专利名称：L-赖氨酸生产率提高的微生物以及用其生产l-赖氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及具有高L-赖氨酸生产率的微生物以及用其生产L-赖氨酸的方法。
背景技术：
L-赖氨酸是通过赖氨酸生物合成途径由草酰乙酸合成的。对L-赖氨酸的生物合成重要的酶是天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸还原酶和二氨基庚二酸脱氢酶，它们分别由基因asd、dapB和ddh编码，并且是介导部分赖氨酸生物合成途径的NADPH依赖性还原酶。在该途径中，产生一分子L-赖氨酸直接需要由酶消耗三分子NADPH，和间接消耗一分子NADPH。谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)细胞中NADPH的再生与L-赖氨酸生物合成的直接关联之前已被报道(Wittmann and Heinzle,Microbiol 68:5843-5849, 2002 ；Marx et al.，J Biotechnol 104 :185-197，2003 ；0hnishi et al.，Microbiol Lett242 :265-274,2005)。在棒状杆菌中，NADPH的主要供应途径是TCA循环和戊糖磷酸途径。优选生成L-赖氨酸所必需的还原能通过戊糖磷酸途径的氧化途径提供。在碳代谢产量方面，戊糖磷酸途径在经济上更有利，因为戊糖磷酸途径的两个循环释放一分子CO2,并伴随产生两分子NADPH,而每一个TCA循环释放两分子CO2,并伴随产生一分子NADPH。因此，L-赖氨酸产量提高需要更多的NADPH供应，导致对戊糖磷酸途径更加依赖。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6DPH)和6_磷酸葡糖酸脱氢酶(6P⑶)都参与戊糖磷酸途径，它们被报道与L-赖氨酸的生产相关(Marx et al. ,Biotechnol Bioeng 56:168-180,1997 ；ffittmann and Heinzle, Microbiol 68 :5843-5849,2002)。在产L-氨基酸的棒状杆菌菌种中，当编码造成戊糖磷酸途径中NADPH生成的酶的基因被增强或当该酶被突变时，L-氨基酸的生产率被报道增加。例如，J. Becker等报道，向产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌中编码G6DPH的zwf基因提供较强的启动子，导致赖氨酸产量显著增加(J. Becker et al.，J Biotechnol 132 :99-109,2007) 欧洲专利号 1305237公开了通过培养被导入编码6PGD突变体的基因的产L-氨基酸的棒状杆菌而生产L-氨基酸的方法。然而，现有报道中没有公开通过减弱棒状杆菌内源的葡糖酸激酶(GntK)活性，增加戊糖磷酸途径中NADPH生物合成的棒状杆菌属微生物。技术问题导致本发明的本发明人进行的透彻全面的研究以寻找高效高产量生产L-赖氨酸的方法为目的，导致这样的发现通过在氧化戊糖磷酸途径中进行遗传修改造成的NADPH生产的提高能增加L-赖氨酸的产量。技术方案因此，本发明的一个目的是提供葡糖酸激酶(GntK)活性与内源活性相比减弱的产L-赖氨酸微生物。
本发明的另一个目的是提供生产所述产L-赖氨酸微生物的方法，包括构建编码具有减弱的活性的葡糖酸激酶(GntK)的多核苷酸片段，其通过全部或部分地突变所述多核苷酸实现；将所述多核苷酸片段插入载体中，以获得重组载体，所述载体能与宿主细胞中的染色体进行同源重组；将所述重组载体导入能生产L-赖氨酸的宿主细胞中以形成同源重组体；以及从所述同源重组体中选择具有与其内源活性相比减弱的GntK活性的菌种。本发明的进一步目的是提供生产L-赖氨酸的方法，包括；培养本发明的微生物以获得细胞培养物；以及从所述细胞培养物或所述微生物收集L-赖氨酸。有益效果本发明可以通过增加棒状杆菌菌种的胞内NADPH水平高效高产量地生产其生物合成需要NADPH的L-氨基酸，特别是L-赖氨酸。
