专利名称：生产o-磷酸丝氨酸的微生物和使用该微生物由o-磷酸丝氨酸生产l-半胱氨酸或其衍生物 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及用O-磷酸丝氨酸作为中间体生产胱氨酸或其衍生物的方法以及用于生产O-磷酸丝氨酸的重组微生物。
背景技术：
L-半胱氨酸是在所有生物体的硫代谢中起着重要作用的氨基酸。它用于生物合成蛋白质，如毛发角蛋白、谷胱甘肽、生物素、蛋氨酸和其它含硫代谢物以及作为辅酶A的前体。此外，半胱氨酸的生物合成已知与其它氨基酸的生物合成密切相关，包括L-丝氨酸、
L-甘氨酸和L-蛋氨酸。工业上，发现L-半胱氨酸及其衍生物应用于各种领域，包括制药业(用于治疗支气管疾病)、化妆品工业(在洗发液中、用于烫发的组合物)和食品工业(抗氧化剂、增味剂、面团助剂(dough aids)等)。L-半胱氨酸曾通过将人头发或动物羽毛进行酸水解工业性地获得(氨基酸生产的生物技术(Biotechnology of the Amino Acids Production) Ko Aida 编,p 217-223,1986)。然而，不仅从头发或羽毛获得的半胱氨酸的产量低至7 8%，而且盐酸或硫酸的使用产生大量的废水，引起环境污染。此外，从头发或羽毛中进行提取可诱发使用者对其强烈的厌恶感。这些问题导致迫切需要开发环境友好型L-半胱氨酸的生产方法。现代主要途径包含用微生物发酵。在微生物生产L-半胱氨酸中，代表性的为I)用微生物对D、L-ATC进行生物转化(Ryu 0H,Ju JY和 Shin CS, Process Biochem.，32 :201_209，1997)。然而，由于前体D、L_ATC的低溶解度，这种转化方法在难以工业上应用。2)另一种生产L-半胱氨酸的方法为用大肠杆菌直接发酵(专利号EP0885962B ；ffada M和 Takagi H, Appl. Microbiol. Biochem. ,73 48-54,2006)。微生物体内的L-半胱氨酸的过度积累导致细胞内毒性，限制了 L-半胱氨酸的高浓度生产。为了克服这种缺陷，使用了 L-半胱氨酸-输出蛋白，但在生产率上也没有显著的改善。至于微生物和植物体内的L-半胱氨酸的生物合成途径，O-乙酰基-丝氨酸(OAS)作为一种中间前体物，提供L-半胱氨酸的碳骨架(Kredich匪和Tomkins GM, J. Biol.Chem. ,241 =4955-4965,1966)。O-乙酰基丝氨酸巯解酶(OASS)，用硫化氢作为硫供体，催化乙酰基丝氨酸向半胱氨酸的转化。或者，在半胱氨酸的生产中，可将SO4还原成硫代硫酸盐作为硫供体(Nakamura T, Kon Y, Iwahashi H 和 Eguchi Y, J. Bacteriol. , 156 :656-662,1983)。因此，可用各种硫供体，用微生物积累OAS和OASS生产半胱氨酸(US6，579，705)。通过OAS的半胱氨酸生物合成途径使用两种酶，丝氨酸乙酰转移酶(CysE)催化丝氨酸向OAS的转化,半胱氨酸合成酶(CysK)催化OAS向半胱氨酸的转化。这其中，丝氨酸乙酰基转移酶(CysE)对最终产物半胱氨酸的反馈抑制作用高度敏感(Wada M and Takagi H，Appl.Microbiol. Biochem.，73 :48-54,2006)。
发明内容
技术问题本发明的发明人通过深入研究完成本发明，发现在超嗜热古菌(Aeropyrumpernix)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis)中存在用于合成L-半胱氨酸的O-磷酸丝氨酸巯解酶(OPSS),其采用O-磷-L-丝氨酸(OPS)-特异性途径，而非OAS-特异性途径(Mino K和Ishikawa K，FEBSletters,551 :133-138,2003 ；Burns KE, Baumgart S, Dorrestein PC, Zhai H, McLaffertyFW 和 Begley TP，J.Am. Chem. Soc.，127 :11602-11603，2005 ；ffestrop ⑶，Goodall G,Mottram JC and Coombs GH,J. Biol. Chem. ,281 :25062-25075, 2006)，以及当结核分支杆菌的OPSS的5个C-末端氨基酸残基被去除后，即使不存在额外的酶，其也可利用Na2S作为硫供体，将 OPS 转化成半胱氨酸(Argen D, Schnell R 和 Schneider G, FEBS letters, 583 330-336，2009)。