花生衣活性组分的应用及包含该花生衣活性组分的组合物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种花生衣活性组分的应用及包含该花生衣活性组分的组合物。所述花生衣活性组分能够用于制备预防、治疗神经退行性疾病的食品和药品。本发明还提供了一种组合物，含有花生衣活性组分和Omega-3系列不饱和脂肪酸。本发明提供了花生衣活性组分的一种新用途，为制备预防、治疗老年痴呆症等神经退行性疾病的食品和药物提供了新的思路。另外，本发明提供的组合物中除了含有花生衣活性组分外，还含有omega-3系列不饱和脂肪酸，能更好的改善记忆功能。
【专利说明】花生衣活性组分的应用及包含该花生衣活性组分的组合物
【技术领域】
[0001]本发明属于食品、药品用途【技术领域】，尤其涉及一种花生衣活性组分的应用及包含该花生衣活性组分的组合物。
【背景技术】
[0002]随着全球社会人口的发展，老年人口的增长是世界性的趋势，而老年性痴呆的患病率和发病率也逐渐增高，老年性痴呆不仅是一个医学难题，而将成为一个突出的社会问题。目前，全球老年性痴呆患者可能已达1700万，随着人口老龄化的进程，老年性痴呆的发病率已上升为常见死亡原因的第4位,仅次于心脑血管病、癌症和中风。老年性痴呆在我国也已逐渐成为严重威胁老年人健康的顽症。
[0003]老年性痴呆是指老年期发生的痴呆，包括阿尔茨海默病(AD，Alzheimer’ sDementia),血管性痴呆(Vascular dementia),混合性痴呆(mixed dementia)和其他原因所致痴呆。阿尔茨海默病的病理学特征表现为脑内大量淀粉样老年斑(SP)，神经纤维缠结(NFT)及选择性神经元和突触缺失，多种神经递质尤其是乙酰胆碱严重下降，相应地形成了以β淀粉样蛋白(Αβ )、tau蛋白及神经元缺失三大机制研究领域。
[0004]近年来随着对AD的神经生理、生化、药理等方面不断的深入研究，防治AD的药物开发研究不断取得进展。目前对老年痴呆的药物治疗主要是通过抑制乙酰胆碱酯酶(acChE)来提高患者体内的乙酰胆碱水平，即乙酰胆碱酯酶抑制剂，它是临床上用于治疗AD最早最为成熟的一类药物。目前，对于轻、中度AD患者的治疗，经美国FDA批准上市的药品有4种，他克林(tacrine)、多奈哌齐(donepezil)、利斯的明(Rivastigmine)和加兰他敏(Galantamine),均为乙酰胆碱酯酶抑制剂。其他的治疗药物如β、Y分泌酶抑制药，长春胺、尼莫地平等脑代谢调节剂，还有司来吉林、维生素E等影响自由基代谢的药物等。
`[0005]目前用于治疗AD的药物品种繁多，适用于不同的作用机制，它们在某种程度上，起到了缓解老年痴呆的作用，但是无论是上市或者在研的药物，都有一定的毒副作用，目前AD仍为一个没有办法根治的顽疾。因此，寻找针对AD病因的新的有效治疗药物和方法，成为当今研究的热点和难点。在众多的待选药物中，我们把目光投向了神经生长因子。
[0006]神经生长因子(NGF)属于神经营养因子(NTF)家族的成员，维持神经元的数量和存活。NGF对神经系统的正常发育及功能维持，促进损伤神经的再生与修复具有重要作用。NGF作为一种可能治疗AD的有效方法，但目前仍存在下列问题:(I)价格昂贵；(2)相对分子质量大，不能透过血-脑屏障(Blood Brain Barrier, BBB),只可脑室内注射,长期治疗存在许多技术问题。因此，寻找拟NGF活性，并且可以通过血脑屏障的小分子化合物即NGF mimics，已经成为了目前的研究热点。到目前为止，科学家们已经发现了近百种NGFmimics，可以有效的促进神经细胞增长，部分化合物已经完成了结构修饰或是全合成。目前，NGF mimics已有化合物处于三期临床阶段。
[0007]民以食为天，我国地大物博，果蔬鱼肉，山珍海味，十分富饶，人类的生存和繁衍离不开饮食，通过饮食，获得能量及各种营养以满足机体的需要。因此，在日常食物中开发具有药用价值的成分不仅可以避免药品的毒副作用，还能够大大降低药品的研发、生产成本。
【发明内容】
[0008]本发明提供了花生衣活性组分在制备预防、治疗神经退行性疾病的食品和药品中的应用，所述花生衣活性组分通过如下方法制备:取干燥的花生衣，用乙醇和水的混合溶液浸提，收集浸提液，用HP-20树脂进行吸附，水洗后，用乙醇的水溶液洗脱，收集洗脱液，将洗脱液浓缩、干燥后制得所述花生衣活性组分，该花生衣活性组分中花青素的重量百分比含量大于50%。