结合所附的附图，由下文的详细说明将更清楚地理解本发明的上述和其他目的、特征和其他优势，其中图I是说明谷氨酸棒状杆菌中戊糖磷酸途径的示意图；图2是说明用于无标记删除棒状杆菌染色体Ncgl2399基因的pDZ_ANCgl2399载体的不意图；和图3是说明用于无标记删除棒状杆菌染色体Ncgl2905基因的pDZ_ANCgl2905载体的示意图。最佳实施方式根据其一个方面，本发明提供具有弱于内源活性的葡糖酸激酶(GntK)活性的产L-赖氨酸微生物。L-赖氨酸是碱性a-氨基酸，其化学式为NH2 (CH2)4CH (NH2) C00H。它是必需氨基酸，即人体不能合成。L-赖氨酸是通过赖氨酸生物合成途径由草酰乙酸合成的，该途径的部分由NADPH依赖性还原酶催化。通过该途径生物合成一分子L-赖氨酸需要由酶直接消耗三分子NADPH，和间接使用一分子NADPH。本文所用的术语“葡糖酸激酶(GntK) ”指与产生6_磷酸葡糖酸的GntK途径有关的酶，该6-磷酸葡糖酸是微生物中戊糖磷酸途径的氧化过程中的中间体。棒状杆菌属微生物运行两个途径，即G6TOH途径和GntK途径，以合成6-磷酸葡糖酸——戊糖磷酸途径的中间体(图I)，即棒状杆菌属微生物可通过GntK途径部分地降解葡萄糖。基于阻断GntK途径可以中断向6-磷酸葡糖酸提供碳并将碳流从6-磷酸葡糖酸转至戊糖磷酸途径的氧化过程的假设，本发明人提出，阻断GntK途径导致6-磷酸葡糖酸脱氢酶(6PGD)活性的特异性增加，从而增加NADPH的再生。在此背景下，被推测在微生物中起葡糖酸激酶(GntK)作用的酶的活性被减弱。优选地，具有葡糖酸激酶(GntK)活性的酶可以是由SEQ ID NO :1的氨基酸序列表示的NCgl2399或由SEQ ID NO 2的氨基酸序列表示的NCgl2905。如本文所用，术语“内源活性”意在表示天然微生物中酶的活性，特别在与GntK组合使用时，指天然微生物表现出的GntK活性。术语“内源活性的减弱”是在微生物中含有编码内源蛋白的多核苷酸的染色体上，由选自以下的方法实现的全部或部分删除多核苷酸序列、部分替换多核苷酸序列或在多核苷酸序列中至少插入一个碱基对。此外,可以通过突变多核苷酸序列的调控元件减弱内源活性，其中突变是通过对调控元件全部或部分删除、替换或插入实现的。调控元件可以在染色体中多核苷酸序列的上游或下游，优选地，调控元件可以是启动子、增强子等，但本发明不限于此。多核苷酸的突变可以使用众所周知的方法实现，如同源重组。本文所用的术语“与内源活性相比减弱的GntK活性”意在表示GntK活性被遗传突变如干扰(disruption)下调，因而低于天然微生物中酶的内源活性。在本发明的实施方式中，本发明提供具有提高的L-赖氨酸生产率的棒状杆菌属微生物，其是通过导入由图2或图3的酶切图所示的重组载体干扰GntK活性实现的。当存在两个或更多个编码具有葡糖酸激酶活性并具有彼此不同的氨基酸序列的蛋白质的染色体基因时，可以通过在其中至少一个染色体基因上全部或部分删除、替换或插入，而减弱内源GntK活性。并且可以通过在其中至少一个所述染色体基因的调控元件上全部或部分删除、部分替换或插入，而减弱内源GntK活性。
优选地，由删除、替换或插入核苷酸造成的突变可以被允许发生在编码NCgl2399或Ncgl2905的基因上，或具有分别编码Ncgl2399和Ncgl2905的SEQ ID NO 3和SEQ IDNO 4的核苷酸序列的基因中的一个或两个上，或它们的调控元件上，使得GntK不能正常发挥功能。在本发明中，可以通过将携带部分编码葡糖酸激酶的基因的重组载体导入其中以删除或突变其内源葡糖酸激酶基因，制备具有与其内源活性相比减弱的葡糖酸激酶活性的微生物。将部分基因插入染色体可以用众所周知的方法实现，如同源重组。在这点上，本发明提供制备产L-赖氨酸微生物的方法，包括以下步骤1)构建编码具有减弱的活性的葡糖酸激酶(GntK)的多核苷酸片段，其是通过全部或部分突变所述多核苷酸实现的；2)将多核苷酸片段插入载体中，以获得重组载体，所述载体能与宿主细胞中的染色体进行同源重组；3)将重组载体导入能生产L-赖氨酸的宿主细胞中以形成同源重组体；以及4)从同源重组体中选择具有与其内源活性相比减弱的GntK活性的菌株。本文所用的术语“重组载体”意在指不能从宿主细胞染色体单独复制的载体，通常指包含允许外源基因与染色体同源重组的基本元件的遗传构建体。重组载体可以携带抗生素耐受基因和选择基因，如果聚糖蔗糖酶(sacB)基因。优选地，本发明可使用由图2和图3的酶切图所示的重组载体。只要能生产L-赖氨酸，任何菌种可以不受限制地用作重组载体所导入的宿主细胞。优选的是棒状杆菌属或短杆菌属(Brevibacterium spp.)的微生物。