专利名称：制备具有高唾液酸含量的重组糖蛋白的方法
技术领域：
本申请涉及制备具有高唾液酸含量的重组糖蛋白的方法。
背景技术：
唾液酸(Sia，NeuAc，NeuGc)是对神经氨酸(Neu)的酰基衍生物的通称。唾液酸最早由Blix在1936年从牛唾液腺的粘蛋白中分离出，它是包含9个碳并具有COOH基团的酸性糖。根据取代基团的不同，已经报道了 50种唾液酸(Angata，T.和Varki，A. ,Chem. Rev, 102,439-469,2002)，已知这50种唾液酸在不同的物种和组织中特异地分布。在高等动物中，通过各自的特异性唾液酸转移酶的反应，唾液酸经α -糖苷键连接至糖蛋白、糖脂及寡糖聚糖的fell、GlcNAc、GalNAc和唾液酸。由于糖缀合聚糖的唾液酸位于聚糖结构的末端，而该末端存在于细胞膜表面上， 已预期唾液酸直接参与细胞与胞外环境之间的接触，并且近期已知通过去除唾液酸缩短了体液中的血细胞或糖蛋白的寿命。例如，当去除红细胞膜上的唾液酸(脱唾液酸化作用 (asialylation))时，半乳糖暴露于细胞表面上并结合至枯否细胞(Kupffer cell)表面上的受体凝集素，该凝集素特异地结合至半乳糖。由此，通过受体介导的胞吞作用，半乳糖被从循环系统中去除，而已去除唾液酸的脱唾液酸糖蛋白也被肝细胞表面上的凝集素结合， 并被以类似于红细胞的上述方式从循环系统中去除。此外，对于α-抗胰蛋白酶、胆碱酯酶、绒毛膜促性腺激素、CTLA4Ig、第八因子(Factor VIII)、Y -谷氨酰转移酶、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和促黄体生成激素(LH)这些唾液酸化糖蛋白，据报道与未结合唾液酸的糖蛋白相比，结合有唾液酸的糖蛋白半衰期显著延长(Ngantung FA.等，2006，Biotechnol. Bioeng,95(1)，106，106-119)。特别地，在唾液酸化糖蛋白中，促红细胞生成素(EPO)是诱导红细胞生成的糖蛋白激素，重组促红细胞生成素正被用作贫血的治疗剂。野生型促红细胞生成素含有3个 N-聚糖和1个0-聚糖。由于1个N-聚糖最多可结合4个唾液酸且1个0-聚糖最多可结合2个唾液酸，1个促红细胞生成素分子有可能一共结合14个唾液酸。结合有聚糖的唾液酸阻断了存在于肝中的脱唾液酸糖蛋白受体的结合，从而防止了肝中促红细胞生成素的分解。促血小板生成素(TPO)是类似于EPO的激素，主要由肝和肾产生，TPO调节骨髓中的血小板生成。TPO由332个氨基酸组成，分子量大约为80 IOOkDa,具有6个N-聚糖和M个0-聚糖。起始的155个氨基酸与EPO非常类似，就如EPO的糖蛋白而言，聚糖的唾液酸含量显著地影响了该蛋白的体内稳定性。通过用唾液酸酶从EPO中去除全部唾液酸后，观察到EPO体内活性显著下降而证实了上述事实(Takeuchi M等，1989，ft~OC Natl Acad ki，7819-22)。对于EPO而言，聚糖的结构具有四天线、四唾液酸化及核心岩藻糖基化的形式，就重组人TPO而言，各种聚糖结构具有二天线或异源的形式(Inous N等，1999， Glycoconjugate Journal，16，707-718)。因此，糖蛋白的唾液酸含量提高越多，糖蛋白在体内的半衰期就变得越长(Fukuda, Μ. N.等，1989，Blood, 73，84-89 ；Sinclair, Α. Μ.等，2005，J. Pharm. Sci.，94， 1626-1635)。因此，唾液酸含量的提高对于治疗性糖蛋白的品质和生物等效性而言是必需的。因此，本发明人等研究了通过提高唾液酸化糖蛋白(如促红细胞生成素和促血小板生成素)的唾液酸含量来增强内在活性的方法。结果，本发明人等通过在产生人促红细胞生成素或促血小板生成素的细胞中同时过表达CMP-唾液酸转运体(CMP-SAT)、α-2， 3-唾液酸转移酶和诱导有点突变的UDP-GlcNAc 2-表异构酶/ManNAc激酶(GNE/MNK)，并鉴定出促红细胞生成素和促血小板生成素的唾液酸含量相比于野生型的唾液酸含量显著提高而完成了本发明。