本发明中，将微生物进行突变，从而在其体内积累OPS，接下来用OPSS酶进行孵育，从而将OPS转化成半胱氨酸。该方法之前在任何地方都没有公开过。技术方案本发明的一个目的在于提供生产半胱氨酸或其衍生物的方法。本发明的另一个目的在于提供用于生产O-磷酸丝氨酸的重组微生物。有益效果本发明的方法通过重组微生物高产量地生产O-磷酸丝氨酸并将其转化成半胱氨酸，事实上，这更加环保，并且确保比化学合成方法更高效地生产半胱氨酸。本发明通过发酵和生物转化而生产的半胱氨酸及其衍生物可广泛应用于生产动物和人类食品和食品添加剂。
图I为通过微生物发酵积累O-磷酸丝氨酸和积累的O-磷酸丝氨酸酶转化成L-半胱氨酸的示意图。图2所示为根据温度的OPS巯解酶的活性。图3为一组表示OPS巯解酶pH敏感性的图表。图4所示为通过SDS-PAGE分析的pET系统和pCL_Pc j I系统中Msm-T表达水平的照片。图5所示为将纯化的OPS发酵培养液(fermentation broth)转化成半胱氨酸的OPS巯解酶的酶活性的图。图6所示为将OPS发酵培养液转化成半胱氨酸的OPS巯解酶的酶活性的图。
具体实施例方式如本申请中所使用的，术语“半胱氨酸转化”是指O-磷酸丝氨酸巯解酶(OPSS)的催化反应，其引起底物O-磷酸丝氨酸(OPS)转化成产物半胱氨酸，即，它是指将OPS转化成半胱氨酸的催化反应。如本申请中所使用的，术语“半胱氨酸转化率”是指产物半胱氨酸的量和起始原料OPS的百分比。在最佳的反应条件下，I摩尔OPS被转化成I摩尔半胱氨酸。例如，如果100摩尔的OPS被转化成100摩尔的半胱氨酸，那么半胱氨酸转化率为100%。根据其一个方面，本发明提供生产半胱氨酸或其衍生物的方法，其包括I)培养经过修饰降低了内源磷酸丝氨酸磷酸酶(SerB)活性的重组微生物，以生产O-磷酸丝氨酸(OPS)；以及2)0-磷酸丝氨酸巯解酶(OPSS)或表达OPSS的微生物存在下，将步骤I)的OPS和硫化物进行反应，以生产半胱氨酸或其衍生物。该方法中，步骤I)与培养内源磷酸丝氨酸磷酸酶(SerB)活性降低的重组微生物有关。SerB是具有将OPS水解成L-丝氨酸的活性的蛋白质。因此，内源SerB活性降低的重组微生物的特征在于其积累OPS。SerB可包括但不限于任何表现SerB活性的氨基酸序列，并且优选可具有SEQ ID NO :1或2所示的氨基酸序列。然而，只要表现出SerB活性，可使用任意氨基酸序列，优选与SEQ ID NO :1或2具有90%或以上，更优选96%或以上，还更优选98%或以上，最优选99%或以上的同源性。降低的SerB活性是指与修饰之前的菌·株相比，SerB活性降低包括SerB的裂解。降低SerB活性的方法是本领域公知的。示例性实例包括染色体serB的缺失、向染色体serB中引入突变以降低内源SerB活性、向serB的调控区引入突变以降低内源SerB活性、用突变基因取代染色体serB以降低内源SerB活性，以及引入与serB转录本互补的反义寡核苷酸以抑制mRNA的反义,但降低SerB活性的方法不限于此。这些方法可用于降低本发明中其它酶的活性。内源SerB的裂解导致向重组微生物引入丝氨酸营养缺陷型，因而培养基必须添加甘氨酸或丝氨酸。甘氨酸可以纯甘氨酸、含甘氨酸酵母提取物或蛋白胨的形式提供。甘氨酸所含的浓度为O. I 10g/L，优选浓度为O. 5 3g/L。至于丝氨酸，它可以纯丝氨酸、含丝氨酸酵母提取物或蛋白胨的形式提供。它在培养基中的浓度范围为O. I 5g/L，优选
O.I lg/L。在本发明的一个实施方案中，当其内源SerB活性受到破坏的(disrupted)突变谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)或大肠杆菌(E. coli)培养于含甘氨酸或丝氨酸培养基时，发现其与野生型相比生产出更大量的OPS (见表2、3、6和7)。此外，本发明的重组微生物可具有增强的磷酸甘油酸脱氢酶(SerA)或磷酸丝氨酸氨基转移酶(SerC)活性。SerA为具有将3-磷酸甘油酸转化成3-磷酸羟基丙酮酸的活性的蛋白质。SerA可具有野生型氨基酸或抗丝氨酸反馈抑制的突变氨基酸序列，但不限于这些。优选地，SerA可具有选自SEQ ID NOS :3 7中的一种氨基酸序列。