中，寡核苷酸的长度可以为约10-30个核苷酸，或长度可以为约20-25个核苷酸。在实施方案中，为了特异性，寡核苷酸的长度可以大于约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 或 25 个核苷酸。在某些实施方案中，短于这些长度的寡核苷酸可以是合适的。在本公开中，术语“引物”表示当置于能诱发与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下，即在核苷酸和诸如DNA或RNA聚合酶的诱发剂的存在下并且在合适的温度和pH下，能够作为合成起始点的寡核苷酸，无论它是纯化的限制性消化物中天然存在的或合成产生的。引物可以是单链或双链的，并且必须足够长而使其在诱发剂的存在下能引发所需延伸产物的合成。引物的确切长度取决于多种因素，包括温度、引物来源和所用的方法。例如，为了诊断和预后应用，根据靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有至少或多于约10、或15、或20、或25或更多个核苷酸，但是其可以含有更少核苷酸或更多核苷酸。参与确定引物合适长度的因素是本领域技术人员熟知的。具体实施方案中所用的引物如本公开的表I. I所示，其中标明了它们的具体应用。在本公开中，术语“引物对”表示与靶DNA分子相反链杂交或与侧翼连接待扩增的核苷酸序列的靶DNA区域杂交的引物对。在本公开中，术语“引物位点”表示引物杂交的靶DNA或其它核酸的区域。在本公开中，所描述的和要求保护的核酸、多核苷酸、蛋白和多肽是指所有形式的核酸和氨基酸序列，包括但不限于如下所述的基因组核酸、前mRNA、mRNA、多肽、多肽、多态性变体、等位基因、突变体和种间同系物(I)具有或编码与由参考核酸编码的多肽或本文所述的氨基酸序列在优选至少约25、50、100、200、500、1000或更多个氨基酸的区域上具有大于约60%氨基酸序列同一性、65%、70%、75%、80%、85%、90%、优选 91 %、92 %、93 %、94 %、95 %、96 %、97 %、98 % 或
99%或更高的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；(2)特异性地结合或编码与诸如多克隆抗体的抗体特异性地结合的多肽，所述抗体是针对包含参考氨基酸序列、其免疫原性片段以及保守型修饰的变体的免疫原产生的；(3)在严紧的杂交条件下与公开的核酸序列或编码公开的氨基酸序列以及其保守型修饰的变体的核酸序列特异性地杂交； (4)具有与参考核酸序列在优选至少约15、25、50、100、200、500、1000或更多核苷酸的区域上具有大于约95%、优选大于约96%、97%、98%、99%或更高的核苷酸序列同一性的核酸序列。多核苷酸或多肽序列通常来自哺乳动物，包括但不限于，灵长类，例如人；啮齿动物，例如，大鼠、小鼠、仓鼠；牛、猪、马、羊或任何哺乳动物。在具体实施方案中，公开的多核苷酸和多肽序列来自人。本发明的核酸和蛋白包括天然存在的分子或重组分子。在本公开中，术语“生物样品”或“样品”包括诸如活检和尸检样品的组织切片、和为了组织学目的而获取的冷冻切片、或任何这些样品的处理后形式。生物样品包括血液和血液组分或产物(例如血清、血浆、血小板、红细胞等)，痰液或唾液，淋巴和舌组织，诸如原代培养物、外植体和转化的细胞的培养的细胞，粪便，尿液，胃活检组织等。生物样品通常获自真核生物，所述真核生物可以是哺乳动物，可以是灵长类并且可以是人类个体。在本公开中，术语“活检”是指为了诊断或预后评估取出组织样品的过程，并且也指组织样本自身。本领域已知的的任何活检技术可以用于本发明的诊断和预后方法。所用的活检技术取决于待评估的组织类型(例如舌、结肠、前列腺、肾、膀胱、淋巴结、肝、骨髓、血细胞、胃组织等)等因素。代表性的活检技术包括但不限于切除活检、切去活检、针吸活检、手术活检和骨髓活检，并且可以包括结肠镜检查。多种活检技术是本领域技术人员公知的，他们需要进行很少的实验便可以从这些技术中选择并使用。
在本公开中，术语“分尚的”核酸分子表不从通常与该分尚的核酸分子相关联的其它核酸分子中分尚出的核酸分子。因此，“分尚的”核酸分子包括但不限于这样的核酸分子其不具有在分离的核酸来源于的生物体的基因组中天然地侧翼连接该核酸的一个或两个末端的序列(例如，通过PCR或限制性核酸内切酶消化而产生的cDNA或基因组DNA片段)。通常将这样的分离的核酸分子引入载体(例如，克隆载体或表达载体)，以便于操控或产生融合核酸分子。此外，分尚的核酸分子可以包括工程化的核酸分子，例如重组的或合成的核酸分子。存在于例如核酸文库(例如cDNA或基因组文库)或含有限制性消化的基因组DNA的凝胶(例如，琼脂糖或聚丙烯酰胺)的一部分中的数百至数百万其它核酸分子中的核酸分子不被认为是分离的核酸。在本公开中，“细胞”可以是分离的，可以被包含在细胞群体中，可以在培养物中，或可以被包含在活的个体中，并且可以是哺乳动物细胞，且可以是人的细胞。同样，“组织”可以包括任何数目的细胞，并且可以被包含在活的个体中或可以从其中被分离出。在本公开中，“癌症”表示并包括任何恶性肿瘤(malignancy)、或恶性细胞分裂或 恶性肿瘤(malignant tumour),或具有不受控制的或不适当的细胞增殖的任何疾病状态，并且包括但不限于特征为不受控制的或不适当的细胞增殖的任何疾病。在本公开中，术语“胃癌(gastric cancer)”和“胃癌(stomach cancer)”具有相同含义，并且表示胃或胃细胞的癌症。这些癌症可以是发生于胃的内层(粘膜)并且可以发生于胃的幽门部、胃体部或贲门部(下部、体部和上部)的腺癌。在本公开中，术语“胃癌细胞”表示具有胃癌特征的细胞，并且包括癌症前期细胞。在本公开中，术语“癌症前期”表示处于转化为癌细胞的早期阶段或倾向于转化为癌细胞的细胞。这样的细胞可以表现出一种或多种具有癌细胞特征的表型性状。在本公开中，术语“纯化的”或“基本纯化的”，当用来指核酸或多肽时，表示从它们的天然环境中分离出的核酸或多肽，使得它们占给定样品中全部核酸或多肽或有机化学物的至少约75 %、80 %、85 %、90 %或95 %。本文中，可以通过SDS-PAGE和银染评估蛋白纯度。可以通过琼脂糖凝胶和EtBr染色评估核酸纯度。在本公开中，术语“检测”表示观察生物样品中的标志物或标志物改变(例如标志物甲基化状态的改变或核酸或蛋白序列的表达水平)的任何过程，无论实际上是否检测到标志物或标志物改变。换言之，探测样品的标志物或标志物改变的行为是“检测”，即使标志物被测定为不存在或低于灵敏度水平。检测可以是定量、半定量或非定量观察，并且可以基于与一个或多个对照样品的比较。应当理解，检测本文公开的结肠癌包括检测癌症前期细胞，所述癌症前期细胞开始发展为结肠癌细胞或将要发展为结肠癌细胞，或具有增加的发展为结肠癌细胞的倾向。检测结肠癌还可以包括检测可能的死亡概率或疾病条件的可能的预后。在本公开中，术语“表达载体”表示可复制的DNA构建体，所述DNA构建体用于表达编码所需蛋白或RNA序列的DNA并且包括转录单元，所述转录单元包含以下的组装(1)在基因表达中具有调节作用的基因元件，例如启动子、操纵子或增强子，所述基因元件与(2)编码所需蛋白(在本文情况下为PAX5蛋白)的DNA序列可操作地连接，所述DNA序列被转录为mRNA和翻译为蛋白，和(3)合适的转录和翻译起始和终止序列。启动子和其它调节元件的选择通常根据预期的宿主细胞而不同。通常，重组DNA技术中表达载体的应用常常是“质粒”的形式或病毒序列的形式，质粒是指环状双链DNA环，其在载体形式时不与染色体结合；病毒序列可以或可以不整合到染色体中。多种表达载体是本领域技术人员能容易识别并进行使用的。在本公开中，术语“同源性”、“同一性”和“相似性”表示2个肽或2个核酸分子之间的序列相似性。可以比较每个序列中的位置来测定“同源性”、“同一性”或“相似性”，为了比较的目的可以将所述序列进行比对。当比较的序列中的等同位置被相同碱基或氨基酸占据时，所述分子在该位置是相同的；当等同位点被相同或相似氨基酸(例如，在空间性质或带电性质上相似)残基占据时，所述分子可以称为在该位置是同源的(相似的)。同源性/相似性或同一性百分比的表达是指比较的序列所共享的位置上相同或相似氨基酸的数量的函数。“无关的”或“非同源的”序列与本发明的序列共享小于40%同一性，优选小于25%同一性。在比较2个序列时，残基(氨基酸或核酸)的缺失或多余残基的存在也降低同一性和同源性/相似性。