发明内容
本发明一个目的是提供制备具有高唾液酸含量的重组糖蛋白的方法。为实现所述目的，本发明提供了制备唾液酸含量提高的糖蛋白的方法，所述方法包括1)制备包含编码UDP-GlcNAc 2_表异构酶/ManNAc激酶(GNE/MNK)的基因、编码 α -2,3-唾液酸转移酶的基因以及编码单磷酸胞苷(CMP)-唾液酸转运体的基因的表达载体，所述GNE/MNK具有SEQ ID NO :1所表示的氨基酸序列中的263位氨基酸或266位氨基酸被取代的氨基酸序列，所述α _2，3-唾液酸转移酶具有SEQ ID NO :4所表示的氨基酸序列，所述CMP-唾液酸转运体具有SEQ ID NO 5所表示的氨基酸序列；2)将步骤1)中的所述表达载体转染入产生唾液酸化糖蛋白的宿主细胞中以制备转染子；以及3)孵育步骤2、中的所述转染子以从所述转染子中纯化出重组糖蛋白。本发明也提供了通过所述方法制备的唾液酸含量提高的糖蛋白。本发明还提供了制备胞内CMP-唾液酸含量提高的细胞的方法，所述方法包括1)制备包含编码GNE/MNK的基因、编码α-2，3_唾液酸转移酶的基因以及编码 CMP-唾液酸转运体的基因的表达载体，所述GNE/MNK具有SEQ ID NO 1所表示的氨基酸序列中的263位氨基酸或266位氨基酸被取代的氨基酸序列，所述α -2,3-唾液酸转移酶具有SEQ ID NO :4所表示的氨基酸序列，所述CMP-唾液酸转运体具有SEQ ID NO :5所表示的氨基酸序列；以及2)将步骤1)中的表达载体转染入宿主细胞中以制备转染子。本发明也提供了制备胞内CMP-唾液酸含量提高的细胞的方法，所述方法包括1)制备包含编码GNE/MNK的基因的表达载体，所述GNE/MNK具有SEQ ID NO 1所表示的氨基酸序列中的263位氨基酸或266位氨基酸被取代的氨基酸序列；以及2)将步骤1)中的所述表达载体转染入宿主细胞中以制备转染子。本发明也提供了通过所述方法制备的胞内CMP-唾液酸含量提高的细胞。在产生糖蛋白的宿主细胞中，同时过表达人α-2，3-唾液酸转移酶基因、CMP-唾液酸转运体基因和诱导有点突变的GNE/MNK基因。所述诱导有点突变的GNE/MNK基因仅用亮氨酸取代263位的精氨酸，或进一步用谷氨酰胺或色氨酸取代266位的精氨酸。因此，由于宿主细胞中的胞内CMP-唾液酸含量及促红细胞生成素和促血小板生成素中的唾液酸增力口，在产生唾液酸化重组糖蛋白的宿主细胞中过表达上述3种基因可用于制备相比于野生型糖蛋白而言唾液酸含量提高的糖蛋白。
从与附图结合的下列详细描述中，将更清楚地理解本发明的上述和其它目的、特征和其它优点，其中图1为表示所制备的用于在微生物中过表达诱导有突变的UDP-GlcNAc 2_表异构酶/ManNAc激酶(GNE/MNK)酶的表达载体的图；图2为表示随CMP-唾液酸浓度的GNE/MNK表异构酶活性的图表㈧和表示根据各点突变诱导的表异构酶的相对比活性的图表⑶；图3为表示所制备的用于在中国仓鼠卵巢细胞中过表达α-2，3-唾液酸转移酶的表达载体的图；图4为表示所制备的用于在中国仓鼠卵巢细胞中过表达CMP-唾液酸转运体的表达载体的图；图5为表示所制备的用于在中国仓鼠卵巢细胞中过表达诱导有点突变的GNE/MNK 