一种脉冲电场作用下酿酒酵母亚致死细胞的定量检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种脉冲电场作用下酿酒酵母亚致死细胞的定量检测方法，包括以下步骤：（1）将经脉冲电场处理过的待测液体进行不同浓度梯度稀释，得到不同稀释度的稀释液；（2）制备酿酒酵母亚致死细胞的临界水分活度下的选择性培养基与非选择性培养基；（3）选取合适的稀释度的稀释液，每个稀释度的稀释液分别用步骤（2）制备的选择性培养基和非选择性培养基进行平板计数培养；（4）分别计数选择性和非选择性培养基上的菌落数，再换算出在相应培养基条件下酵母细胞的浓度，则待测液体中酿酒酵母亚致死细胞的数量等于非选择性培养基换算出的细胞数量减去选择性培养基换算出的细胞数量。本发明操作简单、易掌握，成本低。
【专利说明】—种脉冲电场作用下酿酒酵母亚致死细胞的定量检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及液体食品中微生物的检测方法，特别涉及一种脉冲电场作用下酿酒酵母亚致死细胞的定量检测方法。
【背景技术】
[0002]酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),是与人类关系最广泛的一种微生物，与同为真核生物的动物和植物细胞具有很多相同的结构，且易培养，在现代分子和细胞生物学中常被用作研究真核生物的模式生物，其作用相当于原核的模式生物大肠杆菌。
[0003]酿酒酵母作为基础生物学研究和食品工业中广泛应用的菌种，是良好的研究模型，但同时它也是液体食品中的常见污染菌种，并会因为酒精发酵和CO2气体的产出而引起饮料等食品的腐败。此外，当前热门的非热杀菌的技术手段，如脉冲电场(PEF)技术等，在用于液体食品杀菌时仍存在着杀菌不彻底的现象，也就是说液体食品物料经杀菌技术处理后的微生物存在着亚致死损伤状态。而微生物的亚致死损伤是一种可逆损伤，在适宜条件下会恢复其原来活性。因此，对经非热杀菌处理后的食品进行亚致死损伤细胞的定量检测就显得十分必要，因为亚致死损伤的细胞在适当条件下可自我修复，重新恢复其活性，从而对相应食品的卫生安全及货架期产生严重威胁，故需进一步强化灭菌条件才能满足杀菌效果、达到卫生要求，从而延长非热杀菌产品货架期。从另一方面讲，酿酒酵母细胞在亚致死应激条件下会作出相应的反应应答，从而产生相应的代谢产物，且有些代谢产物对人类发挥着重要作用，如酵母细胞在高盐条件下会大量积累海藻糖等物质。因此，如何最大限度地获取亚致死损伤状态细胞则成了当前迫切需要解决的问题，而对亚致死损伤细胞进行定量检测则可以有效优化亚致死损伤的处理条件。
[0004]许多研究表明，酿酒酵母细胞经PEF技术等手段处理后往往会产生亚致死损伤细胞，而对于亚致死损伤的细胞，一般可以通过流式细胞仪结合荧光染色技术来实现在线检测其存在与否，但该方法技术在设备方面投资成本较高，而且对操作技术的要求也相对较高，关键是不能对亚致死损 伤细胞进行初步定量分析。另外，对亚致死损伤细胞进行选择性筛选原理上也能定量检测出其相对数量，但对于选择性筛选条件的确定却存在一定的困难。
[0005]中国发明专利200410017149.7公布了一种实时定量PCR检测血液样品中癌细胞的方法。中国发明专利200610048468.3公布了一种大肠杆菌近红外光谱快速检测技术。中国发明专利200810135561.7公布了一种酱油等调味品中菌落总数快速检测方法。200810150350.0公布了一种环境水体中肠道病毒的定量检测方法。中国发明专利201010173244.1公布了一种调味品中大肠菌群的快速检测方法。中国发明专利201010173224.4公布了一种食品中大肠菌群的快速检测方法。中国发明专利201010180339.6公布了一种利用流式细胞仪检测腹腔吞噬细胞活性的方法。中国发明专利201110356426.7公布了一种有效杀灭高压脉冲电场处理食品中亚致死微生物延长货架期的方法。但是上述专利涉及的方法存在如下问题:(I)上述专利基本上都是针对完整的细胞(即未受损伤的)进行表征检测，而没有针对应激处理条件下亚致死损伤细胞进行定量检测；(2)上述专利中所述方法有些虽然能用于亚致死损伤细胞的检测，但在使用过程中往往成本较高，而且操作也较复杂，关键是不能对亚致死损伤细胞进行初步定量分析，如流式细胞仪检测需要结合染色技术等。