在具体实施方案中，对于两个或更多个序列或子序列，按照使用具有下文所述的默认参数的BLAST或BLAST 2. 0序列比较算法进行测定或通过例如 国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information(NCBI))在线提供的手动比对和肉眼检查进行测定，当在比较窗或指定区域上为最大对应性进行比较和比对时，如果它们的序列在规定的区域上同一性为约60 %，或约65 %、70%、75%、80 %、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高，可以认为是基本或显著同源的、相似的或同一的。该定义也涉及或可以用于测试序列的互补物。因此，在本文背景允许的程度下，例如，如果核苷酸序列可以被预测为天然存在于DNA双链体中，或可以以互补链中的一条或两条的形式天然存在，则与规定靶序列或其变体互补的核苷酸序列自身被视为与靶序列是“相似的”，并且当涉及“相似的”核酸序列时，包括单链序列、其互补序列、双链的链复合物、能够编码相同或相似多肽产物的序列、以及上述任意一项的任何容许的变体。相似性必须限制为单一核酸链序列的分析的情况可以包括例如细胞中特定RNA序列或编码序列的表达的检测和定量。该定义还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的序列。在实施方案中，同一性或相似性可以是在长度为至少约10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19、10、21、22、23、24、25或更多氨基酸或核苷酸的区域上，或在长度为多于约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或多于约 100 个氨基酸或核苷酸的区域上。在本公开中，术语“甲基化敏感PCR” (即，MSP)表示进行化合物转化的模板序列的扩增的聚合酶链反应。设计两套引物用于MSP。每套引物包括正向引物和反向引物。如果靶DNA中CpG 二核苷酸的C碱基是甲基化的，则称为甲基化特异性引物的一套引物扩增化合物转化的模板序列。如果靶DNA中CpG 二核苷酸的C碱基是非甲基化的，称为非甲基化特异性引物的另一套引物扩增化合物转化的模板序列。在本公开中，术语“抑制(inhibit) ”和“抑制(suppress) ”，当涉及癌细胞或癌细胞的生长或发展时，表示并包括导致或包括以下的任何效应减缓或防止细胞的生长或细胞分裂、杀死细胞、使细胞失去功能以及以任何方式降低细胞的活力、分裂速率或寿命，并且包括更具良性细胞群体的性质而不具有恶性细胞群体的性质的方式改变细胞特征的任何代谢改变。在本公开中，“抗体”是指包含来自免疫球蛋白基因或其片段的框架区的多肽，其特异性地结合和识别抗原。公认的免疫球蛋白基因包括K、入、a、Y、S、e和ii恒定区基因以及多种免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为K或:V。重链被分类为Y、ii、a、S或e，这些分类进一步分别限定了免疫球蛋白种类IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。通常，抗体的抗原结合区在结合的特异性和亲和力中是最关键的。抗体可以是多克隆的或单克隆的，可以来源于血清、杂交瘤或可以是重组克隆的，并且抗体还可以是嵌合的、灵长动物源化的或人源化的。例如，抗体以完整免疫球蛋白或多种良好表征的片段存在，可以通过各种肽酶的消化而产生所述片段。本文所用的术语抗体包括完整抗体以及抗体片段，所述抗体片段通过全抗体的修饰或使用重组DNA方法从头合成(例如单链Fv)或使用噬菌体展示文库鉴定的那些。在本公开中，术语“特异性地(或选择性地)结合”抗体或“特异性地(或选择性地)与…发生免疫反应”，当涉及蛋白或肽时，是指由通常蛋白的异质群体和其它生物制剂中的蛋白的存在而决定的结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，特异性抗体与特定蛋白的结合至少是背景的2倍，并且更通常是大于背景10-100倍。在该条件下与抗体的特异性结合需要根据其对特定蛋白的特异性而选择的抗体。例如，可以选择多克隆抗体来获得仅与所选抗原发生特异性地免疫反应而不与其它蛋白发生免疫反应的那些多克隆抗体。可 以通过剔除与其它分子发生交叉反应的抗体来实现这种选择。多种免疫测定形式可以用于选择特异性地与特定蛋白发生免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定是常规用于选择特异性地与蛋白发生免疫反应的抗体。在本公开中，术语“扩增”表示由核酸的一个具体基因座得到多个拷贝的过程，所述核酸例如基因组DNA或cDNA。可以使用多种已知手段中的任何一种实现扩增，所述手段包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、基于转录的扩增和链置换扩增(SDA)。在本公开中，术语“聚合酶链反应”或“PCR”表示这样的技术变性、与引物的退火和与DNA聚合酶的延伸的循环被用于将靶DNA序列的拷贝数扩增至约IO6倍或更多。用于扩增核酸的聚合酶链反应过程可参见美国专利第4，683，195号和第4，683，202号。在本公开中，术语“保守型修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。对于具体核酸序列，保守型修饰的变体是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的核酸，或当核酸不编码氨基酸序列是，保守型修饰的变体是指基本上相同的序列。由于遗传密码具有简并性，所以大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白。例如，密码GCA、GCC、GCG和GCU都编码丙氨酸。因此，在由密码子规定为丙氨酸的每个位置，可以将该密码子改变为任何上述对应的密码子而不会改变所编码的多肽。这类核酸变异是“沉默变异”，是保守型修饰变异的一种。本文中，编码多肽的每个核酸序列也描述了该核酸的每个可能的沉默变异。本领域技术人员应当意识到，可以修饰核酸中的每个密码子(除了 AUG和TGG，AUG通常是蛋氨酸的唯一密码子，TGG通常是色氨酸的唯一密码子)来产生功能相同的分子。因此，当涉及表达产物而不涉及实际探针序列时，编码多肽的核酸的每种沉默变异隐含在每个所述序列中。对于氨基酸序列，本领域技术人员应当意识到，改变、添加或缺失编码序列中单个氨基酸或少量百分比的氨基酸的对核酸、肽、多肽或蛋白序列进行的分别的取代、缺失或添加是“保守型修饰的变体”，其中所述改变导致氨基酸被化学上相似氨基酸所取代。提供功能相似的氨基酸的保守型取代列表是本领域公知的。所述保守型修饰的变体是除本发明的多态性变体、中间同系物和等位基因之外的变体并且不排除是本发明的多态性变体、中间同系物和等位基因。下述8组中，每一组含有可彼此保守型取代的氨基酸1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E) ；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q) ；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，缬氨酸(V) ；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W) ；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)，蛋氨酸(M)(参见，例如，Creighton,Proteins(1984))。在本公开中，“标记”或“可检测的部分”是可通过分光镜、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组分。例如，有用的标记包括32P、荧光染料、电子致密试齐U、酶(例如，ELISA中常用的酶)、生物素、地高辛或半抗原和可以被制备为可检测的蛋白，例如，通过将放射性标记并入肽或用于检测与肽特异性反应的抗体。