[0009]本发明的研究发现，花生衣活性组分具有显著的拟神经生长因子的活性，动物药理学实验也证明花生衣活性组分能改善小鼠的学习和记忆功能，因此可将花生衣活性组分作为有效成分，添加药学或食品可接受的载体，制备预防、治疗神经退行性疾病的食品和药
品O
[0010]所述神经退行性疾病具体可为老年性痴呆。
[0011]所述的食品可接受的载体是指食品领域常规的载体，例如淀粉、蔗糖、微晶纤维素等填充剂，淀粉浆、羟丙纤维素、明胶、聚乙二醇等粘合剂，硬脂酸镁、微粉硅胶、聚乙二醇类等湿润剂，聚山梨脂、卵磷脂等吸收促进剂，伯洛沙姆、脂肪酸山梨坦、聚山梨脂等表面活性剂，另外还可以添加香味剂、甜味剂等其它辅剂。
[0012]所述的药学可接受的载体可参照现有技术。
[0013]将花生衣活性组分制成药品后，可以以单位剂量形式给药，给药途径可以为肠道或非肠道。
[0014]药品的剂型可以是固体制剂、液体制剂或半固体剂型，上述各种剂型可采用现有生产方法进行制备。
[0015]制备花生衣活性组分时，优选的，浸提时，乙醇与水的体积比为40:60~80:20，更优选为60:40o
[0016]浸提液料比为2:1~1000:1，优选为5:1~100:1，更优选为16:1。
[0017]浸提的温度为20~50°C，优选为35~45°C，更优选为40°C。适宜的温度有利于有效成分的溶解和扩散，促进其浸出。
[0018]浸提的时间为0.5~48h，优选为I~12h。浸提时间过长会使杂质浸出量增加，并容易导致已浸出的花生衣活性成分的水解。
[0019]浸提的次数为I~5次，优选为2次。
[0020]浸提两次时，第一次浸提时，液料比为16:1，浸提时间为lh，第二次浸提的时间为
0.5h0
[0021]本领域人员可以理解，液料比为浸提液的体积(ml)与原料的质量(g)的比。
[0022]浸提、过滤后，可以先将滤液浓缩后再用树脂吸附，一般滤液浓缩至1/50体积。
[0023]所述HP-20树脂具体可以为三菱化学的HP-20树脂。
[0024]洗脱时，以乙醇的水溶液作为洗脱剂，其中乙醇与水的体积比为20:80~80:20，优选为40:60o
[0025]为保证洗脱效率，洗脱时，洗脱剂与HP-20树脂体积比值为1:1~10:1，优选为2:1~5:1，更优选为2:1。[0026]浓缩可采用常规的方法进行，浓缩结束后，通常干燥至含水量< 5%。
[0027]本发明还提供了一种组合物，含有所述的花生衣活性组分和Omega-3系列不饱和脂肪酸。
[0028]Omega-3系列不饱和脂肪酸能够促进肌肉组织的蛋白质代谢、视觉系统发育，促进心血管健全，减低心脏病发作或中风的风险，还能够降低血浆中胆固醇、甘油三酯，改善高甘油三酯患者的血脂水平，预防糖尿病及降低心血管疾病发生率；另外，经常服食Omega-3系列不饱和脂肪酸不仅能增强学习能力、记忆力和专注力，亦能舒解压力及令情绪大为振奋。
[0029]将花生衣活性组分和Omega-3系列不饱和脂肪酸混合对记忆能力的改善效果更加显著，可用于制备预防、治疗老年性痴呆症等神经退行性疾病的食品和药品。
[0030]其中，花生衣活性组分可采用前述的制备方法进行制备。
[0031]花生衣活性组分和Omega-3系列不饱和脂肪酸的重量比为1:1~5:1。
[0032]所述omega-3系列不饱和脂肪酸为二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸、二十碳五烯酸、二十碳四烯酸、二十四碳五烯酸、二十四碳六烯酸、十八碳四烯酸和亚麻酸中的至少一种。
[0033]优选的，所述omega-3系列不饱和脂肪酸为二十二碳六烯酸。
[0034]与现有技术相比，本发明的有益效果为:
[0035](I)本发明提供了花生衣活性组分的`一种新用途，花生衣活性组分具有显著的拟神经生长因子的活性，能够发挥预防和治疗老年性痴呆症的作用，为制备预防、治疗老年痴呆症等神经退行性疾病的食品和药物提供了新的思路。
[0036](2)花生衣活性组分以日常所食的花生的一部分为基本原料，产品安全性高，对人体无毒副作用，且原料来源广，成本低廉，同时花生衣活性组分的制备方法简单、快速，大大降低了研发和生产成本。