基因的表达载体的图；图6为表示通过RT-PCR鉴定转染入中国仓鼠卵巢细胞中的点突变的GNE/MNK基因的表达的图；图7为表示过表达了点突变的GNE/MNK基因的胞内CMP-唾液酸含量的图表；图8为表示转染入中国仓鼠卵巢细胞中的α-2，3-唾液酸转移酶基因㈧和点突变的GNE/MNK基因(B)的表达的图；图9为表示转染了点突变的GNE/MNK基因、人α-2，3-唾液酸转移酶基因和 CMP-唾液酸转运体基因的中国仓鼠卵巢细胞中的CMP-唾液酸转运体的转录产物成倍增长的图表；图10为表示转染了点突变的GNE/MNK基因、人α-2，3-唾液酸转移酶基因和 CMP-唾液酸转运体基因的中国仓鼠卵巢细胞中的胞内CMP-唾液酸含量的图表；图11为表示转染了点突变的GNE/MNK基因、人α-2，3-唾液酸转移酶基因和 CMP-唾液酸转运体基因的中国仓鼠卵巢细胞中通过等电聚焦(IEF)迁移到负电荷处的促红细胞生成素亚型的图；图12为表示转染了点突变的GNE/MNK基因、人α-2，3-唾液酸转移酶基因和 CMP-唾液酸转运体基因的中国仓鼠卵巢细胞中的重组促红细胞生成素的唾液酸含量的图表；以及图13为表示由阴离子交换HPLC得到的促红细胞生成素的N-连接型聚糖的唾液酸化图谱的图。
具体实施例方式在下文中，将对本发明进行详细描述。本发明提供了制备唾液酸含量提高的糖蛋白的方法。上述方法优选包括、但不限于以下步骤
1)制备包含编码UDP-GlcNAc 2_表异构酶/ManNAc激酶(GNE/MNK)的基因、编码 α -2,3-唾液酸转移酶的基因以及编码单磷酸胞苷(CMP)-唾液酸转运体的基因的表达载体，所述GNE/MNK具有SEQ ID NO :1所表示的氨基酸序列中的263位氨基酸或266位氨基酸被取代的氨基酸序列，所述α _2，3-唾液酸转移酶具有SEQ ID NO :4所表示的氨基酸序列，所述CMP-唾液酸转运体具有SEQ ID NO 5所表示的氨基酸序列；2)将步骤1)中的所述表达载体转染入产生唾液酸化糖蛋白的宿主细胞中以制备转染子；以及3)孵育步骤2、中的所述转染子以从所述转染子中纯化出重组糖蛋白。所述糖蛋白优选为选自于由促红细胞生成素、促血小板生成素、α-抗胰蛋白酶、 胆碱酯酶、绒毛膜促性腺激素、CTLA4Ig、第八因子、γ -谷氨酰转移酶、粒细胞集落刺激因子 (G-CSF)和促黄体生成激素(LH)所组成的组中的一种，更优选为促红细胞生成素或促血小板生成素，但不限于此。在上述方法中，在步骤1)中的GNE/MNK中，优选、但不限于由亮氨酸取代其263位的精氨酸。在所述GNE/MNK中，优选、但不限于由谷氨酰胺或色氨酸取代其266位的精氨酸。 在所述GNE/MNK中，更优选由亮氨酸取代其263位的精氨酸且优选由谷氨酰胺或色氨酸取代其266位的精氨酸，但不限于此。在上述方法中，步骤幻中的宿主细胞优选为选自于由酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞所组成的组中的一种，但不限于此。所述哺乳动物细胞优选为选自于由中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、HT-1080、人类淋巴母细胞、SP2/0(小鼠骨髓瘤细胞)、NS0 (小鼠骨髓瘤细胞)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、人胚肾细胞(HEK)、PERC. 6(人视网膜细胞)所组成的组中的一种，更优选为CH0，但不限于此。