在本公开中，术语“重组”，当涉及例如细胞、核酸、蛋白、或载体时，表示已经通过引入异源核酸或蛋白或改变天然核酸或蛋白对所述细胞、核酸、蛋白或载体进行了修饰，或 表示所述细胞来源于按此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达不见于细胞的天然(非重组)形式中的基因，或表达异常表达的、低表达的或根本不表达的天然基因。某些序列的排除应当理解，在具体实施方案中，可以排除序列、探针、引物、多肽等的个别实例。核酸和多肽的检测检测具体核酸序列和多肽及其应用的多种方法对于本领域技术人员是显而易见的。可以使用多种不同方法检测核酸分子和多肽。核酸检测方法包括，例如，PCR和核酸杂交(例如，Southern印迹、Northern印迹或原位杂交)。具体而言,能够扩增祀核酸的寡核苷酸(例如，寡核苷酸引物)可以用于PCR反应。PCR方法通常包括以下步骤获得样品、从所述样品分离核酸(例如，DNA、RNA或两者)和使所述核酸与一种或多种寡核苷酸引物接触，所述引物在能使模板核酸扩增发生的条件下特异性地与模板核酸杂交。在模板核酸的存在下，产生扩增产物。核酸扩增和扩增产物检测的条件是本领域技术人员已知的。已开发出多种对于基础PCR技术的改进，包括但不限于，锚定PCR、RACE PCR、RT-PCR和连接酶链式反应(LCR)。扩增反应中的引物对必须与模板核酸的相对链退火，并且应该彼此保持合适的距离，使得聚合酶能有效地跨过区域进行聚合并使得可以例如使用电泳来容易地检测扩增产物。例如，可以使用诸如 0LIG0(Molecular Biology Insights Inc. ,Cascade,Colo.)的计算机程序来设计寡核苷酸引物，以助于设计具有相似熔解温度的引物。通常，寡核苷酸引物长度为10-30或40或50个核苷酸(例如，长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸)，但是寡核苷酸引物可以更长或更短，只要使用合适的扩增条件。在本公开中，术语“标准扩增条件”是指扩增反应混合物的基本组分和循环条件，所述循环条件包括模板核酸变性、寡核苷酸引物与模板核酸退火和通过聚合酶的引物延伸以产生扩增产物的多个循环。通常使用可检测的标记实现扩增产物或杂交复合物的检测。术语“标记”，当涉及核酸时，意图包括通过将可检测的物质偶联(即，物理连接)至核酸的核酸直接标记，以及通过与直接标记了可检测的物质的另一试剂进行反应的核酸间接标记。可检测的物质包括各种酶、辅基、荧光材料、冷光材料、生物冷光材料和放射性材料。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、3 -半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括抗生物素蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯代三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；冷光材料的实例包括鲁米诺；生物冷光材料的实例包括荧光素酶、虫荧光素和水母蛋白；合适的放射性材料的实例包括125I、131I、35S或3h。间接标记的实例包括用生物素将核酸进行末端标记，使得可以用荧光标记的抗生物素蛋白链菌素检测该核酸。可以使用多克隆或单克隆抗体来检测具体多肽序列，可以以本领域技术人员容易理解并应用的常规方式来制备所述抗体。本领域技术人员可容易地鉴定和制备并产生对于所需多肽序列的抗体来实施所公开的和要求保护的主题。 术语“探针”，当涉及核酸序列时，以其通常含义使用，表示在规定条件下能与靶序列杂交并且可以用于检测该靶序列的存在的选择的核酸序列。本领域技术人员应当理解，在某些情况下，探针也可以用作引物，并且引物可以用作探针。甲基化在本公开中，DNA “甲基化”是指甲基添加到胞嘧啶(C)的5位，这通常(但不必须)是在CpG(胞嘧啶之后为鸟嘌呤)二核苷酸的情况下。本文所用的“增加的甲基化水平”或“显著的甲基化水平”是指DNA序列中至少存在一个甲基化的C核苷酸，其中正常对照样品(例如从非癌细胞或组织样品提取的DNA样品或对DNA残基的甲基化进彳丁处理的DNA样品)中的对应C是非甲基化的，在某些实施方案中，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个C可以是甲基化的，其中对照DNA样品中的这些位置的C是非甲基化的。在实施方案中，多种不同的方法可用于检测DNA甲基化改变。检测DNA甲基化的方法包括，例如，利用southern或聚合酶链反应(PCR)分析的甲基化敏感的限制性内切核酸酶(MSRE)测定、甲基化特异性或甲基化敏感的PCR(MS-PCR)、甲基化敏感的单核苷酸引物延伸(Ms-SnuPE)、高分辨率熔解(HRM)分析、重亚硫酸盐测序、焦磷酸测序、甲基化特异性单链构象分析(MS-SSCA)、组合重亚硫酸盐限制分析(COBRA)、甲基化特异性变性梯度凝胶电泳(MS-DGGE)、甲基化特异性熔解曲线分析(MS-MCA)、甲基化特异性变性高效液相色谱(MS-DHPLC)、甲基化特异性微阵列(MSO)。这些测定可以是PCR分析、利用荧光标记的定量分析或southern印记分析。在实施方案中，可以使用甲基化敏感的DNA切割试剂来测定序列的甲基化程度，所述试剂可以是限制性酶，并且例如可以是Aatll、Acil、Acll、Agel、AscI、Asp718、Aval、BbrPI、BceAI、BmgBI、BsaAI、BsaHI、BsiEI、BsiWI、BsmBI、BspDI、BsrFI、BssHII、BstBI、BstUI、ClaI、EagI、Eagl-HF 、FauI、FseI、FspI、HaeII、HgaI、HhaI、HinPlI、HpaII、Hpy99I、HpyCH4IV、KasI、MluI、Nar I, NgoMIV、NotI、Not I-HF , NruI、Nt. BsmAI、PaeR7I、PspXI、PvuI、RsrII、SacII、Sail、SalI-HF 、SfoI、SgrAI、SmaI、SnaBI 或 TspMI。产品本公开包括含有一种或多种核酸分子或编码核酸分子的一种或多种载体的产品(例如，试剂盒)。所述核酸分子被制备用于按本文所述进行给药，并且可以按照计划的给药途径适当地包装。例如，核酸分子或编码核酸分子的载体可以包含在药学可接受的载体中或伴随药学可接受的载体。
按照实施方案的试剂盒可以包含其它试剂(例如，缓冲液、协同因子或酶)。按照实施方案的药物组合物可以包含将所述组合物给予个体的说明书。试剂盒还可以包含可以进行测定并与生物样品进行比较的一个对照样品或一系列对照样品。试剂盒的每个组分可以封装在单独的容器中，并且所有不同的容器可以位于单一的包装中。组合物和组合物向靶细胞的递送
在某些实施方案中，公开了用于向靶细胞递送的组合物。应当理解，具体实施方案中使用的组合物可以与合适的药学可接受的载体或赋形剂联合使用，并且可以以任何合适的剂型使用。本领域技术人员可容易地从上文所述进行鉴定、选择和使用，以符合所需的情况。如果待处理的细胞包含在个体体内，那么可以实施所公开的方法，并可以将所公开的组合物以任何常规方式递送至所述细胞，所述常规方式包括但不限于四糖或前药的递送、口服递送、肠胃外递送、肠内递送、肌内递送、皮下递送、静脉内递送或通过吸入递送，并且所公开的组合物可以与合适的载体或赋形剂、以合适的剂型联合递送，所述剂型包括但不限于片剂、胶囊剂、皮下泵或用于实现效应的其它途径。可选的递送方法可以包括渗透泵、可植入的输注系统、静脉内药物递送系统和可重新填装、可植入的药物递送系统。吸入递送可以包括利用喷雾器、计定剂量吸入器、干粉吸入器的递送，以上所有装置都是本领域技术人员所熟悉的。本领域技术人员可容易地辨别和实施合适的方法、组合物和递送途径。。选择的实施方案在第一组实施方案中，公开了对生物样品中的胃癌进行诊断或提供预后的方法。所述方法可以包括以下步骤检测所述样品中与由SEQ. ID. NO. 24组成的区域至少95%相似的连续序列中至少约15个连续碱基对的靶DNA序列的甲基化。应当理解，在实施方案中，靶DNA序列的长度可以为至少约10个碱基对或可以为至少约15、20、25、30、35、40、45、50或更多个碱基对，并且序列相似性程度可以为至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%,97%,98%,99%^； 100%。在可选实施方案中，靶DNA序列可以在与由SEQ. ID. NO. 11组成的区域至少95%相似的连续序列中。