[0037](3)本发明提供组合物中除了含有花生衣活性组分外，还含有omega-3系列不饱和脂肪酸，能更好的改善记忆功能。组合物与其中任何一种的效果比较均有显著差异。
【专利附图】
【附图说明】
[0038]图1为48小时后不同处理对PC12细胞神经突起分化影响的显微照片；
[0039]其中，
[0040]a、0.5%DMS0，阴性对照；
[0041]b、40ng/mL NGF,阳性对照；
[0042]C、0.3ug/mL花生衣活性组分；
[0043]d、lug/mL花生衣活性组分；
[0044]e、3ug/mL花生衣活性组分；
[0045]图2为24和48小时后花生衣活性组分对PC12细胞的神经突起分化率的影响；
[0046]图3为花生衣活性组分和二十二碳六烯酸分别或混合使用对小鼠的水迷宫试验影响结果图。
【具体实施方式】[0047]下面结合具体实施例进一步阐释本发明。
[0048]实施例1花生衣活性组分的制备
[0049](1)将干燥花生衣1000克用16升含60%乙醇的醇水混合溶剂在40°C提取I小时后，过滤，获得第1次滤液；
[0050](2)残渣中加入2升含60%乙醇的醇水混合溶剂，在40°C提取30分钟后，过滤，获得第2次滤液；
[0051](3)将两次滤液合并后在40°C减压浓缩到1/50的体积后用Diaion (三菱化学)HP-20树脂五升进行吸附，随后，用15升水洗脱除去糖等物质，用10升含40%的乙醇的水溶液进行洗脱，收集洗脱液；
[0052](4)将洗脱液在40°C减压浓缩到1/50的体积后，冷冻干燥至含水量为5%，获得花生衣活性组分115.8克。
[0053]花青素含量的测定:
[0054]采用香草醛-盐酸法进行定量分析。
[0055]标准曲线:棕色试管中，Iml儿茶素(catechin)标准液(0.1,0.2,0.3mg/ml) (Ac)加入 9.0mL 的 2% 香草醛(vanillin)/ (HCl-MeOH) (2g 香草醛溶解在 100ml HCl-MeOH (I:2，v/v)中)，以水(AO)作为空白。混合溶液在18~22°C下孵育20min后在500nm测量吸光度。根据上述方法，用[(Ac) - (Ao)]值生成儿茶素溶液的标准曲线。
[0056]花生衣活性组分测试:在棕色试管中，Iml的测试溶液(40mg的花生衣活性组分溶于100mL的水中)加入9mL2%香草醛/ (HCl-MeOH)，混合溶液在18~22°C孵育20min后在500nm测量吸光度。
[0057]每个样品测三次，根据标准曲线计算得到样品中花青素的含量，从而计算得到本实施例中花生衣活性组分中花青素的含量为56%。
[0058]实施例2花生衣活性组分的体外生物活性
[0059]在神经退行性病变动物模型中，研究发现神经生长因子具有促进神经生长和神经保护功能，能阻止或减少神经元的退变，一定程度上可阻止老年痴呆症的进展。由于PC12细胞具有神经细胞的一般特征，在神经生长因子的作用下PC12细胞会停止分裂，长出突起，转化成神经元样细胞。因此，利用PC12细胞作为生物活性鉴定系统，筛选具有活性的样品用于制备预防和治疗老年性痴呆的保健食品或药物具有可靠性。
[0060](1)PC12细胞的培养
[0061]接20 X 1O4个PC12细胞接种于含1Oml DMEM培养基(其中含10%马血清、5%胎牛血清)培养皿中，37°C，5%C02的培养箱内培养，两天后更换一次培养基，再过三天继代培养；
[0062]用PBS将细胞洗两次，再加入1Oml PBS于培养皿中，37°C，5%C02的培养箱内培养10分钟，再转移到15ml的一次性离心管，离心后血球计数板上计数。
[0063](2)活性测试
[0064]细胞计数后，在24孔细胞培养板中每孔先加入1ml含血清(10%马血清、5%胎牛血清)的DMEM培养基，每孔接入2 X 1O4个细胞，CO2培养箱培养24小时；
[0065]弃去培养基，加入1ml含不同提取物的DMEM溶液(不含血清)，放入37°C，5%C02的培养箱中培养，以1%DMS0为阴性对照，40ng NGF为阳性对照；
[0066]倒置显微镜下每隔24小时，连续观察细胞形态变化，记录细胞的神经突起分化率，每个视野下约100个细胞，随机选取3处，并统计作图分析。
[0067]神经突起分化率:神经突起长于胞体直径一倍的细胞数目与视野下总细胞数目的比值。