在具有263位氨基酸或266位氨基酸被取代的氨基酸序列的GNE/MNK中，表异构酶活性优选得以维持但并不限于此，而不受CMP-唾液酸浓度的影响。传统地，由患有遗传性代谢途径疾病(如唾液酸尿症(sialuria))的患者的遗传分析结果，报道了在UDP-GlcNAc 2-表异构酶/ManNAc激酶(GNE/MNK)基因中出现了由沈3 位的精氨酸氨基酸突变为亮氨酸、或由266位的精氨酸氨基酸突变为谷氨酰胺或色氨酸的点突变(R263L、和M66Q或R266W)，该位点为表异构酶的变构位点。由于CMP-唾液酸在正常状态细胞中积聚，表异构酶的反馈抑制由于所述点突变而消失，鉴定出唾液酸过度合成并超出需求地积聚(Seppala,R.等，1999，Am. J. Hum. Genet.，64，1563-1569)。然而，由于一直没有通过利用表异构酶的反馈抑制来提高糖蛋白(如促红细胞生成素和促血小板生成素)的唾液酸含量的研究，本发明人等意在研究出通过利用GNE/MNK基因的点突变来提高结合有唾液酸的糖蛋白的唾液酸含量的方法。本发明人等意在通过对UDP-GlcNAc 2_表异构酶/ManNAc激酶(GNE/MNK)的点突变鉴定出对该酶的表异构酶活性的影响，UDP-GlcNAc 2-表异构酶/ManNAc激酶参与唾液酸的合成代谢途径。因此，本发明人等通过用亮氨酸取代野生型GNE/MNK基因263位的精氨酸、通过用谷氨酰胺或色氨酸取代GNE/MNK基因266位的精氨酸、或通过用亮氨酸取代野生型GNE/MNK基因263位的精氨酸并用谷氨酰胺或色氨酸取代GNE/MNK基因266位的精氨酸诱导点突变(参见图1)，并将其插入表达载体中以在大肠杆菌中过表达。纯化过表达的 GNE/MNK酶后，测定表异构酶活性。结果，对于诱导了点突变的各类GNE/MNK，显示其表异构酶活性维持不变，而不受CMP-唾液酸浓度提高的影响，这一点不同于野生型GNE/MNK (参见图2)。因此，发现相比于正常状态细胞，表达点突变的GNE/MNK酶的细胞可合成并积聚更多的CMP-唾液酸。为了鉴定由点突变的GNE/MNK过表达引起的CMP-唾液酸含量的变化，本发明人等制备了点突变的GNE/MNK (M63L或R263L-R266Q)的表达载体(参见图幻，将该表达载体转染入中国仓鼠卵巢细胞中并在该细胞中过表达所述表达载体，所述中国仓鼠卵巢细胞为产生重组促红细胞生成素的宿主细胞。结果，通过聚合酶链式反应(PCR)鉴定了所述宿主细胞中的点突变的GNE/MNK基因的过表达(参见图6)，在聚糖末端唾液酸化中用作底物的 CMP-唾液酸的胞内含量相比于野生型宿主细胞显示出提高(参见图7)。本发明人等意在研究由α -2,3-唾液酸转移酶、CMP-唾液酸转运体和点突变的 GNE/MNK的过表达引起的糖蛋白唾液酸含量的变化，所述α-2，3-唾液酸转移酶为将唾液酸连接至N-连接型聚糖的半乳糖残基的酶。因此，本发明人等制备了所述α _2，3-唾液酸转移酶、CMP-唾液酸转运体和点突变的GNE/MNK的表达载体(参见图3、图4和图幻，将所述表达载体转染入中国仓鼠卵巢细胞中并在该细胞中过表达所述表达载体，所述中国仓鼠卵巢细胞为产生重组促红细胞生成素或促血小板生成素的宿主细胞。结果，通过PCR鉴定了所述全部3种基因的过表达(参见图8和图9)，并且胞内CMP-唾液酸含量显示出提高(参见图10)。为了根据从所述细胞中纯化的促红细胞生成素的分子电荷总量鉴定亚型，在导入了所述3种基因的细胞系中进行等电聚焦(IEF)分析，由于唾液酸含量的提高，所有亚型都迁移至负极(参见图11)。