在一个实施方案中，显著的甲基化水平可以指示胃癌的不良预后。在可选实施方案中，靶序列的长度可以为至少约50个碱基对并且可以含有多个CpG碱基对。在具体的可选实施方案中，靶序列可以包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个CpG碱基对，并且显著的甲基化可以与这些CpG碱基对中的任意一个或多个单独相关，或与这些CpG碱基对中的任意一个或多个和这些CpG碱基对中的任意其它一个或多个的组合相关。在可选实施方案中，所述方法还可以包括将患者样品中靶序列的甲基化水平与非癌细胞或其它合适的对照样品的甲基化水平进行比较，所有的对照样品对于本领域技术人员是显而易见的。在可选实施方案中，所述确定可以包括用差异性地修饰甲基化的DNA和非甲基化的DNA的试剂处理样品。在可选实施方案中，所述试剂可以包括优先切割非甲基化的DNA或优先切割甲基化的DNA的限制性酶。在其它可选实施方案中，所述确定可以包括用硫酸氢钠处理样品，或可以通过组合重亚硫酸盐限制分析(COBRA)进行所述确定。在实施方案中，样品可以是血液样品或粪便样品。在可选实施方案中，所述确定可以包括以下步骤a)使用根据SEQ. ID. NO. 24或SEQ. ID. NO. 11中含CpG的基因组序列而选择的引物扩增经限制性酶处理的DNA ;和幻将未知样品中基因组序列的扩增部分的水平与非癌样品中的甲基化水平进行比较，从而检测或评价胃癌的预后。在可选实施方案中，所述扩增可以使用聚合酶链反应。在可选实施方案中，所述检测可以使用选自以下的引物或探针:SEQ. ID. NOS. 1、2、5、6、7、8、9、10、15、16、17、
18、19、20、21 或 22。在第二组实施方案中，公开了分离的核酸序列，所述核酸的长度可以为至少约10个碱基对并且与SEQ. ID. NO. 24或SEQ. ID. NO. 11的片段具有95%的同一性。在可选实施方案中，所述分离的序列的长度可以为至少约11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多个碱基对，并且可以与对应的片段约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相似。在一个可选实施方案中，公开了用于检测生物样品中的胃癌或确定生物样品中的胃癌的预后的试剂盒，并且所述试剂盒可以包括任何其它实施方案中的分离的核酸序列。所述试剂盒还可以包括说明书和试剂。在其它可选实施方案中，所述试剂用于检测生物样品中与由SEQ. ID. NO. 24组成的区域至少95%相似的连续序列中至少15个连续碱基对的靶DNA序列的甲基化，优选地，所述靶序列的长度为至少50个碱基对并且含有多个CpG碱基对。在另一实施方案中，本文公开的试剂盒还包括非癌细胞的甲基化水平的对照。
在可选实施方案中，试剂盒中所用的试剂能差异性地修饰甲基化的DNA和非甲基化的DNA。优选地，所述试剂包括优先切割非甲基化的DNA的酶。在另一实施方案中，通过COBRA、BGS或MSP进行所述检测或测定。在另一实施方案中，生物样品选自血液样品和粪便样品。在可选实施方案中，本文公开的试剂盒还包括限制性酶和用于选择性地扩增经限制性酶处理的并包含在SEQ. ID. NO. 24中的含CpG的基因组序列的引物。优选地，所述扩增是聚合酶链反应。在优选实施方案中，所述检测或确定使用选自以下的引物或探针SEQ.ID. NOS. 1、2、5、6、7、8、9、10、15、16、17、18、19、20 和 22。在第三组实施方案中，公开了检测患者样品中的胃癌的方法，所述方法包括检测所述样品中与SEQ. ID. NO. 12或13在至少约15个碱基上至少95%相似的RNA序列的表达或检测所述样品中与SEQ. ID. NO. 23在至少约15个氨基酸上至少约95%相似的蛋白序列，并且其中与正常对照样品(例如从非癌细胞或组织样品或从正常胃粘膜提取的RNA或蛋白样品)相比，序列的显著降低的mRNA或蛋白表达的水平指示胃癌的存在。在可选实施方案中，所述序列相似性可以扩展到约 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、400、600、800 或更多碱基对或编码的氨基酸上，并且可以是约 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100 %。在实施方案中，可以将表达的序列的水平与非癌对照中表达的序列的水平进行比较。在实施方案中，使用如SEQ. ID. NO. 1、2、3和4所示的引物可以实现所述检测。在可选实施方案中，公开了用于检测患者样品中的胃癌的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测所述样品中与SEQ. ID. NO. 12或13在至少约15个碱基上至少95%相似的RNA序列的表达或用于检测所述样品中与SEQ. ID. NO. 23在至少约15个氨基酸上至少约95%相似的蛋白序列的表达的试剂，所述试剂盒任选地包括检测方法中使用的非癌对照。优选地，所述试剂盒包括SEQ. ID. N0S. 1、2、3和4所示的引物和/或用于检测方法中提及的RNA序列或蛋白的抗体。在第三组实施方案中，公开了抑制胃癌细胞发展的方法。所述方法可以包括以下步骤在所述癌细胞中表达SEQ. ID. NO. 12、SEQ. ID. NO. 13或SEQ. ID. NO. 23的生物学有效部分，从而抑制细胞生长。在实施方案中，序列同一性可以扩展到约11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、400、600、800 或更多碱基对上，并且可以为约 90%,91%,92%,93%,94%,95%,96 %、97 %、98 %、99 %或100 %。在可选实施方案中，所述表达可以包括将分离的DNA分子引入细胞，所述DNA分子包含与启动子可操作地连接的PAX5编码序列。启动子可以适于驱动PAX5编码序列的组成型表达或外源激活表达。在实施方案中，PAX5编码序列可以与包含 SEQ. ID. NO. 12 或 SEQ. ID. NO. 13 或 SEQ. ID. NO. 23 的至少 11、12、13、14、15、16、17、18、
19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、400,600,800 或更多核苷酸的区域至少约 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相似，并且在一个实施方案中，相似性可以扩展到SEQ. ID. NO. 12或SEQ.ID. NO. 13 或 SEQ. ID. NO. 23。在实施方案中，所述表达可以包括将胃癌细胞中与SEQ. ID. NO. 24或SEQ. ID. NO. 11在至少15个连续碱基对上具有至少95%序列相似性的DNA序列脱甲基。在实施方案中，表达可以包括将分离的DNA分子引入细胞，所述DNA分子包含与启动子可操作地连接的PAX-5编码序列。在一个可选实施方案中，公开了治疗个体中的胃癌的方法，所述方法可以包括以下步骤在所述癌细胞中表达SEQ. ID. NO. 12的生物学有效部分或SEQ. ID. NO. 13的生物学有效部分或SEQ. ID. NO. 24的生物学有效部分或与包含上述序列任意一个的至少11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、400、600、800 或更多核苷酸的区域至少约 90%,91 %,92%,93%,94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相似的生物学有效序列，从而抑制细胞生长。预期的是可以通过以下实现表达用合适剂型的脱甲基剂治疗个体，或通过注射或其它合适方法给予患者处于合适载体中的或受合适启动子控制的序列的生物学有效部分。在实施方案中，所述治疗方法包括用适于表达所述生物学有效序列的组合物治疗患者或将其给予患者。所述组合物可以包括本文实施例部分公开的合适的载体和构建体，给予、调整、改变和制备构建体以及诱导所需序列在靶细胞中表达的方法对于本领域技术人员是显而易见的。同样，可以将序列的生物学有效部分直接引入目的细胞。在可选实施方案中，公开了用途本文公开的SEQ. ID. NO. 12,SEQ. ID. NO. 13或SEQ.ID. NO. 23的生物学有效部分或抑制胃癌细胞发展或治疗个体中的胃癌的方法中使用的试剂在抑制胃癌细胞发展或个体中的治疗胃癌中的用途或在制备用于抑制胃癌细胞发展或治疗个体中的胃癌的药物或药物组合物中的用途。其它可选实施方案在实施方案中，公开的材料和方法可以用于评价癌症的存在或进展、癌症的预后或癌症相关的其他因素。所有以上都是本领域技术人员能容易理解的。