只要它表现出野生型的SerA的活性或抗丝氨酸反馈抑制的突变SerA活性，可使用任意氨基酸序列，但其优选与SEQ ID NO :3 7中的一种具有90%或以上，更优选96%或以上，还更优选98%或以上，最优选99%或以上的同源性。“抗反馈抑制的突变SerA”是指不管对丝氨酸或甘氨酸的反馈抑制，该突变表现出维持或增强的SerA活性。抗反馈突变体是本领域公知的(Grant GA等人，J. Biol. Chem. ,39 :5357-5361,1999 ；Grant GA 等人，Biochem. ,39 :7316-7319,2000 ；Grant GA 等人，J. Biol. Chem. , 276 :17844-17850,2001 ；Peters-ffendisch P 等人，Appl.Microbiol. B iotechnol. ,60 :437-441,2002 ； EP0943687B)。在本发明的一个实施方案中，当进一步向具有受到破坏的serB的谷氨酸棒状杆菌或大肠杆菌中导入抗反馈serA时,发现其与野生型相比生产更大量的OPS (见表4和9)。SerC为具有将3_磷酸羟基丙酮酸转化成0_磷酸丝氨酸的活性的蛋白质。SerC包括但不限于表现出SerC活性的序列，优选其具有SEQ ID NO :8的氨基酸序列。然而，只要它表现出SerC活性，可使用任意氨基酸序列，但优选与SEQ ID NO :8具有90%或以上，更优选96 %或以上，还更优选98 %或以上，最优选99 %或以上的同源性。此外，可向serC引入突变，以增加酶活性。在本发明的一个实施方案中，当进一步向具有受到破坏的serB和抗反馈抑制的SerA的谷氨酸棒状杆菌或大肠杆菌中导入抗反馈serC时,发现其与野生型相比生产更大量的OPS (见表9)。进一步地，可降低本发明重组微生物进行O-磷酸丝氨酸细胞内摄取或降解的能力。具体地，可对重组微生物进行改性以降低PhnC /PhnD/PhnE烷基磷酸酯ABC运载蛋白(PhnCDE操纵子，即磷酸酯转运蛋白(PhnC ;EG 10713)的ATP结合组分-Pn运载蛋白(PhnD ；EG 10714)的周质结合蛋白组分-烷基磷酸酯ABC运载蛋自(PhnE ;EG11283)的整体膜组分)、碱性磷酸化酶(PhoA)或酸性磷酸化酶(AphA)的活性。在本发明的一个实施方案中，观察到进一步缺失重组突变体的phnCDE操纵子导致OPS产量的增加(表10)。在PhoA或AphA活性被进一步受到破坏的重组微生物中，当培养基中磷酸浓度降低的时候，OPS的降解开始减少(表12)。然而，引入抗反馈的serA或serC增加了 OPS的产量(表14 16)。同样，本发明的重组微生物进一步的特征在于嘧啶核苷酸转氢酶(PntAB5EC
I.6. I. I)活性的增加。如之前(Sauer UP 等人，J Biol Chem. 20 ;279 (8) :6613-9. Epub2003)所公开的，PntAB参与NADPH代谢，以调控细胞内氧化还原平衡。在本发明的一个实施方案中，观察到通过在重组微生物中过表达PntAB进一步增加PntAB活性，增加了 OPS产量(表17)。此外，本发明重组微生物的特征在于O-乙酰基丝氨酸/半胱氨酸外排透性酶(YfiK)、高丝氨酸/高丝氨酸内酯外排蛋白质(RhtB ；EG11469)或苏氨酸/高丝氨酸内酯外排蛋白质(RhtC ;EG11468)的增加。已知YfiK作为外运蛋白用来向细胞外运输半胱氨酸和 OAS (Franke I 等人，J. Bacteriology, 185 :1161-1166，2003)，据报道 RhtB 作为高丝氨酸/高丝氨酸内酯、苏氨酸前体的胞间外运蛋白。此外，已知RhtC为苏氨酸和高丝氨酸的外运蛋白。YfiK、RhtC和RhtB活性的增加表明了 OPS积累菌株生长和OPS产量的增加(表18)。可使用各种公知的方法，包括但不限于增加编码目的酶的基因拷贝数、向基因调控区引入突变以增加酶活性、用突变基因取代染色体基因以增加酶活性，以及向染色体基因弓I入突变以增加酶活性，从而实现酶活性的增加。此外，本发明的重组微生物进一步的特征在于，磷酸甘油酸变位酶活性的降低。磷酸甘油酸变位酶存在三种形式的同工酶GpmI、GpmA和GpmB,其在糖酵解方法中用于将3-磷酸甘油酸转化成2-磷酸甘油酸。对于使用3-磷酸甘油酸作为底物，这三种酶与催化3-磷酸羟基丙酮酸合成的SerA竞争。因此，观察到各个酶活性的降低导致产生大量的OPS前体3-磷酸甘油酸，从而引起OPS生产水平的增加(表19)。