【发明内容】
[0006]为了克服现有技术的上述缺点与不足，本发明的目的在于提供一种脉冲电场作用下酿酒酵母亚致死细胞的检测方法，能够定量检测分析亚致死损伤细胞数量，操作程序简单、价廉、适于规模化应用。
[0007]本发明的目的通过以下技术方案实现:
[0008]一种脉冲电场作用下酿酒酵母亚致死细胞的定量检测方法，包括以下步骤:
[0009](I)将经脉冲电场处理过的待测液体进行不同浓度梯度稀释，得到不同稀释度的稀释液；
[0010](2)制备酿酒酵母亚致死细胞的临界水分活度下的选择性培养基与非选择性培养基;
[0011]所述酿酒酵母亚致死细胞的临界水分活度下的选择性培养基的制备过程如下:
[0012]在麦芽汁营养琼脂中加入蒸馏水，充分搅拌溶解后加热至沸腾，得到溶剂；然后加入氯化钠固体，充分溶解后分装灭菌，冷却至45?50°C得酿酒酵母亚致死细胞的临界水分活度下的选择性培养基；所述氯化钠固体 与溶剂的质量体积比为4.0%?4.5%g/L ；
[0013](3)选取合适的稀释度的稀释液，每个稀释度的稀释液分别用步骤(2)制备的选择性培养基和非选择性培养基进行平板计数培养；
[0014](4)分别计数选择性培养基和非选择性培养基上的菌落数，再换算出在相应培养基条件下酵母细胞的浓度，则待测液体中酿酒酵母亚致死细胞的数量等于非选择性培养基换算出的细胞数量减去选择性培养基换算出的细胞数量。
[0015]所述非选择性培养基的制备过程如下:
[0016]在麦芽汁营养琼脂中加入蒸馏水，充分搅拌溶解后加热至沸腾，分装灭菌，冷却至45?50°C即得非选择性培养基。
[0017]每个稀释度的稀释液分别用步骤(2)制备的选择性培养基和非选择性培养基进行平板计数培养，具体为:
[0018]吸取稀释液加入到无菌培养皿中，每个稀释度的稀释液分别加入两个无菌培养皿中，分别在两个无菌培养皿加入步骤(2)制备的选择性培养基和非选择性培养基，充分摇匀，待选择性培养基和非选择性培养基全部凝固后，置于25V?30°C的恒温培养箱中倒置培养(72±2)h。
[0019]无菌培养皿中的稀释液与选择性培养基的体积比为1:15?20。
[0020]无菌培养皿中的稀释液与非选择性培养基的体积比为1:15?20。
[0021]与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果:
[0022](I)本发明克服了现有技术无法定量检测酿酒酵母亚致死细胞的问题。
[0023](2)本发明的方法工艺简单，可操作性强，能够大规模应用，通过利用NaCl浓度与培养基中的水分活度的线性关系，获得亚致死损伤细胞生长的临界水分活度(对应的氯化钠浓度为4.0%?4.5% (w/v),即氯化钠固体与溶剂的质量体积比为4.0%?4.5%g/L)，使得正常细胞能在该水分活度下生长，而亚致死损伤细胞不能生长繁殖；采用临界水分活度下的非选择性培养基使工艺简单化，可操作性强。
[0024](3)本发明的方法设备投入少，成本低，所有操作过程中使用的都是些常见的仪器和器皿，且相关试剂也很普通易见。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为麦芽汁营养琼脂培养基中NaCl含量与水分活度的拟合曲线。
[0026]图2为不同水分活度下酵母细胞的生长情况。
【具体实施方式】
[0027]下面结合实施例，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
[0028]本发明首先通过实验得到NaCl浓度与培养基中的水分活度的关系，具体实验结果见图1，由图1可知，培养基中NaCl含量高低可明显改变培养基中的水分活度，且呈现一定的线性关系，而水分活度对微生物的生长繁殖有着显著的影响。基于上述结果，通过采用氯化钠等无机盐来不断调节培养基的水分活度，可以获得亚致死损伤细胞生长的临界水分活度对应的氯化钠浓度为4.0%?4.5% (w/v)(见图2)，在临界水分活度下，正常细胞能生长，而亚致死损伤细胞不能生长繁殖，本发明利用上述结果，可以简化定量检测酿酒酵母亚致死细胞的工艺步骤。