实施例以下实施例说明了用于实践公开的实施方案的主题的材料、方法和步骤。应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅是举例说明的目的，根据其所进行的各种改动或变化对于本领域技术人员是显而易见的，并且意图包括在本申请的实质和范围内。
I.材料和方法I. I人胃样本I. I. I组织样品本研究中涉及三组人的样品1)用于描述甲基化状态正常胃粘膜活检的来自威尔斯亲王医院(Prince of Wales Hospital)的内镜检查中心；2)胃癌(“GC”)组织及其相应的相邻非癌组织获自内镜检查时的GC患者，所述非癌组织距肿瘤边缘至少5cm，这些样品用于PAX5基因表达水平的比较；3)也用于检测甲基化状态的石蜡包埋的GC样品来自广州中山医院。按照美国联合委员会的癌症 !系统对GC样品进行分期。将所有新鲜的组织在液氮中快速冷冻并然后保存在-80°C直至下一步处理。为了评价GC患者中PAX5的甲基化状态和临床重要性，将161个GC样本和19个正常胃活检用于BGS测定。GC组包括107名男性和54名女性，平均年龄为56. 8± 12. 6岁； 正常组包括7名男性和12名女性，平均年龄为51. 9±17. 2岁。也测定了其它临床病理学特征，例如幽门螺杆菌(Helicobacter pylori (H. pylori))感染、TNM分期和分化状态。通过使用快速尿素酶试验(RUT)，发现29名患者有幽门螺杆菌感染，70名患者是幽门螺杆菌感染阴性。 M I、II、III和IV期的患者数分别为20、23、49和52。94名患者具有低分化GC，43名患者具有发展的中等或高度分化GC。患者的信息由广州中山医院提供。部分信息是不完整的。所有患者和对照都提供了知情同意书，并且研究方案得到香港中文大学临床研究伦理学委员会的批准。I. I. 2肿瘤细胞系使用了来自胃肠道的16个肿瘤细胞系，包括8个GC细胞系(AGS、BGC823、KatoIII、MKN28、MKN45、N87、SNUl 和 SNU16)和 8 个结肠直肠癌(CRC)细胞系(Caco2、DLDUHCT116、HT29、LoVo、LS180、SW480和SW620)，这些细胞系购自ATCC (美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection) ,Manassas, VA,USA)。所有 GC 细胞系和 3 个 CRC 细胞系(LoVo、LS 180 和 SW480)培养在补充了 10%胎牛血清(FBS) (Sigma-Aldrich)的 RPMI1640培养基(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)中。加入10% FBS的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM) (Sigma-Aldrich)用于培养 HT29、SW620 和 Caco2。使用加入 10% FBS的McCoy’s 5a培养基(Sigma-Aldrich)培养细胞系HCT116。所有这些细胞系都在95%空气和5% CO2的培养箱中37°C下培养。每2-4天更新培养基。使用0. 25%胰酶-EDTA溶液(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)以 I : 3-1 : 4 的比例将细胞传代。I. 2PAX5基因的生物信息学分析加州大学圣克鲁兹分校基因组生物信息学(UCSC) (http://Renome. ucsc. edu/)的在线数据库用于获得PAX5基因的相关信息。通过CpG 岛搜索工具(http://cpgislands.usc.edu/) (Takai&Jones, 2003,Takai, D. , &Jones, P. A. (2003) The CpG island searcher a new Wffff resource (CpG 岛搜索工具新的网络资源).In Silico Biol，3(3) ,235-240)来预测PAX5基因启动子区的CpG岛。CpG岛被定义为大于500bp、GC含量高于55%且观察到的/预期的CpG比高于0. 65的DNA 区域(Takai & Jones, 2002, Takai,D. ,& Jones,P. A. (2002). Comprehensive analysisof CpG islands in human chromosomes 21 and 22 (人类染色体 21 和 22 中 CpG 岛的综合分析).Proc Natl Acad Sci U S A，99 (6)，3740-3745)。以上方法和和工具对于本领域技术人员是显而易见的。I. 3基因表达分析1.3. IRNA 分离使用Quizol 试剂(Qiagen, Valencia, CA, USA)分离总 RNA。首先，将约 5-10 X IO6细胞或30mg组织在ImL Qiazol试剂中匀浆，并在室温下孵育10分钟。向每个样品加入0. 2mL氯仿。将混合物剧烈振荡15秒，在室温下再静置3分钟。将样品在4°C下以12，OOOg离心20分钟，样品分为两层。将含RNA的上层水相转移到新管中，与0. 7ml异丙醇混合，在室温下孵育10分钟，并然后在4°C下以12，OOOg离心10分钟。弃去上清后，用ImL 75%乙醇洗涤RNA沉淀两次；风干5分钟并用不含RNA酶的水重新溶解RNA。通过不含RNA酶的 DNA 酶 I 消化(GE Healthcare, Buckinghamshire, England)去除 DNA 污染。通过使用NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA)测量 260nm/280nm 的吸光度来测定总RNA的质量和获得量。纯化的RNA保存在-80°C直至使用。 1.3.2cDNA 合成MultiScribe 逆转录酶试剂盒(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)用于合成cDNA。反应混合物含有IX逆转录酶试缓冲液、I XdNTP、l X随机引物(试剂盒提供)、2. 5U/ u L逆转录酶、IU/ u L RNA酶抑制剂和2 u g总RNA。将混合物在25°C下孵育10分钟，然后37°C下孵育120分钟，然后85°C下孵育5分钟来使酶失活。cDNA保存在_80°C直至其它应用。I. 3. 3 半定量逆转录 PCR(RT-PCR)以总体积25 ii L的反应进行半定量RT-PCR，所述反应含有GeneAmp IXPCR缓冲液
II(Applied Biosystems) >2. 5mM MgCl2、200 u M每种 dNTP、200nM每种引物、0. 5U AmpliTaqGold DNA聚合酶(Applied Biosystems)和 30_50ng cDNA。PCR程序的开始为 95°C持续 10分钟的初始变性，然后是32-35个扩增循环(94°C持续30秒、58°C持续30秒和72°C持续30秒)，在72°C下进行10分钟的最终延伸。在紫外光下观察PCR条带并照相。用作为内参的管家基因￠-肌动蛋白的表达将靶基因的表达的标准化。用于扩增转录本的所有引物列在表I. I中。I. 3. 4 实时定量 PCR(qPCR)对于实时定量RT-PCR，使用ABI PRISM 7500序列检测系统(AppliedBiosystems)测定 PAX5 表达。按照 SyberGreen Master Mix (Applied Biosystems)的实验方案，以总体积25 ii L反应进行qPCR,所述反应含有IXSyberGreen Master Mix> IOOnmol/L引物和30ng cDNA模板。qPCR条件为95°C持续10分钟，然后是40个循环，每个循环为95°C持续15秒、58-60°C (按照引物的退火温度)持续40秒、72°C持续30秒。