[0068](3)实验结果
[0069]图1中a:阴性对照0.5%DMS0 ；b:40ng/ml NGF:阳性对照，图2中，0.5%DMS0为阴性对照，40ng/mL NGF为阳性对照，花生衣活性组分用0.5%DMS0溶液配成不同浓度。参见图1、图2，花生衣活性组分在0.3，1或3μ g/ml的测试浓度下处理PC12细胞，24h、48h后花生衣活性组分均显示出显著的拟神经生长因子活性，神经突起分化率在30~60%之间。
[0070]实施例3花生衣活性组分与DHA混合使用对鼠记忆功能的影响
[0071]实验主要材料:ICR小鼠(8周龄雄鼠)(购于浙江省医科院动物中心)。
[0072]实验操作:花生衣活性组分(10mg/kg)与二十二碳六烯酸(DHA) (5mg/kg)分别或混合灌胃给药(10mg/kg花生衣活性组分+5mg/kg DHA),每个处理和对照组均为10只小鼠，花生衣活性组分和/或二十二碳六烯酸(DHA)，均以含40%甘油、6%甘油脂肪酸酯的水溶液为溶剂对照组为上述溶剂。每间隔24小时给药I次，给药的最大体积为100μ 1，给药次数为7次。。
[0073]学习记忆及空间记忆功能的检测-水迷宫试验。
[0074]水迷宫实验为测试动物空间记忆能力的行为学实验，其过程分为训练和测试两个阶段。前面连续四天将动物放入水迷宫中，记录其登上平台的时间评价动物的学习记忆能力；第五天将平台撤掉，记录动物穿越平台的次数及在放有平台象限的滞留时间评价动物的学习记忆能力。
[0075]如图3所示，与对照相比，在水迷宫试验中，花生衣活性组分给药能显著提高ICR小鼠的穿台次数，DHA 口服 给药组也能显著提高ICR小鼠的穿台次数，最重要的是花生衣活性组分和DHA混合给药组效果明显优于单独使用花生衣活性组分或DHA。
【权利要求】
1.花生衣活性组分在制备预防、治疗神经退行性疾病的食品和药品中的应用，所述花生衣活性组分通过如下方法制备:取干燥的花生衣，用乙醇和水的混合溶液浸提，收集浸提液，用HP-20树脂进行吸附，水洗后，用乙醇的水溶液洗脱，收集洗脱液，将洗脱液浓缩、干燥后制得所述花生衣活性组分，该花生衣活性组分中花青素的重量百分比含量大于50%。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，浸提时，乙醇与水的体积比为40:60~80:20。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，浸提液料比为2:1~1000:1。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，浸提时间为0.5~48h，浸提温度为20~50。。。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，洗脱时，乙醇的水溶液中，乙醇与水的体积比为 20:80 ~80:20o
6.一种组合物，其特征在于，含有如权利要求1~5任一项所述的花生衣活性组分和Omega-3系列不饱和脂肪酸。
7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，花生衣活性组分和Omega-3系列不饱和脂肪酸的重量比为1:1~5:1。
8.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述omega-3系列不饱和脂肪酸为二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸、二十碳五烯酸、二十碳四烯酸、二十四碳五烯酸、二十四碳六烯酸、十八碳四烯酸和亚麻酸中的至少一种。
9.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述omega-3系列不饱和脂肪酸为二十二碳六烯酸。`
【文档编号】A23L1/29GK103877144SQ201310159719
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2013年5月2日 优先权日:2013年5月2日
【发明者】戚建华, 森大辅, 向兰, 木村雄辉 申请人:杭州耐奇睿生物医药科技有限公司, 日本株式会社岐阜紫胶制造所