[0029]实施例1
[0030]本实施例采用的待.测液体的制备过程如下:
[0031]准确称取0.50g maurivinTM系列的葡萄酒活性干酵母，加入到200mL糖水溶液(白砂糖与蒸馏水的固液比为2%)中，36°C保温40min，期间不断搅拌均匀，让活性干酵母充分复水活化。酵母活化液在4000rpm离心lOmin，离心室温度为2V，弃上清，收集细胞沉淀。在无菌操作台上将收集的细胞沉淀重悬于200mL含0.024%氯化钠的无菌盐水中，即得细胞
重悬液。
[0032]利用华南理工大学轻工与食品学院自行设计研制的高压脉冲电场处理系统对重悬的酵母细胞液进行处理。处理前，先用75%乙醇溶液对处理室和管路等进行清洗消毒，再用无菌水清洗去除残留的乙醇溶液。脉冲电场处理参数条件设置为:频率1000Hz，脉宽40 μ s，场强10kV/cm，流速40mL/min，处理I次，处理完后将处理液静置冷却至室温，得到酿酒酵母细胞电场处理液，即本实施例的经脉冲电场处理过的待测液体。
[0033]本实施例的脉冲电场作用下酿酒酵母亚致死细胞的定量检测方法，包括以下步骤:
[0034](I)在无菌操作台上将经脉冲电场处理过的待测液体进行10倍梯度稀释，得到不同稀释度的稀释液；
[0035](2)制备酿酒酵母亚致死细胞的临界水分活度下的选择性培养基与非选择性培养基;
[0036]所述酿酒酵母亚致死细胞的临界水分活度下的选择性培养基的制备过程如下:
[0037]准确称取麦芽汁琼脂培养基145.1g,加蒸馏水1L，充分搅拌溶解后加热至沸腾，得到溶剂；然后加入氯化钠固体，充分溶解后分装灭菌，冷却至45°C得酿酒酵母亚致死细胞的临界水分活度下的选择性培养基；所述氯化钠固体与溶剂的质量体积比为4.0%g/L ；
[0038]所述非选择性培养基的制备过程如下:
[0039]准确称取麦芽汁琼脂培养基145.1g (广东环凯微生物科技有限公司生产)，加蒸馏水1L，充分搅拌溶解后加热至沸腾，然后分装灭菌，冷却至45°C即得非选择性培养基；
[0040](3)选取合适的3个稀释度的稀释液，每个稀释度的稀释液分别用步骤(2)制备的选择性培养基和非选择性培养基进行平板计数培养；
[0041]其中，每个稀释度的稀释液分别用步骤(2)制备的选择性培养基和非选择性培养基进行平板计数培养，具体为:
[0042]吸取稀释液加入到无菌培养皿中，每个稀释度的稀释液分别加入两个无菌培养皿中，分别在两个无菌培养皿加入步骤(2)制备的选择性培养基和非选择性培养基，充分摇匀，注意不要将培养基摇至皿盖上，无菌培养皿中的稀释液与选择性培养基的体积比为1:15，稀释液与非选择性培养基的体积比为1:15。
[0043]待选择性培养基和非选择性培养基全部凝固后，置于25°C的恒温培养箱中倒置培养 70h ；
[0044](4)培养结束后，分别计数选择性和非选择性培养基上的菌落数，再换算出在相应培养基条件下酵母细胞的浓度，则待测液体中酿酒酵母亚致死细胞的数量等于非选择性培养基换算出的细胞数量减去选择性培养基换算出的细胞数量；本实施例最后计算出的酿酒酵母亚致死细胞数量约为3.39X 104CFU/ mL,占细胞总数的0.60%。
[0045]实施例2
[0046]本实施例采用的待测液体的制备过程如下:
[0047]准确称取0.70g maurivinTM系列的葡萄酒活性干酵母，加入到300mL糖水溶液(白砂糖与蒸馏水的固液比为2%)中，38°C保温30min，期间不断搅拌均匀，让活性干酵母充分复水活化。酵母活化液在4000rpm离心lOmin，离心室温度为5°C，弃上清，收集细胞沉淀。在无菌操作台上将收集的细胞沉淀重悬于300mL含0.024%氯化钠的无菌盐水中，即得细胞
重悬液。