使用相对定量 2_AACT 法(Livak & Schmittgen, 2001 Livak, K. J. , & Schmittgen, T. D. (2001).Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR andthe 2 (-Delta Delta C (T) )Method. Methods，25 (4)，402-408)分析基因表达数据，该方法是本领域技术人员所公知的。I. 3. 5mRNA 表达阵列通过CancerPathway Finder PCR阵列系统(SABiosciences,Frederick,MD,USA)分析具有或不具有PAX5蛋白的GC细胞系的基因表达谱。该阵列系统能检测代表转化和肿瘤发生中涉及的6个生物学通路的84个基因(http://www.sabiosciences.com)。按照实验方案，使用ABI PRISM 7500序列检测系统(Applied Biosystems)进行实时PCR。将cDNA模板与合适的即用PCR master mix(试剂盒提供)简单地混合，96孔板的每孔分配25 y L的等份，然后运行实时PCR循环程序I) 95°C持续10分钟，2) 40个循环，每个循环为95°C持续15秒和60°C持续I分钟。通过基于网络的PCR阵列数据分析软件按照说明(http://www. sabiosciences. com/pcrarraydataanalysis. php)分析表达结果。I. 5 倍变化的基因表达上调或下调被认为是具有生物学意义。1.3. 6蛋白提取使用CytoBuster 蛋白提取试剂(Merck Chemicals, Nottingham, UK)制备蛋白。将细胞以3000g离心10分钟。然后以100 u L/106个细胞将沉淀重悬于CytoBuster。将混合物在室温下孵育5分钟。然后将管在4°C下以15，OOOg离心10分钟，并将上清转移到新 管中。I. 3. 7十二烧基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和western印迹利用5%上层胶和10%下层胶使40iig蛋白分离。SDS-PAGE后，利用半干转膜仪在15V下运行40分钟，将蛋白转移到平衡过的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(AmershamBiosciences, Buckinghamshire, UK)。将膜在溶解于 TBS/T 溶液(Tris 缓冲盐溶液(Invitrogen)和0. I % Tween 20 (Sigma-Aldrich))的5%脱脂奶中室温下振荡封闭I小时。封闭后，将膜在稀释于5%脱脂奶的一抗中4°C下振荡孵育过夜。与二抗在室温下孵育I 小时后，通过加强化学发光(ECL, Amersham Corporation, Arlington. Heights, IL, USA)检测蛋白。I. 4DNA甲基化分析I. 4. I基因组DNA提取使用DNA小型试剂盒(Qiagen),按照试剂盒实验方案从GC细胞系和组织样品分离基因组DNA。将约25mg样品在I. 5mL微离心管中的180 u L QIAamp ATL缓冲液和20 y L蛋白酶K中56°C下裂解I小时。加入4 ii L RNA酶A(100mg/ml，QIAgen)，并用漩涡脉冲混合15秒，然后室温下孵育2分钟。然后，将200 AL缓冲液加到裂解液，将样品在70°C下孵育10分钟。添加200UL无水乙醇后，用漩涡脉冲将溶液混合15秒。然后，按照生产商说明使用QIAamp柱纯化裂解液。将基因组DNA稀释在200 y L不含DNA酶的水中。通过使用NanoDrop ND-1000 (NanoDrop)测量260nm/280nm处的吸光度来测定DNA的质量和获得量。1.4. 2重亚硫酸钠转化按照Tao et al. (2002)所述用偏亚硫酸氢钠修饰基因组DNA。简单而言，将30 y LTE缓冲液(Sigma-Aldrich)中5 y g基因组DNA与3. 3 y L的3mM NaOH混合至终浓度0. 3mM,并在37°C下孵育15分钟。变性的DNA与333 L重亚硫酸盐溶液混合，并在55°C下避光处理4小时。重亚硫酸盐溶液被制备为2. 4M偏亚硫酸氢钠(pH 5. 0-5. 2) (Sigma-Aldrich)和0. 5mM氢醌(Sigma-Aldrich)。使用Qiaex II试剂盒(Qiagen),按照试剂盒提供的实验方案将处理过的DNA脱盐和纯化。然后，用0. 3M NaOH在37°C下处理DNA15分钟，并用3M醋酸铵和3倍体积的乙醇进行沉淀。将回收的DNA溶解于100 UL TE缓冲液中(pH 8. 0)并保存在_20°C。I. 4. 3脱甲基处理使用5-氮杂-2'-脱氧胞苷(“5-Aza”)
以每个IOOmm皿IXlO5的密度接种细胞，并生长24小时。然后，用2 y M 5_氮杂-2,-脱氧胞苷(“5-Aza”)(Sigma-Aldrich)处理细胞5天。每天补充5_Aza。使用半定量RT-PCR评价PAX5的基因表达。I. 4. 4 甲基化特异性 PCR(MSP)设计甲基化特异性引物和非甲基化特异性引物来评价GC和CRC细胞系中的甲基化状态。PCR 混合物含有 I XPCR 缓冲液 II (Applied Biosystems)、2mM MgCl2、200 y M 每种dNTP、600nM每种引物、0. 5U of AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems)和 20ng重亚硫酸盐处理过的DNA。PCR程序为95°C持续10分钟，然后是38个扩增循环(94°C持续30秒、60°C持续30秒和72°C持续30秒)，在72°C下最终延伸5分钟。在紫外灯下观察MSP条带并照相。I. 4. 5重亚硫酸盐基因组测序(BGS)
将PCR产物的直接BGS用于描述正常和GC样品中的甲基化状态。使用BigDyeTerminator循环测序试剂盒I. 0版(Applied Biosystems)进行测序。简而言之,添加10 ii L混合物(包含2yL of BigDye-Terminator即用反应混合物、3. 2pmol特异性引物和IOngPCR产物)用于如下所述的测序反应25个循环，每个循环96°C持续30秒，50°C持续15秒；然后是60°C持续4分钟。将10 ii L醋酸钠(5M，pH 5. 2)和50 y L无水乙醇组成的60 y L混合物添加至每个反应产物。-80°C保存20分钟后，将混合物在4°C下以3，700rpm离心30分钟。弃去上清，用IOOiiL 75%乙醇将沉淀洗涤一次。最后，将干燥的沉淀溶解于IOiiLHi-Di甲酰胺中(Applied Biosystems)。95°C下变性5分钟后，测序溶液在冰上静置2分钟，然后用ABI 3100基因分析仪(Applied Biosystems)进行分析。使用SeqScape软件(Applied Biosystems)分析序列。按照以下公式计算每个CpG位点的甲基化百分比甲基化％=Hc/(Hc+Ht) X 100%, (Hc = C 峰的高度，HT = T 峰的高度)。I. 5生物学功能分析I. 5. 1PAX5的克隆和表达载体的构建通过PCR克隆产生PAX5基因表达载体的全长cDNA。将来自人胃的总RNA (Ambion,Austin, TX, USA)逆转录成cDNA。通过PCR扩增对应于PAX5的开放读码框(ORF)的序列。按照生产商的指导(Invitrogen)，将PCR产物亚克隆入pCDNA3. 1T0P0 TA表达载体。简单而言，将Iu L PCR产物连接到含有240mM NaCl和12mM MgCl2的2. 5 y L总体积中的0. 5 y LT0P0载体。在室温下使混合反应孵育30分钟，然后进行热休克转化。使用JM109 化学感受态大肠杆菌(Escherichia coli (E. coli))细胞(Promega,Madison, WI, USA)进行热休克转化。将JM109感受态细胞(50 u L)在冰上解冻，并将2 y L连接产物添加到细胞。冰上孵育20分钟后，将细胞在42°C水浴中热休克45秒不伴随摇动，然后立即将管转移到冰上静置5分钟。将S. 0. C.培养基(250 u L)添加至细胞，将管在振荡孵育器中以220rpm在37°C下振荡I小时。