在本发明的重组微生物中，也可减少L-丝氨酸脱水酶I (SdaA ；EC 4. 3. I. 17)或2-氨基-3-酮丁酸辅酶A连接酶(Kbl)。因此，该重组微生物的特征在于，即使当它培养于含低浓度甘氨酸或丝氨酸的培养基中，仍能维持或增加OPS的产量(表20)。此外，本发明的重组微生物进一步的特征在于，IclR活性的降低。IclR为一种转录因子，其能够抑制旁路操纵子aceBAK的表达(L Gui等人，J. Bacteriol. ,Vol 178，No. 1，321-324,1996)。当它被缺失后，观察到OPS产量的增加(表21)。同样，本发明的重组微生物进一步的特征在于，选自下组的酶的活性增加i)乙酰基-CoA合成酶(Acs)、ii)乙酸激酶(AckA)-磷酸转乙酰酶(Pta)、iii)苹果酸合成酶G (GlcB), iv)苹果酸脱氢酶(MaeB)、V)谷氨酸脱氢酶(GdhA)、vi)乙醛酸醛连接酶(Glc)、vii)羟基丙二酸半醛还原酶2 (GlxR)、viii)甘油酸激酶II (GlxK)和其组合。在本发明具体的实施方案中，当进一步增加i)Acs (EC No. 6. 2. I. I ;JBacteriol. 1995 May ; 177 (10) :2878-86)或丙酮酸氧化酶单体(PoxB ；EC I. 2. 2. 2)或 ii)AckA和Pta(EC 2,3,1，8)，所有这些旨在伴随着生产的NADH的消耗而有效地再利用积累的醋酸盐，发现本发明的重组微生物中OPS产量的增加(表22)。iii)GlcB(EC No. 2. 3. 3. 9)和iv)MaeB(EC 1.1.137)的功能是催化由乙醛酸合成苹果酸和苹果酸向丙酮酸的转化，其可削弱TCA循环，因此可用于增加葡萄糖的消耗和O-磷酸丝氨酸的产量(表23)。根据本发明的一个实施方案，催化由2-氧化戊二酸和NADPH合成SerC的底物谷氨酸的V) GdhA (EC I. 4. I. 2)的增加，赋予了微生物更高的生产OPS的潜能(表17)。已知vi)Glc(EC
4.I. I. 47)、vii)GlxR(EC I. I. I. 60)和 viii)GlxK(EC 2. 7. I. 31)都将乙醛酸转化成 3-磷酸甘油酸，即增加磷酸甘油酸脱氢酶的底物的水平(Kim HJ等人，J. Bacteriol.，186(11)，3453-3460，2004 ；Eva Cusa 等人，J. Bacteriol.，181(24)，7479-7484，1999 ；Chnag YY 等人，J. Biol. Chem. 268(6) :3911-3919，1993)。当进一步增加 Glc、GlxR 和 GlxK 的活性，改善了本发明的重组微生物的糖消耗和生产(表24)。本发明的重组微生物涉及SerB活性降低从而以更高的水平生产OPS的任何微生物。如果条件满足，任何微生物，无论是原核的或真核的，都落在本发明的范围内。它们中的典型代表为肠道菌或棒状杆菌。用于本发明的微生物的实例包括埃希氏菌属(Escherichia sp.)、欧文氏菌属(Erwinia sp.)、沙雷氏菌属(Serratia sp.)、普罗维登斯菌属(Providencia sp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)和短杆菌属(Brevibacterium sp)。优选为埃希氏菌属和棒状杆菌属，更优选为埃希氏菌属,最优选为大肠杆菌。在一个实施方案中，将能生产OPS的重组菌株命名为大肠杆菌CA07-0012，并于2011年10月12日保藏于位于韩国首尔市西大门区弘济I洞，361-221的韩国微生物保藏中心(Korean Culture Center of Microorganisms),保藏号为 KCCMl 1212P。此外，在一个实施方案中，将能生产OPS的重组菌株命名为大肠杆菌CA07-0022/pCL-prmf-serA*(G336V) -serC，并于2010年9月28日保藏于位于韩国首尔西大门区弘济I洞，361-221的韩国微生物保藏中心，保藏号为KCCMl1103P。本申请中，术语 “CA07-0022/pCL-prmf-serA*(G336V)-serC” 可与 CA07_0022serA* (G336V) /pCL-prmf-serA* (G336V) -serC 互换使用。菌株在IL发酵罐中培养80小时后，以19. 5g/L的浓度生产0_磷酸丝氨酸(实施例 35)。如本申请中所使用的，术语“培养”是指在人工控制的条件下生产微生物。可使用本领域公知的合适培养基和培养条件实施培养过程。本领域技术人员可易于控制与所使用的菌株相应的培养过程。例如，可以分批型、连续型、补料分批型实施，但不限于此。