此外，相比于野生型细胞，产生的重组促红细胞生成素和促血小板生成素的唾液酸含量显示出显著的提高(参见图1 。另外，为了更准确地分析促红细胞生成素的N-连接型聚糖中唾液酸的结合形式，作为通过阴离子交换HPLC进行的N-连接型聚糖唾液酸化图谱分析的结果，本发明人鉴定出，在导入了所述3种基因的细胞系中，中性唾液酸化聚糖和单唾液酸化聚糖的比例显著降低，而四唾液酸化聚糖的比例大幅提高(图 13)。因此，已发现通过将α -2，3-唾液酸转移酶、CMP-唾液酸转运体和点突变的GNE/MNK 导入产生重组促红细胞生成素或促血小板生成素的细胞中，胞内CMP-唾液酸含量提高，促红细胞生成素和促血小板生成素的唾液酸含量也由此提高。因此，通过在产生唾液酸化重组糖蛋白的宿主细胞中过表达α-2，3_唾液酸转移酶、CMP-唾液酸转运体和点突变的GNE/MNK，将α -2，3-唾液酸转移酶、CMP-唾液酸转运体和点突变的GNE/MNK用于制备唾液酸含量提高的糖蛋白。此外，本发明提供了通过所述方法制备的唾液酸含量提高的糖蛋白。所述唾液酸含量提高的糖蛋白优选为选自于由促红细胞生成素、促血小板生成素、α-抗胰蛋白酶、胆碱酯酶、绒毛膜促性腺激素、CTLA4Ig、第八因子、谷氨酰转移酶、 粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和促黄体生成激素(LH)所组成的组中的一种，更优选为促红细胞生成素或促血小板生成素，但不限于此。所述唾液酸含量提高的糖蛋白优选、但不限于唾液酸/糖蛋白的摩尔比为7。在产生促红细胞生成素或促血小板生成素的宿主细胞中同时过表达人α _2， 3-唾液酸转移酶、CMP-唾液酸转运体和GNE/MNK，在该GNE/MNK中，通过用亮氨酸取代沈3 位的精氨酸、或通过用亮氨酸取代263位的精氨酸并用谷氨酰胺或色氨酸取代266位的精氨酸诱导了点突变。由于在所述产生促红细胞生成素或促血小板生成素的宿主细胞中，胞内CMP-唾液酸含量以及促红细胞生成素和促血小板生成素的唾液酸含量提高，通过过表达所述3种基因制备的唾液酸化糖蛋白可以有用地用作唾液酸含量提高的糖蛋白。此外，本发明提供了制备胞内CMP-唾液酸含量提高的细胞的方法。所述方法包括、但不限于以下步骤1)制备包含编码GNE/MNK的基因、编码α-2，3_唾液酸转移酶的基因以及编码 CMP-唾液酸转运体的基因的表达载体，所述GNE/MNK具有SEQ ID NO 1所表示的氨基酸序列中的263位氨基酸或266位氨基酸被取代的氨基酸序列，所述α -2,3-唾液酸转移酶具有SEQ ID NO :4所表示的氨基酸序列，所述CMP-唾液酸转运体具有SEQ ID NO :5所表示的氨基酸序列；以及2)将步骤1)中的表达载体转染入宿主细胞中以制备转染子。进一步地，所述方法包括、但不限于以下步骤 1)制备包含编码GNE/MNK的基因的表达载体，所述GNE/MNK具有SEQ ID NO 1所表示的氨基酸序列中的263位氨基酸或266位氨基酸被取代的氨基酸序列；以及2)将步骤1)中的表达载体转染入宿主细胞中以制备转染子。在上述方法中，优选、但不限于由亮氨酸取代步骤1)中263位的精氨酸。在所述 GNE/MNK中，优选、但不限于由谷氨酰胺或色氨酸取代266位的精氨酸。在所述GNE/MNK中， 优选由亮氨酸取代263位的精氨酸并优选由谷氨酰胺或色氨酸取代266位的精氨酸，但不限于此。在上述方法中，步骤幻中的宿主细胞优选为选自于由酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞所组成的组中的一种，但不限于此。