孵育后，将150 y L细胞接种在含0. lmg/ml氨节青霉素的Luria-Bertani(LB)琼脂平板上并于37°C下孵育过夜。通过PCR鉴定细菌集落。阳性集落培养在含0. lmg/ml氨苄青霉素的LB培养基中。通过测序检查插入DNA。使用HiSpeed Plasmid Maxi试剂盒(Qiagen)分离具有非突变靶基因的质粒。简单而言，将细菌在ImL含0. lmg/ml氨苄青霉素的LB培养基中于37°C下以-250rpm过夜振荡培养。然后，再将0. 5mL细菌培养物接种于IOOmL含0. lmg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，并在37°C下以250rpm振荡生长16小时。通过4°C下6000g离心15分钟收集细菌沉淀。将沉淀重悬于IOmL缓冲液P1。用IOmL缓冲液P2将细菌蛋白、染色体和质粒DNA变性。将管颠倒混合6次，然后在室温下静置5分钟。用IOmL缓冲液P3中和混合物，然后在室温下孵育10分钟。通过用QIA滤芯进行过滤清除细胞裂解液中的碎片。将过滤后的裂解液通过重力流动施加到试剂盒中提供的树脂柱，质粒DNA与树脂柱结合。用30mL QC缓冲液通过重力流动洗涤柱，从而去除质粒制备期时的所有污染物和来自细菌菌株的糖类。用15mL缓冲液QF洗脱质粒DNA。通过异丙醇沉淀将DNA沉淀，并用70 %乙醇洗涤DNA沉淀。将DNA沉淀风干并用ImL不含DNA酶的水溶解。I. 5. 2 PAX5 基因转染将细胞以I X 104-2. 5 X IO4细胞接种于不含抗生素的24孔板中，孵育约24小时，直至细胞密度达到约90%融合。然后，利用Lipofectamine 2000 (Invitrogen),用0. 8 u g PAX5和对照载体(pCDNA3. I)分别转染细胞。稀释于50yL Opti-MEM(Invitrogen)的Lipofectamine 2000 (2. 0 u L)在室温下孵育5分钟。然后，稀释于50 y L Opti-MEM的质粒DNA与Lipofectamine混合物混合。在5% CO2培养箱中37°C下孵育24-48小时后，收获细胞，用于转基因表达的测试。对于稳定细胞系，以I : 10的比例将细胞传代至含有合适浓度的新霉素(G418) (Invitrogen)的新鲜生长培养基中。选择14-21天之后收获稳定转染的细胞用于功能测定。1.5. 3集落形成测定转染后两天，以I : 20的比例将细胞随后分到含有RPMI1640的6孔板中，RPMI1640含有10% FBS和500 ii g/mL新霉素(G418)。选择14-18天后，用70%乙醇固定细胞10分钟并用0. 5%结晶紫溶液染色10分钟。对每个集落大于50个细胞的集落进行计数。以三个独立平行样品进行实验。I. 5. 4细胞活力测定使用CellTiter 96AQueous One溶液细胞增殖测定试剂盒(Promega)进行MTS测定，MTS测定是3- (4，5- 二甲基噻唑-2-基)-5- (3-羧基甲氧基苯)-2- (4-磺苯基)-2H-四唑测定的简称。用胰酶消化转染的细胞并进行计数。将细胞以5，000个细胞/100 稀释于RPMI1640培养基中。在96孔板中的每个孔中接种IOOii L细胞。在5% CO2培养箱中于37 °C孵育平板。48小时后，将20 ii L MTS试剂添加到培养基中。将培养物在CO2培养箱中37°C下培养30分钟-2小时。转染后48小时，在490nm处测量样品的吸光度。该实验重复3次。I. 5. 5划痕愈合测定划痕愈合测定是用于研究细胞迁移。简单而言，以5X IO5细胞/孔的浓度将胰酶消化的细胞接种于6孔板的完全培养基中。在5% CO2培养箱中于37°C孵育细胞24小时。去除细胞的培养基后，使用非常细的枪头横跨每个孔制造3道划痕。通过用IX磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤两次去除松散贴壁的细胞。在每孔中添加仅具有一半浓度FBS的饥饿培养基。在0小时、24小时和48小时采集划痕的图像。该测定重复2次。1.5. 6侵袭测定使用24孔基质胶生物包被的侵袭小室(BD Biosciences, Bedford, MA, USA),按照试剂盒的实验方案进行基质胶侵袭测定。该测定中使用具有PAX5基因或对照载体P⑶NA3. I的稳定细胞。对于每个基质胶聚碳脂膜(transwell)，添加具有2. 5X IO4细胞的0. 5mL细胞悬液。作为化学引诱剂，在下室中添加0. 75mL含有10% FBS和0. 1%牛血清白蛋白(BSA)的培养基。在5% CO2环境的培养箱中于37°C下孵育小室24小时。从膜的上表面去除非侵袭的细胞。使用0.5%结晶紫溶液将侵袭通过基质胶膜的细胞染色。在显微镜下计数侵袭细胞的数量。从3次独立测定收集和分析数据。I. 5. 7细胞周期分析和膜联蛋白V凋亡测定碘化丙啶(PI)是嵌入剂和可用于染色DNA的荧光分子。该染料不能进入活细胞，但能穿透将要死亡的或已死亡的细胞的细胞膜。通常通过流式细胞仪分析PI染色的细胞，从而评价细胞活力或细胞周期分析中的DNA含量。对于细胞周期分析,收获细胞并用IXPBS缓冲液洗涤2次。将冷的70%乙醇用于在4°C下将细胞固定过夜。用IXPBS将固定的细胞洗涤2次。将PI染色液(配制于I XPBS缓冲液中的50 u g/mL PI和100 u g/mLRNA酶A)添加至细胞并充分混合。将混合物在4°C下静置30分钟，直至进行流式细胞仪分 析。计数约 20，000 个细胞，并用 ModFit 3. 0 软件(Verity Software House, Topsham,ME,USA)分析结果。膜联蛋白V是可以结合已发生凋亡但还未失去膜的完整性的细胞膜的蛋白。使用膜联蛋白V和PI双染评价凋亡细胞的比例。简单而言，将用IXPBS洗涤的细胞重悬于IOOiI L 冰冷膜联蛋白结合缓冲液中(IOmM HEPESU40mM NaCl 和 2. 5mM CaCl2, pH 7. 4)，该缓冲液中含有5 ii L缀合了 Alexa Fluor 488的膜联蛋白V(Invitrogen)和2 y L PI染色液(50 u g/mL) (BD Pharmingen，San Jose,CA,USA) 室温下孵育15分钟后，将细胞与另外的400 u L冰冷膜联蛋白结合缓冲液混合，并使用流式细胞仪进行分析。1.5. 8体内肿瘤发生分别将用pCDNA3. 1-PAX5转染的或仅用pCDNA3. I转染的BGC823细胞(0. ImL PBS中的IXlO6细胞)皮下注射到5周龄雄性Balb/c裸鼠的背部左侧。可观察到肿瘤之后，每两天测量肿瘤大小，持续3周。通过测量肿瘤的最长径和最短径并按照下述进行计算来估计肿瘤体积(_3):体积=(最短径)2X (最长径)X0. 5。动物的饲养和所有实验操作得到香港中文大学动物伦理学委员会的批准。3周后，处死小鼠，将肿瘤称重并固定在福尔马林中用于组织学分析。I. 6组织学分析I. 6. I石蜡组织切片的制备处死小鼠后，取出肿瘤并用福尔马林固定。然后，将固定的组织包埋在石蜡中。将石蜡包块切成4-6 厚，并漂浮在蒸馏水的水浴上。将切片挑出在载玻片上。将载玻片在烘箱或室温下过夜干燥。1.6. 2免疫染色使用Histostain-Plus试剂盒(Invitrogen)进行免疫组化染色。简单而言，用二甲苯将石蜡切片脱石蜡，并在梯度乙醇中再水化。将载玻片浸在过氧化物酶猝灭溶液(3%过氧化氢)中10分钟。然后，用微波表位恢复处理载玻片10分钟，并用PBS洗涤2分钟，共3次。加入血清封闭液，并孵育10分钟。该步骤时不应当漂洗。然后，加入一抗4°C下孵育过夜。然后，用PBS漂洗载玻片2分钟，共3次。将载玻片与足量的生物素化的二抗孵育30分钟，用PBS漂洗2分钟，共3次。漂洗后，在潮湿小室中加入酶缀合物保持30分钟，然后PBS漂洗2分钟，共3次。在二氨基联苯胺(DAB)底物溶液中显色。最后，用苏木精将切片复染并用封片剂封片。I. 6. 3原位DNA缺口末端标记利用Dead End TM Colorimetric TUNEL系统(Promega)进行末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP-地高辛缺口末端标记(TUNEL)测定。简单而言，将石蜡切片脱蜡、再水化、用蒸馏水漂洗并在IXPBS中洗涤。然后，用20 ii g/mL蛋白酶K在室温下消化组织25分钟。用10%缓冲福尔马林PBS溶液进行组织的再固定。加入平衡缓冲液后，将切片在含有生物素化的核苷酸混合物的工作浓度的TdT酶中于37°C下孵育60分钟。通过加入工作浓度的终止/洗涤缓冲液终止反应。洗涤后，用0. 3%过氧化氢处理5分钟来进行内源过氧化物酶的猝灭。在潮湿小室中加入抗生物素蛋白链菌素HRP溶液，室温下保持30分钟。在DAB底物溶液中显色。然后，用苏木精将切片复染。具有棕色信号的细胞核被认为是程序性死亡的细胞。将凋亡细胞比例计算为至少1，000个细胞中阳性细胞的百分比。