[0048]利用华南理工大学轻工与食品学院自行设计研制的高压脉冲电场处理系统对重悬的酵母细胞液进行处理。处理前，先用75%乙醇溶液对处理室和管路等进行清洗消毒，再用无菌水清洗去除残留的乙醇溶液。脉冲电场处理参数条件设置为:频率1000Hz，脉宽I μ s，场强20kV/cm，流速20mL/min，处理2次，处理完后将处理液静置冷却至室温，得到酿酒酵母细胞电场处理液，即本实施例的经脉冲电场处理过的待测液体。
[0049]本实施例的脉冲电场作用下酿酒酵母亚致死细胞的定量检测方法，包括以下步骤:
[0050](I)在无菌操作台上将经脉冲电场处理过的待测液体进行10倍梯度稀释，得到不同稀释度的稀释液；
[0051](2)制备酿酒酵母亚致死细胞的临界水分活度下的选择性培养基与非选择性培养基;
[0052]所述酿酒酵母亚致死细胞的临界水分活度下的选择性培养基的制备过程如下:
[0053]准确称取麦芽汁琼脂培养基145.1g,加蒸馏水1L，充分搅拌溶解后加热至沸腾，得到溶剂；然后加入氯化钠固体，充分溶解后分装灭菌，冷却至50°C得酿酒酵母亚致死细胞的临界水分活度下的选择性培养基；所述氯化钠固体与溶剂的质量体积比为4.5%g/L ；
[0054]所述非选择性培养基的制备过程如下:
[0055]准确称取麦芽汁琼脂培养基145.1g (广东环凯微生物科技有限公司生产)，加蒸馏水1L，充分搅拌溶解后加热至沸腾，然后分装灭菌，冷却至50°C即得非选择性培养基；
[0056](3)选取合适的3个稀释度的稀释液，每个稀释度的稀释液分别用步骤(2)制备的选择性培养基和非选择性培养基进行平板计数培养；
[0057]其中，每个稀释度的稀释液分别用步骤(2)制备的选择性培养基和非选择性培养基进行平板计数培养，具体为:
[0058]吸取稀释液加入到无菌培养皿中，每个稀释度的稀释液分别加入两个无菌培养皿中，分别在两个无菌培养皿加入步骤(2)制备的选择性培养基和非选择性培养基，充分摇匀，注意不要将培养基摇至皿盖上，无菌培养皿中的稀释液与选择性培养基的体积比为1:20，稀释液与非选择性培养基的体积比为1:20。
[0059]待选择性培养基和非选择性培养基全部凝固后，置于30°C的恒温培养箱中倒置培养 74h ；
[0060](4)培养结束后，分别计数选择性和非选择性培养基上的菌落数，再换算出在相应培养基条件下酵母细胞的浓度，则待测液体中酿酒酵母亚致死细胞的数量等于非选择性培养基换算出的细胞数量减去选择性培养基换算出的细胞数量；本实施例最后计算出的酿酒酵母亚致死细胞数量约为3.23X 106CFU/mL,占细胞总数的57.71%。
[0061]实施例3 [0062]本实施例采用的待测液体的制备过程如下:
[0063]准确称取1.0g maurivinTM系列的葡萄酒活性干酵母,加入到400mL糖水溶液(白砂糖与蒸馏水的固液比为2%)中，40°C保温20min，期间不断搅拌均匀，让活性干酵母充分复水活化。酵母活化液在4000rpm离心5min，离心室温度为8°C，弃上清，收集细胞沉淀。在无菌操作台上将收集的细胞沉淀重悬于400mL含0.025%氯化钠的无菌盐水中，即得细胞重悬液。
[0064]利用华南理工大学轻工与食品学院自行设计研制的高压脉冲电场处理系统对重悬的酵母细胞液进行处理。处理前，先用75%乙醇溶液对处理室和管路等进行清洗消毒，再用无菌水清洗去除残留的乙醇溶液。脉冲电场处理参数条件设置为:频率1000Hz，脉宽20 μ s，场强40kV/cm，流速60mL/min，处理3次，处理完后将处理液静置冷却至室温，得到酿酒酵母细胞电场处理液，即本实施例的经脉冲电场处理过的待测液体。
[0065]本实施例的脉冲电场作用下酿酒酵母亚致死细胞的定量检测方法，包括以下步骤:
[0066](I)在无菌操作台上将经脉冲电场处理过的待测液体进行10倍梯度稀释，得到不同稀释度的稀释液；
[0067](2)制备酿酒酵母亚致死细胞的临界水分活度下的选择性培养基与非选择性培养基;
[0068]所述酿酒酵母亚致死细胞的临界水分活度下的选择性培养基的制备过程如下:
[0069]准确称取麦芽汁琼脂培养基145.1g,加蒸馏水1L，充分搅拌溶解后加热至沸腾，得到溶剂；然后加入氯化钠固体，充分溶解后分装灭菌，冷却至48°C得酿酒酵母亚致死细胞的临界水分活度下的选择性培养基；所述氯化钠固体与溶剂的质量体积比为4.3%g/L ；