所述哺乳动物细胞优选为选自于由中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、HT-1080、人类淋巴母细胞、SP2/0(小鼠骨髓瘤细胞)、NS0(小鼠骨髓瘤细胞)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、人胚肾细胞(HEK)、PERC.6(人视网膜细胞)所组成的组中的一种，更优选为CH0，但不限于此。CMP-唾液酸为唾液酸的活性形式，应在细胞中维持高水平以提高糖蛋白的唾液酸含量。在将α -2，3-唾液酸转移酶、CMP-唾液酸转运体和点突变的GNE/MNK的表达载体转染入产生重组促红细胞生成素或促血小板生成素的宿主细胞中国仓鼠卵巢细胞中后，与野生型宿主细胞相比，其胞内CMP-唾液酸含量显著提高。在将点突变的GNE/MNK的表达载体转染入产生促红细胞生成素的中国仓鼠卵巢细胞中后，相比于野生型宿主细胞，其胞内CMP-唾液酸含量显著提高。在天然型GNE/MNK中，已知当唾液酸的胞内前体CMP-唾液酸的浓度提高时，由于通过反馈抑制机制抑制了天然型UDP-GlcNAc 2-表异构酶的活性， 最终阻止了唾液酸的合成。如上所述，通过取代GNE/MNK的特定氨基酸序列，由于唾液酸合成途径中的活性得以维持并且由CMP-唾液酸引起的反馈抑制机制不起作用，因而胞内的 CMP-唾液酸得以充分维持。因此，通过在产生唾液酸化重组糖蛋白的宿主细胞中过表达α-2，3_唾液酸转移酶、CMP-唾液酸转运体和点突变的GNE/MNK ；或通过过表达点突变的GNE/MNK，可将α -2， 3-唾液酸转移酶、CMP-唾液酸转运体和点突变的GNE/MNK有用地用于制备胞内CMP-唾液酸含量提高的细胞。此外，本发明提供了通过所述方法制备的CMP-唾液酸含量提高的细胞。
在将α -2，3-唾液酸转移酶、CMP-唾液酸转运体和GNE/MNK (该GNE/MNK通过用亮氨酸取代263位的精氨酸、或通过用亮氨酸取代263位的精氨酸且用谷氨酰胺或色氨酸取代266位的精氨酸诱导了点突变)的表达载体转染入产生重组促红细胞生成素或促血小板生成素的宿主细胞中国仓鼠卵巢细胞中后，与野生型宿主细胞相比，其胞内CMP-唾液酸含量显著提高。在将点突变的GNE/MNK的表达载体转染入产生促红细胞生成素的中国仓鼠卵巢细胞中后，与野生型宿主细胞相比，其胞内CMP-唾液酸含量显著提高。如上所述，通过取代GNE/MNK的特定氨基酸序列，胞内的CMP-唾液酸得以充分维持。因此，通过在产生唾液酸化重组糖蛋白的宿主细胞中过表达α-2，3-唾液酸转移酶、CMP-唾液酸转运体和点突变的GNE/MNK ；或通过过表达点突变的GNE/MNK所制备的细胞可有用地用作胞内CMP-唾液酸含量提高的细胞。实施例下文将参考以下实施例和实验实施例来更加详细地描述本发明。然而，以下实施例和实验实施例仅为说明性目的提供，并不应以任何方式限定本发明的范围。实施例1 :UDP_GlcNAc 2-表异构酶/ManNAc激酶(GNE/MNK)基因的点突变诱导<1-1>GNE/MNK基因263位氨基酸或266位氨基酸的取代通过利用正向引物(5‘ -ATGGAGAAGAACGGGAATAACCGG-3 ‘，SEQ ID NO :6)禾口反向引物(5' -CTAGTGGATCCTGCGGGTCGTGTAG-3 ‘，SEQ ID NO :7)经 PCR 从褐家鼠(Rattus norvegicus)的月干组织(从 Korea Advanced Institute of Science and Technology 获得)中扩增野生型GNE/MNK基因(SEQ ID NO : 