此外，培养基含有碳源。碳源的实例包括糖类和碳水化合物如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素，油类和脂肪如豆油、葵花油、蓖麻油和椰油，脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸，醇类如甘油和乙醇，以及有机酸如乙酸。这些碳源可单独存在或组合存在于培养基中。该培养基可含有作为氮源的有机物如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆、大豆和面粉蛋白，或无机氮化合物如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。这些氮源可单独使用或组合使用。培养基可含有磷酸二氢钾、磷酸钾或相应的钠盐作为磷源。培养基可含有金属盐如硫酸镁或硫酸铁。培养基还可含有氨基酸、微生物和适合的前体物。营养元素可以分批的方式或连续的方式添加到培养基中。在培养过程中，可以适宜的方式向培养基加入化合物如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸，以调节培养基的PH值。此外，在培养过程中，可用消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯抑制泡沫的形成。此外，为维持培养基中的富氧环境，可将氧气或含氧的气体注入到培养基中。为维持厌氧或微氧环境，在不通气的条件下提供氮气、氢气或二氧化碳。通常，可将培养基维持在27°C 37°C，优选维持在30°C 35°C。可将培养期维持到获得所需量的目标产物，优选范围为10 100小时。为了进一步在培养过程中从培养基中收集和回收0PS，可根据培养类型，即分批、连续或分批补料培养，选择本领域公知的适宜方法。在本发明的方法中，步骤2)致力于在O-磷酸丝氨酸巯解酶(OPSS)或表达OPSS的微生物存在下，使步骤I)的OPS和硫化物反应，以诱导将O-磷酸丝氨酸转化成半胱氨酸或其衍生物。由于pH、压强和/或溶解度的差异，可以液态或气态以及本领域通常所用的固态形式提供硫化物。只要它能转化成硫醇基(SH)，任何硫化物如硫化物(S2—)或硫代硫酸盐(S2O32O可用于本发明中。优选地，可为OPS提供硫醇基的Na2S、NaSH、H2S、(NH4) 2S、NaSH和Na2S2O3都可使用。在该反应中，一个硫醇基提供给一个OPS分子，以生产一分子的半胱氨酸或其衍生物。在这个酶转化中，优选以所使用OPS摩尔浓度的O. I 3倍，更优选以I 2倍的摩尔浓度添加硫化物。鉴于经济性,提供硫醇基的硫化物和OPS最优选以摩尔比
I I使用。在本发明的一个实施方案中，使用Na2S作为硫源。Na2S以在该转化反应中使用的OPS摩尔浓度的I 3倍进行添加。优选地，以OPS两倍的摩尔浓度进行添加，从而有效地将OPS转化成半胱氨酸(表34)。如本申请中所使用的，术语“O-磷酸丝氨酸巯解酶(OPSS) ”是指催化硫醇基(SH)向OPS (O-磷酸丝氨酸)转移从而将OPS转化成半胱氨酸的酶。该酶首次发现于超嗜热古菌(Aeropyrum pernix)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)中(Mino K 和 Ishikawa K, FEBS letters,551 :133-138,2003;Burns KE 等人，J. Am. Chem. Soc.，127 :11602-11603，2005)。如本申请中所使用的，术语“突变体”是指表现出可遗传或不可遗传的表型改变的培养物或个体。当和OPSS —起使用时，术语“突变体”倾向于指遗传上发生改变的OPSS酶，其与野生型相比有效地增加了活性。在本发明中，可通过缺失、取代或添加一部分编码OPSS核苷酸序列构建OPSS突变。根据本发明的一个实施方案，优选通过缺失耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)OPSS酶C末端的五个氨基酸残基而制备活性提高的OPSS酶。