[0070]所述非选择性培养基的制备过程如下:
[0071]准确称取麦芽汁琼脂培养基145.1g (广东环凯微生物科技有限公司生产)，加蒸馏水1L，充分搅拌溶解后加热至沸腾，然后分装灭菌，冷却至43°C即得非选择性培养基；
[0072](3)选取合适的3个稀释度的稀释液，每个稀释度的稀释液分别用步骤(2)制备的选择性培养基和非选择性培养基进行平板计数培养；
[0073]其中，每个稀释度的稀释液分别用步骤(2)制备的选择性培养基和非选择性培养基进行平板计数培养，具体为:
[0074]吸取稀释液加入到无菌培养皿中，每个稀释度的稀释液分别加入两个无菌培养皿中，分别在两个无菌培养皿加入步骤(2)制备的选择性培养基和非选择性培养基，充分摇匀，注意不要将培养基摇至皿盖上，无菌培养皿中的稀释液与选择性培养基的体积比为1:18，稀释液与非选择性培养基的体积比为1:18。
[0075]待选择性培养基和非选择性培养基全部凝固后，置于28°C的恒温培养箱中倒置培养 72h ；
[0076](4)培养结束后，分别计数选择性和非选择性培养基上的菌落数，再换算出在相应培养基条件下酵母细胞的 浓度，则待测液体中酿酒酵母亚致死细胞的数量等于非选择性培养基换算出的细胞数量减去选择性培养基换算出的细胞数量；本实施例最后计算出的酿酒酵母亚致死细胞数量约为5.01X106CFU/mL,占细胞总数的89.48%。
[0077]上述实施例为本发 明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种脉冲电场作用下酿酒酵母亚致死细胞的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将经脉冲电场处理过的待测液体进行不同浓度梯度稀释，得到不同稀释度的稀释液； (2)制备酿酒酵母亚致死细胞的临界水分活度下的选择性培养基与非选择性培养基； 所述酿酒酵母亚致死细胞的临界水分活度下的选择性培养基的制备过程如下: 在麦芽汁营养琼脂中加入蒸馏水，充分搅拌溶解后加热至沸腾，得到溶剂；然后加入氯化钠固体，充分溶解后分装灭菌，冷却至45?50°C得酿酒酵母亚致死细胞的临界水分活度下的选择性培养基；所述氯化钠固体与溶剂的质量体积比为4.0%?4.5%g/L ； (3)选取合适的稀释度的稀释液，每个稀释度的稀释液分别用步骤(2)制备的选择性培养基和非选择性培养基进行平板计数培养； (4)分别计数选择性培养基和非选择性培养基上的菌落数，再换算出在相应培养基条件下酵母细胞的浓度，则待测液体中酿酒酵母亚致死细胞的数量等于非选择性培养基换算出的细胞数量减去选择性培养基换算出的细胞数量。
2.根据权利要求1所述的脉冲电场作用下酿酒酵母亚致死细胞的定量检测方法，其特征在于，所述非选择性培养基的制备过程如下: 在麦芽汁营养琼脂中加入蒸馏水，充分搅拌溶解后加热至沸腾，分装灭菌，冷却至45?50°C即得非选择性培养基。.
3.根据权利要求1所述的脉冲电场作用下酿酒酵母亚致死细胞的定量检测方法，其特征在于，每个稀释度的稀释液分别用步骤(2)制备的选择性培养基和非选择性培养基进行平板计数培养，具体为: 吸取稀释液加入到无菌培养皿中，每个稀释度的稀释液分别加入两个无菌培养皿中，分别在两个无菌培养皿加入步骤(2)制备的选择性培养基和非选择性培养基，充分摇匀，待选择性培养基和非选择性培养基全部凝固后，置于25V?30°C的恒温培养箱中倒置培养(72±2)h。
4.根据权利要求3所述的脉冲电场作用下酿酒酵母亚致死细胞的定量检测方法，其特征在于，无菌培养皿中的稀释液与选择性培养基的体积比为1:15?20。
5.根据权利要求3所述的脉冲电场作用下酿酒酵母亚致死细胞的定量检测方法，其特征在于，无菌培养皿中的稀释液与非选择性培养基的体积比为1:15?20。
【文档编号】C12Q1/06GK103436590SQ201310373444
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月23日 优先权日:2013年8月23日
【发明者】曾新安, 王满生, 孙大文, 韩忠, 刘志伟 申请人:华南理工大学