I. 7统计学分析通过配对t检验分析肿瘤和相邻非肿瘤原代胃组织之间PAX5mRNA表达水平的差异。进行独立样品t检验来分析对照和PAX5过表达细胞在集落形成、MTS测定、细胞周期、膜联蛋白V-PI双染测定、TUNEL、侵袭测定和裸鼠中的肿瘤重量中的统计学显著差异。卡方检验用于分析患者特征。接受者操作特征(ROC)曲线用于估计用于甲基化状态测定的甲基化百分比截取值。Kaplan-Meier存活曲线和对数秩检验用于评价对应于PAX5甲基化状态的整体存活数据。通过变量重复测量分析(ANOVA)确定用PAX5表达载体和对照载体稳定转染的两组小鼠之间肿瘤生长速率的差异。当P小于0. 05时，认为数据是统计学显著的；当P小于0. 01时，认为数据是统计学非常显著的。表I. I本研究中所用引物的DNA序列。
权利要求
1.诊断或确定来自患者的生物样品中胃癌的预后的方法，所述方法包括以下步骤 检测所述样品中与由SEQ. ID. NO. 24组成的区域至少95%相似的连续序列中的至少15个连续碱基对的靶DNA序列的甲基化； 其中显著的甲基化水平指示胃癌的不良预后。
2.如权利要求I所述的方法，其中所述靶序列的长度为至少50个碱基对并含有多个CpG碱基对。
3.如权利要求I或2所述的方法，还包括将患者样品中靶序列的甲基化水平与非癌细胞的甲基化水平进行比较。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述确定或检测包括用能差异性地修饰甲基化的DNA和非甲基化的DNA的试剂处理样品。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述区域由SEQ.ID. NO. 11组成。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述确定或检测包括用硫酸氢钠处理样品。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中通过COBRA、BGS或MSP进行所述确定或检测。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述样品是血液样品或粪便样品。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述确定包括以下步骤 a)使用根据SEQ.ID. NO. 24中的含CpG的基因组序列所选择的引物来扩增用限制性酶处理的DNA ;和 b)将未知样品中基因组序列的扩增部分的甲基化水平与非癌样品的甲基化水平进行比较， 从而检测胃癌的存在。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述试剂包括优先切割非甲基化的DNA的酶。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述扩增利用聚合酶链反应。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法， 其中所述检测使用选自以下的引物或探针:SEQ. ID. NOS. 1、2、5、6、7、8、9、10、15、16、17、18、19、20 和 22。
13.分离的核酸序列，其与SEQ.ID. NO. 24的10个连续碱基对的区域至少约95%相似。
14.如权利要求13所述的分离的核酸，其中所述分离的序列与SEQ.ID. NO. 11的约20个连续碱基对的区域至少99%相似。
15.检测患者样品中的胃癌的方法，该方法包括检测所述样品中与SEQ.ID. NO. 13在至少约15个连续碱基上至少95%相似的RNA序列的表达，其中与正常对照样品相比，所述序列的显著水平的降低表达指示胃癌的存在。
16.抑制胃癌细胞发展的方法，所述方法包括以下步骤 在所述癌细胞中表达SEQ. ID. NO. 23的生物学有效部分，从而抑制所述细胞的生长。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述表达包括将所述胃癌细胞中与SEQ.ID. NO. 24在至少15个连续碱基对上具有至少95%序列相似性的DNA序列脱甲基。
18.如权利要求16或17所述的方法，其中所述表达包括将分离的DNA分子引入所述细胞，所述分离的DNA分子适于表达与SEQ. ID. NO. 23在约50个连续氨基酸上至少约95%相似的蛋白。
19.用于诊断或确定生物样品中的胃癌的预后的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测所述样品中与由SEQ. ID. NO. 24组成的区域至少95%相似的连续序列中的至少15个连续碱基对的靶DNA序列的甲基化的试剂，优选地，所述样品选自血液样品和粪便样品。
20.如权利要求19所述的试剂盒，其中所述靶序列的长度为至少50个碱基对并含有多个CpG碱基对。
21.如权利要求19或20所述的试剂盒，还包括非癌细胞的甲基化水平的对照。
22.如权利要求19-21中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂可以差异性地修饰甲基化的DNA和非甲基化的DNA。
23.如权利要求19-22中任一项所述的试剂盒，其中所述区域由SEQ.ID. NO. 11组成。
24.如权利要求19-23中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂还包括用于处理样品的硫酸氢钠。
25.如权利要求19-24中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂用于COBRA、BGS或MSP。
26.如权利要求19-25中任一项所述的试剂盒，还包括限制性酶和引物，所述引物用于选择性地扩增用所述限制性酶处理的并包含在SEQ. ID. NO. 24中的含CpG基因组序列。
27.如权利要求19-26中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂包括优先切割非甲基化的DNA的酶。
28.如权利要求26所述的试剂盒，其中所述扩增是聚合酶链反应。
29.如权利要求19-28中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂包括选自以下的引物或探针SEQ. ID. NOS. 1、2、5、6、7、8、9、10、15、16、17、18、19、20 和 22。
30.用于检测患者样品中的胃癌的试剂盒，包括用于检测与SEQ.ID. NO. 13在至少约15个连续碱基上至少95%相似的RNA序列的试剂，以及正常对照样品的对照，优选地，所述样品选自血液样品和粪便样品。
31.SEQ. ID. NO. 23的生物学有效部分在抑制胃癌细胞发展中的用途，包括在所述癌细胞中表达SEQ. ID. NO. 23的生物学有效部分，从而抑制所述细胞的生长。
32.如权利要求31所述的用途，其中所述表达包括将所述胃癌细胞中与SEQ.ID. NO. 24在至少15个连续碱基对上具有至少95%序列相似性的DNA序列脱甲基。
33.如权利要求31或32所述的用途，其中所述表达包括将分离的DNA分子引入所述细胞，所述分离的DNA分子适于表达与SEQ. ID. NO. 23在约50个连续氨基酸上至少约95%相似的蛋白。
全文摘要
本发明提供了用于检测胃癌的方法和试剂盒，其中PAX5基因的表达或甲基化被用作胃癌的诊断和预后的标志物。本发明还提供了通过在癌细胞中表达PAX5基因抑制胃癌细胞发展的方法。
文档编号C12Q1/68GK102782157SQ201180003932
公开日2012年11月14日 申请日期2011年4月29日 优先权日2010年4月30日
发明者于君, 李晓星 申请人:香港中文大学