可在广泛用于酶表达的大肠杆菌中获得OPSS突变体，使用基于密码子优化的基因合成方法，从而高产率地获得目标酶。或者，可使用基于大量微生物遗传信息的生物信息学有用酶来源的筛选方法获得OPSS突变体。在本发明的一个实施方案中，通过在各种微生物中筛选氨基酸的同源序列，选择利用OPS为底物合成半胱氨酸的OPSS酶。在这点上，将使用通过本领域合适培养基和培养条件获得的细胞团进行裂解，接着纯化含有酶的上清生产OPSS酶(表26)。此外，开发了经济地获得OPSS酶的高产率表达系统。使用T7启动子的pET载体是本领域公知的。然而，本发明的发明人开发了一种名为CJl系统(韩国专利10-0620092BI)的酶表达系统，替代常规的系统。在本发明的一个实施方案中，在相同条件下将含有T7启动子的PET系统和含有CJl启动子的CJl系统的OPSS表达水平进行比较。结果，CJl系统表现出比PET系统更高的OPSS表达水平。此外，在pET系统中OPSS的过表达需要低温(18°C)和长时间，但在pCL-pCJl系统中需要高温(37°C)和短时间。优选地，使用pCL-pCJl 系统用于获得OPSS (实施例46)。可使用各种本领域公知的方法实现酶活性的增加。例如，可通过增加编码OPSS基因的拷贝数、使用强启动子或引入基因突变来实现。可使用各种本领域公知的方法实现OPSS酶转化的优化。例如，该优化可基于充分了解OPSS的特性，如最佳的温度和pH、对底物的抑制、底物浓度、热稳定性等。此外，可通过酶转化的最佳条件来确定优化，如最佳OPSS浓度、依据浓度使用的底物的最佳平衡、为酶转化提供SH的优选硫化物、优选的特定缓冲剂、产生的离子的影响和辅因子以及它们的最佳浓度。在本发明的一个实施方案中，将使用上述方法获得的OPSS酶特征化，并且基于确定的特征，开发了经济上有益、具有将OPS向半胱氨酸转化的高转化率并保证酶稳定性的酶转化方法。在该酶转化方法中，反应温度可设置在37°c 80°C，具体地，古细菌(Archea)的Ape-OPSS (SEQ ID NO 12)在60°C的酶活性比37°C的高，并且该酶本身对热的稳定性高，最佳反应性在60°C。另一方面，Msm-T (SEQ ID NO 10)的最佳活性在37°C，并且在60°C热处理时，活性解除。观察到OPSS酶在6. O 10. O的pH范围内具有酶活性。Ape-OPSS在PH7. 4时具有最佳活性。由于Msm-T在8. O 9. O的pH范围内具有最佳活性，因此其与Ape-OPSS相比在更宽的pH范围内表现出稳定性(表28和31，以及图2和3)。作为辅助因子的0.001-2mM PLP (卩比哆醛_5’_磷酸酯)或0.001-100mM DTT可用于酶转化中。在本发明的一个实施方案中，在25mM DTT或0. 2mM PLP存在下，半胱氨酸转化率提高了 2. 3倍。同样地，用DTT或PLP处理提高了步骤2)的半胱氨酸转化率。考虑生产成本的增加和转化率的增加，将辅助因子的添加设置在合理的水平(表30)。OPSS的反应条件可根据所使用的OPSS的种类和浓度而改变。在本发明的一个实施方案中，在各种条件下使用纯OPS (市售获得)、从步骤I)制备的培养物中纯化的OPS以及步骤I)的含有OPS的培养物，以提供最佳的转化率。结果，半胱氨酸转化率根据OPSS的种类和浓度、反应温度以及OPS的种类和浓度而变化(图5和6，表35)。本发明的方法可进一步包括分离和纯化步骤2)生产的半胱氨酸。酶转化以后，可使用本领域公知的方法从培养基中分离和纯化半胱氨酸。本领域技术人员可使用公知的方法通过半胱氨酸化学合成半胱氨酸衍生物。半胱氨酸可易与乙酰化试剂反应而生产NAC(N-乙酰基半胱氨酸)，以及在基本条件下与卤化醋酸反应而生产SCMC (S-羧甲基半胱氨酸)。这些半胱氨酸衍生物用作治疗咳嗽、支气管炎、支气管哮喘和咽喉痛药物中的原料。在本发明中，通过微生物发酵获得的OPS液体培养基用作合成半胱氨酸的底物。通过微生物发酵获得的OPS液体培养基与常规市售获得的纯OPS相比，具有经济上的优势，因为OPS液体培养基不需要额外的纯化就可以使用，而且转化所需的辅助因子PLP可从发酵培养物中获得。在本发明的一个实施方案中，开发了一种转化方法，当使用50 μ g/ml Msm_T,在50mM OPS液体培养基或60mM纯化的OPS培养基、IOOmM Na2S或120mM Na2S和O. 2mM PLP的条件下，这种转化方法能确保高达80 %的半胱氨酸转化率。本领域技术人员应当理解，可易于优化并按比例放大使用高活性酶的酶转化。 根据其另一个方面，本发明提供用于生产OPS的SerB活性降低的重组微生物。在一个实施方案中，重组微生物表现出抗丝氨酸反馈的serA或serC的增加或至少一个选自PhnC/PhnD/PhnE烷基磷酸酯ABC转运蛋白(phnCDE操纵子)、碱性磷酸酶(phoA)和酸性磷酸酶(aphA)的缺失。优选地，生产OPS的重组微生物为保藏号为KCCM11103P或KCCM11212P的保藏微生物。更优选地，生产OPS的重组微生物为保藏号为KCCMl 1103P的微生物。发明实施方式通过下述实施例可更好地了解本发明，所述实施例用于说明而非旨在限制本发明。〈制备生产O-磷酸丝氨酸的棒状杆菌(Corynebacterium)和使用该棒状杆菌生产