1)，然后，通过表1中所示的诱导点突变的引物和 QuickChange Site-Directed Mutagenesis 试剂盒(Stratagene)，利用用于点突变的正向引物(5 ‘ -GGAGATGGTTCTAGTGATGCGAAG-3 ‘，SEQ ID NO :8)和反向引物(5 ‘ -CCTCTA CCAAGATCACTACGCCTTC-3 ‘，SEQ ID NO :9)，用亮氨酸取代洸3 位的精氨酸(SEQ ID NO 2)； 或用谷氨酰胺或色氨酸取代266位的精氨酸。<1-2>GNE/MNK基因263位氨基酸或266位氨基酸的取代根据上述实施例<1_1>的方法，利用正向引物 (5 ‘ -ATGGAGAAGAACGGGAATAACCGG-3 ‘，SEQ ID NO 6)和反向引物(5 ‘ -CTAGTGGATC CTGCGGGTCGTGTAG-3 ‘，SEQ ID NO 7)经 PCR 扩增野生型 GNE/MNK 基因(SEQ ID N0: 1)，然后，通过表1中所示的诱导点突变的引物，使用用于点突变的另一正向引物 (5' -GGAGATGGTCTAGTGATGCAGAAG-3 ‘，SEQ ID NO 10)和反向引物(5 ‘ -CCTCTACCAAGATC ACTACGTCTTC-3'，SEQ ID NO 11)，用亮氨酸取代沈3位的精氨酸并用谷氨酰胺取代沈6位的精氨酸(SEQ ID NO 3)；或用亮氨酸取代263位的精氨酸并用色氨酸取代266位的精氨酸。表1用于诱导唾液酸尿症样点突变的引物序列
权利要求
1.制备唾液酸含量提高的糖蛋白的方法，所述方法包括1)制备包含编码UDP-GlcNAc2-表异构酶/ManNAc激酶(GNE/MNK)的基因、编码α-2， 3-唾液酸转移酶的基因以及编码单磷酸胞苷(CMP)-唾液酸转运体的基因的表达载体，所述GNE/MNK具有SEQ ID NO 1所表示的氨基酸序列中的263位氨基酸或266位氨基酸被取代的氨基酸序列，所述α-2，3-唾液酸转移酶具有SEQ ID NO :4所表示的氨基酸序列，所述 CMP-唾液酸转运体具有SEQ ID NO 5所表示的氨基酸序列；2)将步骤1)中的所述表达载体转染入产生唾液酸化糖蛋白的宿主细胞中以制备转染子；以及3)孵育步骤幻中的所述转染子以从所述转染子中纯化出重组糖蛋白。
2.如权利要求1中所述的方法，其中，所述糖蛋白选自于由促红细胞生成素、促血小板生成素、α-抗胰蛋白酶、胆碱酯酶、绒毛膜促性腺激素、CTLA4Ig、第八因子、Y -谷氨酰转移酶、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和促黄体生成激素(LH)所组成的组中的一种。
3.如权利要求1中所述的方法，其中，用亮氨酸取代所述步骤1)中的所述GNE/MNK中 263位的精氨酸。
4.如权利要求1中所述的方法，其中，用谷氨酰胺或色氨酸取代所述步骤1)中的所述 GNE/MNK中266位的精氨酸。
5.如权利要求1中所述的方法，其中，用亮氨酸取代所述步骤1)中的所述GNE/MNK中 263位的精氨酸、并用谷氨酰胺或色氨酸取代所述步骤1)中的所述GNE/MNK中266位的精氨酸。
6.如权利要求1中所述的方法，其中，所述步骤2)中的所述宿主细胞选自于由酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞所组成的组中的一种。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞选自于由中国仓鼠卵巢细胞 (CHO)、HT-1080、人类淋巴母细胞、SP2/0(小鼠骨髓瘤细胞)、NSO (小鼠骨髓瘤细胞)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、人胚肾细胞(HEK)和PERC.6(人视网膜细胞)所组成的组中的一种。