可用于本发明的宿主细胞的实例包括谷氨酸棒状杆菌ATCC13032、嗜热产氨棒状杆菌(C. thermoaminogenes)FERM BP-1539、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067 和乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 13869,以及由其衍生的产L-赖氨酸突变体或菌种，如谷氨酸棒状杆菌KFCC10881、谷氨酸棒状杆菌KFCC11001和谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P。优选的是谷氨酸棒状杆菌KFCC10881。在本发明的实施方式中，使用谷氨酸棒状杆菌KFCC10881，但本发明不限于此。在本发明的实施方式中，使用pDZ载体(公开于韩国专利号0924065)删除基因，该PDZ载体可在谷氨酸棒状杆菌中进行目标基因的无标记删除而不进行复制。即，构建携带部分编码NCgl2399或NCgl2905的基因的重组载体，将其转化到产L-赖氨酸棒状杆菌菌株中，并允许其与基因组进行同源重组，以制备具有减弱的葡糖酸激酶活性的产L-赖氨酸棒状杆菌菌种。在本发明中，将编码NCgl2399的部分基因插入pDZ载体中，以构建重组载体，称为pDZ-ANCgl2399，该重组载体随后被转化到棒状杆菌菌种中。获得的重组棒状杆菌菌种——其中编码NCgl2399的染色体基因被干扰——被命名为KFCC10881-ANCgl2399。单独地，将携带编码NCgl2905的部分基因——称为pDZ- Δ NCgl2905——的重组pDZ载体转化到棒状杆菌菌种中。获得的编码NCgl2905的染色体基因被干扰的重组菌株被命名为KFCC10881-Δ NCgl2905。此外，用重组质粒 pDZ- Δ NCgl2905 转化 KFCC10881- Δ NCgl2399以提供NCgl2399和NCgl2905都有缺陷的突变菌株。该菌株被命名为谷氨酸棒状杆菌CAO1-0892，于2010年6月24日以登录号KCCMl 1085P保藏于韩国微生物保藏中心(韩国，首尔)。此外，在本发明的一个实施方式中，评估了重组谷氨酸棒状杆菌菌种的胞内葡糖酸激酶活性和NADPH水平。NCgl2399基因缺陷的菌株和NCgl2399和NCgl2905基因都有缺陷的菌株的胞内GntK活性被观察到与亲本菌株相比被减弱。此外，胞内NADPH水平和6PGD活性被观察到与亲本菌株相比被提高(表2)。因此，制备菌株的L-赖氨酸生产率被观察到与亲本菌株相比有所增加(表3)。这些结果证明葡糖酸激酶活性减弱至内源活性以下增加了 6P⑶活性，这对NADPH产生有积极效果，从而导致高效、高产率的L-赖氨酸生产。此外，在两个或更多个不同的基因编码具有葡糖酸激酶活性的蛋白的情况下，通过删除其中两个或更多个基因可以获得较高的L-赖氨酸生产率。因此，本发明的产L-赖氨酸微生物可用于高效、高产率地生产L-赖氨酸。根据其另一方面，本发明提供生产L-赖氨酸的方法，包括以下步骤1)培养本发明的微生物以获得细胞培养物；和2)从细胞培养物或微生物收集L-赖氨酸。如本文所用，术语“培养”指允许微生物在人工控制的条件下生长。多种本领域熟知的方法可用于培养本发明的重组体。细胞可以用分批方法或连续方法如补料分批方法或重复补料分批方法培养，但本发明不限于此。用于培养的培养基必须满足所使用菌种的要求。本领域熟知适用于培养棒状杆菌的培养基(例如 Manual of Methods for General Bacteriology, American Society forBacteriology, Washington D. C. , USA, 1981)。培养基的碳源可以是糖类(saccharides 和Carbohydrates)，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油和脂类，如大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油；脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸、蓖麻酸；醇类，如甘油和乙醇；以及有机酸，如乙酸。这些材料可以单独或组合使用。可用于培养重组体的氮源的实例包括蛋白胨、酵母膏、肉汤、麦芽膏、玉米浆、大豆粉和尿素；或无机化合物，如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。这些氮源可以单独或组合使用。