O-磷酸丝氨酸>实施例I :制备磷酸丝氨酸磷酸酶(serB)缺失的棒状杆菌菌株通过使编码催化由O-磷酸丝氨酸合成L-丝氨酸的磷酸丝氨酸磷酸酶的serB基因(SEQ ID NO 13,EC 3. 1.3.3)从谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum) 13032上发生缺失，从而对其进行修饰。将用于失活serB的片段构建到这个末端。为此，设计用于制备本发明的重组菌株13032-Λ serB的引物。首先，根据NIH GenBank的数据，获得谷氨酸棒状杆菌13032的serB序列，并且基于该serB序列合成SEQ ID NOS 22 27所示的引物。为了进行位点特异性基因中断(gene disruption),使用不能在谷氨酸棒状杆菌中复制的pDC载体。构建其中serB的开放阅读框被内部受到破坏的pDC-Δ serB质粒,用于在谷氨酸棒状杆菌的突变菌株中制备位点特异性serB基因缺失。通过使用SEQ ID NOS :22和23以及SEQ ID N0S:24和25的引物对，以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA为模板，进行交叉PCR，并将PCR产物导入到pDC载体中，产生pDC-AserB的内部基因中断。通过电穿孔，将产生的重组质粒转化到野生型谷氨酸棒状杆菌中van der Rest等人，1999)。通过初级重组(交换)，再进行二级重组(交换)将质粒导入到染色体，以从染色体中切除原始serB。完成二级重组后，用SEQ ID NOS 26和27所示的一对基因特异性引物进行诊断PCR,分析含有serB缺失突变的谷氨酸棒状杆菌转化子。将重组菌命名为CB01-0047。实施例2 :磷酸丝氨酸磷酸酶缺失型棒状杆菌菌株的O-磷酸丝氨酸生产率试验将谷氨酸棒状杆菌13032发生serB缺失而产生的预期积累O-磷酸丝氨酸的突变菌株CB01-0047涂布于BHIS平板，并在30°C培养箱中培养过夜。此后，用钼环将出现在BHIS平板上的菌落接种到如表I所示25mL的滴度培养基(titer medium)中，然后于30°C、200rpm振荡培养48小时。结果概述与下表2中。表I
权利要求
1.生产半胱氨酸或其衍生物的方法，其包括 1)培养其中内源磷酸丝氨酸磷酸酶(SerB)活性降低的重组微生物，以生产O-磷酸丝氨酸(OPS);以及 2)在O-磷酸丝氨酸巯解酶(OPSS)或表达OPSS的微生物存在下，使步骤I)的OPS和硫化物进行反应，以生产半胱氨酸或其衍生物。
2.根据权利要求I所述的方法，其中所述磷酸丝氨酸磷酸酶具有SEQID N0:1或2所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求I所述的方法，其中通过选自下组的方法降低酶活性缺失编码该酶的染色体基因、向染色体基因中引入突变以降低内源基因活性、用突变基因取代染色体基因以降低内源酶活性、向基因的调控区引入突变以降低内源基因活性，以及引入与基因转录本互补的反义寡核苷酸以抑制mRNA的翻译。
4.根据权利要求3所述的方法，其中内源SerB活性被降低的重组微生物培养于含有甘氨酸或丝氨酸的培养基中。
5.根据权利要求4所述的方法，其中培养基所含的甘氨酸的量为O.I 10g/L。
6.根据权利要求4所述的方法，其中培养基中所含的丝氨酸的量为O.I 5g/L。
7.根据权利要求I所述的方法，其中所述重组微生物被进一步改性，以增加磷酸甘油酸脱氢酶(SerA)或磷酸丝氨酸氨基转移酶(SerC)的活性。
8.根据权利要求7所述的方法，其中SerA为野生型或抗丝氨酸反馈抑制的突变体。
9.根据权利要求7所述的方法，其中 i)SerA具有选自SEQ ID NOS 3 7的一种氨基酸序列；以及 ii)SerC具有SEQ ID NO 8的氨基酸序列。