8.通过如权利要求1所述的方法制备的唾液酸含量提高的糖蛋白。
9.如权利要求8所述的糖蛋白，其中，所述唾液酸含量提高的糖蛋白的唾液酸/糖蛋白的摩尔比为7以上。
10.如权利要求8中所述的糖蛋白，其中，所述糖蛋白选自于由促红细胞生成素、促血小板生成素、α-抗胰蛋白酶、胆碱酯酶、绒毛膜促性腺激素、CTLA4Ig、第八因子、Y -谷氨酰转移酶、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和促黄体生成激素(LH)所组成的组中的一种。
11.制备胞内CMP-唾液酸含量提高的细胞的方法，所述方法包括1)制备包含编码UDP-GlcNAc2-表异构酶/ManNAc激酶(GNE/MNK)的基因、编码α-2， 3-唾液酸转移酶的基因以及编码CMP-唾液酸转运体的基因的表达载体，所述GNE/MNK具有SEQ ID No :1所表示的氨基酸序列中的263位氨基酸或266位氨基酸被取代的氨基酸序列，所述α -2，3-唾液酸转移酶具有SEQ ID NO 4所表示的氨基酸序列，所述CMP-唾液酸转运体具有SEQ ID NO :5所表示的氨基酸序列；以及2)将步骤1)中的所述表达载体转染入宿主细胞中以制备转染子。
12.制备胞内CMP-唾液酸含量提高的细胞的方法，所述方法包括1)制备包含编码GNE/MNK的基因的表达载体，所述GNE/MNK具有SEQ ID NO :1所表示的氨基酸序列中的263位氨基酸或266位氨基酸被取代的氨基酸序列；以及 2)将步骤1)中的所述表达载体转染入宿主细胞中以制备转染子。
13.如权利要求11或12中所述的方法，其中，用亮氨酸取代所述步骤1)中的所述GNE/ MNK中263位的精氨酸。
14.如权利要求11或12中所述的方法，其中，用谷氨酰胺或色氨酸取代所述步骤1)中的所述GNE/MNK中266位的精氨酸。
15.如权利要求11或12中所述的方法，其中，用亮氨酸取代所述步骤1)中的所述GNE/ MNK中263位的精氨酸、并用谷氨酰胺或色氨酸取代步骤1)中的所述GNE/MNK中266位的精氨酸。
16.通过如权利要求11或12所述的方法制备的唾液酸含量提高的细胞。
全文摘要
本申请涉及制备具有高唾液酸含量的重组糖蛋白的方法。具体而言，对于UDP-GlcNAc 2-表异构酶/ManNAc激酶(GNE/MNK)酶(该酶中，通过仅用亮氨酸取代263位的精氨酸、或通过进一步用谷氨酰胺取代266位的精氨酸诱导了点突变)而言，该酶的表异构酶活性维持不变，不受CMP-唾液酸浓度的影响，并且，过表达该酶的细胞的胞内单磷酸胞苷(CMP)-唾液酸含量得以提高。特别是，由于在产生糖蛋白(如促红细胞生成素和促血小板生成素)的宿主细胞中(在该宿主细胞中，人α-2，3-唾液酸转移酶基因、CMP-唾液酸转运体基因和诱导有点突变的GNE/MNK基因同时得到过表达)，细胞中的胞内CMP-唾液酸含量和糖蛋白中的唾液酸提高，因此，在产生唾液酸化重组糖蛋白的宿主细胞中，上述3种基因的过表达可用于制备唾液酸含量提高的糖蛋白。
文档编号C12N15/54GK102482674SQ201180003414
公开日2012年5月30日 申请日期2011年2月1日 优先权日2010年2月8日
发明者孙荣德, 郑然太, 金政会, 黄真荣 申请人:韩国科学技术院