磷源中可用于培养基的是磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和相应的钠盐。此外，培养基可以包含细胞生长必需的金属盐，并可以补充必需的营养物，如氨基酸和维生素。此外，可以在培养基中加入适当的前体。营养物或补充物可以一次一起加入或在培养过程中分别加入。可以使用碱性化合物调整培养基的pH，如氢氧化钠、氢氧化钾或氨或酸性化合物、如磷酸或硫酸。可以使用消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯抑制所述培养基中泡沫的产生。可以通过向其中导入氧气或含氧气体(例如空气)，将培养基保持在有氧条件下。培养温度通常在20和45°C之间，优选地在25和40°C之间。持续培养直到产生最大量的L-氨基酸。在此方面，其可以在10至160小时内完成。在产生后，L-赖氨酸可以被运送到培养基中或保留在细胞内。根据本发明的L-赖氨酸生产方法包 括从细胞或细胞培养物收集赖氨酸。可以用众所周知的方法从培养基或细胞分离L-赖氨酸。可用于本发明的分离方法的实例包括离心、过滤、阴离子交换层析、结晶和HPLC，但不限于此。发明方式通过以下的实施例，可以获得对本发明的更好的理解。以下实施例被提出以进行示例，但不被解释为限制本发明。实施例I :通过位点特异性基因干扰(Site-Specific Gene Disruption)制备突变菌株设计用于制备突变菌株KFCC10881-ANCgl2399 和 KFCC10881-Λ NCgl2905 的引物。首先，从 NIH GenBank 获得 NCgl 2399 (SEQ ID NO :1)和 NCgl2905 (SEQ ID NO 2)的序列。在这些序列的基础上，合成将用于构建NCgl2399和NCgl2905的失活片段的引物2399F1、2399F2、2399R1、2399R2、2905F1、2905F2、2905R1 和 2905R2 (表 I)。表 I 总结了用于本发明的引物的核苷酸序列以及其SEQ ID NO，其中限制性位点用下划线标出。表I
权利要求
1.产L-赖氨酸微生物，具有与其内源活性相比减弱的葡糖酸激酶(GntK)活性。
2.权利要求I所述的产L-赖氨酸微生物，其中所述葡糖酸激酶具有SEQID N0:1或SEQ ID NO 2的氨基酸序列。
3.权利要求I所述的产L-赖氨酸微生物,其中所述微生物属于棒状杆菌属。
4.权利要求I所述的产L-赖氨酸微生物，其中所述 内源葡糖酸激酶活性通过在编码葡糖酸激酶的染色体基因上的全部或部分删除、部分替换或插入而减弱。
5.权利要求I所述的产L-赖氨酸微生物，其中所述内源葡糖酸激酶活性通过在编码葡糖酸激酶的染色体基因的调控元件上的全部或部分删除、部分替换或插入而减弱。
6.权利要求I所述的产L-赖氨酸微生物，其中当存在两个或更多个编码具有葡糖酸激酶活性并具有彼此不同的氨基酸序列的蛋白质的染色体基因时，所述内源葡糖酸激酶活性通过在至少一个所述染色体基因上的全部或部分删除、替换或插入；或在至少一个所述染色体基因的调控元件上的全部或部分删除、部分替换或插入而减弱。
7.权利要求I所述的产L-赖氨酸微生物，源自谷氨酸棒状杆菌KFCC10881。
8.权利要求I所述的产L-赖氨酸微生物，被确定为谷氨酸棒状杆菌CA01-0892，以登录号KCCMl 1085P保藏。
9.制备权利要求1-8中的一项所述的产L-赖氨酸微生物的方法，包括以下步骤 1)构建编码具有减弱的活性的葡糖酸激酶(GntK)的多核苷酸片段，其通过全部或部分地突变所述多核苷酸实现； 2)将所述多核苷酸片段插入载体中，以获得重组载体，所述载体能与宿主细胞中的染色体进行同源重组； 3)将所述重组载体导入能生产L-赖氨酸的宿主细胞中以形成同源重组体；和 4)从所述同源重组体中选择具有与其内源活性相比减弱的GntK活性的菌种。
10.生产L-赖氨酸的方法，包括以下步骤 1)培养权利要求1-8中的一项所述的微生物，以获得细胞培养物；和 2)从所述细胞培养物或所述微生物收集L-赖氨酸。
全文摘要
公开了具有与其内源活性相比减弱的葡糖酸激酶活性的产L-赖氨酸微生物，和用于制备所述微生物和使用所述微生物生产L-赖氨酸的方法。
文档编号C12R1/15GK102741393SQ201180002405
公开日2012年10月17日 申请日期2011年7月15日 优先权日2010年7月15日
发明者张在佑, 文准玉, 林相曹, 赵载熔, 金亨俊 申请人:Cj第一制糖株式会社