10.根据权利要求I所述的方法，其中所述重组微生物被进一步改性，以降低PhnCDE (phnC (磷酸酯转运蛋白EG 10713的ATP结合组分)-phnD (Pn转运蛋白EG 10714的周质结合组分)-PhnE (烷基磷酸酯ABC转运蛋白EG 11283的整体膜组分))。
11.根据权利要求I所述的方法，其中所述重组微生物被进一步改性，以降低碱性磷酸酶(PhoA)或酸性磷酸酶(AphA)的活性。
12.根据权利要求I所述的方法，其中所述重组微生物被进一步改性，以增加核苷酸转氢酶(PntAB)的活性。
13.根据权利要求I所述的方法，其中所述重组微生物被进一步改性，以增加失少一种选自下组酶的活性0-乙酰基丝氨酸/半胱氨酸外排透性酶(YfiK)、高丝氨酸/高丝氨酸内酯外排蛋白(RhtB)，以及苏氨酸/高丝氨酸外排蛋白(RhtC)。
14.根据权利要求7、12或13所述的方法，其中通过选自下述的方法增加酶活性水平增加编码酶的基因的拷贝数、向基因调控区引入突变以增加酶活性、用突变基因取代染色体基因以增加酶活性，以及向染色体基因引入突变以增加酶活性。
15.根据权利要求I所述的方法，其中所述重组微生物被进一步改性，以降低至少一种选自下组的酶的活性磷酸甘油酸变位酶同工酶(GpmA、GpmI或GpmB)。
16.根据权利要求I所述的方法，其中所述重组微生物被进一步改性，以降低L-丝氨酸脱水酶I (SdaA)的活性。
17.根据权利要求I所述的方法，其中所述重组微生物被进一步改性，以降低2-氨基-3-酮丁酸辅酶A连接酶(Kbl)或转录因子(IclR)的活性。
18.根据权利要求I所述的方法，其中所述重组微生物被进一步改性，以增加至少一种选自下组的酶的活性乙酰基-CoA合成酶(Acs)、乙酸激酶(AckA)-磷酸转乙酰基酶(Pta)、苹果酸合成酶G(GlcB)、苹果酸脱氢酶(MaeB)、谷氨酸脱氢酶(GdhA)、乙醛酸醛连接酶(Glc)、羟丙二酸半醛还原酶2 (GlxR)和甘油酸激酶II (GlxK)。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述重组微生物通过增加至少一种选自下组的酶的活性而在糖消耗和生长方面得到改善Glc、GlxR以及GlxK。
20.根据权利要求I所述的方法，其中所述重组微生物为埃希氏菌属(Escherichiasp.)或棒状杆菌(Coryneform bacteria)。
21.根据权利要求I所述的方法，其中步骤2)的硫化物选自下组Na2S、NaSH、(NH4)2S,H2S、Na2S2O3和其组合。
22.根据权利要求I所述的方法，其中步骤2)中使用的硫化物的摩尔浓度为酶转化中所用OPS的O. I 3倍。
23.根据权利要求I所述的方法，其中步骤2)的OPSS源自至少一种选自下述的菌种超嗜热古菌(Aeropyrum pernix)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)和阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)。
24.根据权利要求23所述的方法，其中OPSS被进一步改性，以增加步骤2)的转化率。
25.根据权利要求I所述的方法，其中在选自O.001 2mM PLP (吡哆醛-5-磷酸酯)、O. 001 IOOmM DTT (二硫苏糖醇)和其组合的辅助因子的存在下，进行步骤2)的转化。
26.根据权利要求I所述的方法，其进一步包括纯化分离和纯化半胱氨酸或其衍生物。
27.重组微生物，其内源SerB的活性被降低。
28.根据权利要求27所述的重组微生物，其被进一步改性，以增加SerA或SerC的活性，其中所述SerA抗丝氨酸的反馈抑制。
29.根据权利要求27所述的重组微生物，其被进一步改性，以降低Phn⑶E、PhoA和AphA中至少一种的活性。
30.根据权利要求27所述的重组微生物，其保藏号为KCCMl1103P。
全文摘要
本发明涉及用O-磷酸丝氨酸作为中间体生产半胱氨酸或其衍生物的方法以及用于生产O-磷酸丝氨酸的重组微生物。
文档编号C12N15/54GK102906272SQ201180002042
公开日2013年1月30日 申请日期2011年10月18日 优先权日2010年10月20日
发明者申秀安, 严惠媛, 张真淑, 裵贤爱, 全成后, 赵宰贤, 宋秉哲, 李京珉, 梁殷彬, 申容旭, 金蕙园, 金率 申请人:Cj第一制糖株式会社