一种检测糖皮质激素治疗sle疗效的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测糖皮质激素治疗SLE疗效的试剂盒，包括：检测GR基因序列的引物；PCR扩增酶，纯化PCR产物的纯化酶及相应缓冲液；dNTP；单碱基延伸反应酶及相应的缓冲液。GR基因分型结果中rs10482672多态性位点为T（CT+TT）的患者疗效差，rs4912905多态性位点为C（GC+CC）的患者疗效好，rs17100234多态性位点为A（CA+AA）的患者疗好，rs7701443多态性位点为A（AA）的患者疗效差。本发明提供了一种基于GR基因多态性检测糖皮质激素治疗SLE疗效的试剂盒和方法，为实现SLE患者的个体化治疗提供新的思路和方法。
【专利说明】一种检测糖皮质激素治疗SLE疗效的试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测糖皮质激素治疗SLE疗效的试剂盒，具体涉及一种基于GR基因多态性检测糖皮质激素治疗SLE疗效的试剂盒和方法，属于医药卫生【技术领域】。
[0002]
【背景技术】
[0003]系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种常见的自身免疫性疾病，世界范围内SLE的发病率约为50/10万，我国约为70/10万。该病多见于女性，男女发病率比约为1:9。近年来，SLE发病率和患病率不断升高，对青中年女性的身心健康造成了很大危害，已经成为一个重要的公共卫生问题。SLE的药物治疗主要以糖皮质激素(glucocorticoids,GC)为主。GC具有强大的抗炎和免疫抑制作用，其主要作用机制是基因调控途径，即与细胞衆内的糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR)相结合,形成GC-GR复合物，转移入细胞核内，通过基因调控机制发挥作用。可见，GR是GC发挥生理和药理作用的重要环节。
[0004]制定个体化治疗方案是SLE治疗的基本原则。临床实践表明GC的临床疗效存在极大的个体化差异，有相当一部分患者病情不能迅速得到缓解。同时，GC的应用结果像一把双刃剑，在取得疗效的同时也会导致许多不良反应，有的不良反应甚至会直接导致患者死亡。这给SLE患者的临床合理用药带来严重困难。目前，临床医生对SLE患者是否应该给予GC治疗，治疗后在病程不同阶段应该使用何种剂量，病情稳定后应该如何调整剂量等都还主要依靠临床经验进行尝试性治疗，导致相当一部分病人不能适时的得到最佳治疗。
[0005]药物基因组学是 继人类基因组计划完成之后出现的功能基因组学研究的一个分支，它的出现对于提高药物疗效，减轻不良反应具有重要的意义。药物基因组学介导的个体化用药就是药物治疗在充分考虑每个病人的遗传因素基础上制定安全、合理、有效、经济的药物治疗方案。近年，国际权威杂志《N Engl J Med》、《SCienCe》等刊登的研究证据表明药物基因组学研究在转化应用中能够迅速获得回报。药物基因组学的主要手段是检测相关基因的单核苷酸多态性(single neucleotide polymorphism, SNP)。这种SNP可能会影响到其所表达的蛋白质的功能，或者影响蛋白质的表达水平，进而影响与其相互作用的外源性分子的效应，即药物疗效。不久的将来，患者基因型将成为确定患者个体化治疗的重要依据。
[0006]当前，迫切需要风湿科医生治疗SLE病人时能够在充分考虑每个病人的遗传因素基础上制定安全、合理、有效、经济的药物治疗方案。GR是GC发挥生理和药理作用的重要环节，目前本领域缺乏基于GR基因(NR3C1)多态性检测糖皮质激素治疗SLE疗效的方法和试剂盒。
[0007]
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种基于GR基因多态性检测糖皮质激素治疗SLE疗效的试剂盒和方法。
[0009]为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
一种基于GR基因多态性检测糖皮质激素治疗SLE疗效的试剂盒，包括以下试剂，保存温度为_20°C:
(1)检测GR基因序列的引物；
(2)PCR扩增酶，纯化PCR产物的纯化酶及相应缓冲液；
(3)dNTP ；
(4)单碱基延伸反应酶及相应的缓冲液。
[0010]所述的检测GR基因序列的引物包括扩增基因序列多态性位点的引物以及单碱基延伸基因序列多态性位点的延伸引物。
[0011]所述的GR基因序列的分子标记为rsl0482672，rs4912905, rsl7100234和rs7701443。
[0012]所述的扩增rsl0482672多态性位点的引物:
5’ - CAAAGCAGGGCTGGGCTTTACT -3’
5’ - TGTTGTGTTTGCAT ATCCATGAGAGTT -3’
所述的扩增rs4912905多态性位点的引物:
5， - GAAGAACTTGCCAAGAGGCTAGAGAA -3，
5’ - CAATTCATTGACCTTACAGAATCACTGG -3’
所述的扩增rsl7100234多态性位点的引物:
5， - GCATAAAGCCAAAACCTGAAAAGAAGA -3，
5， - AAATGGGGCCAGCCTACAACTG -3，
所述的扩增rs7701443多态性位点的引物:
5’ - GCTACCAATGACTAACACTTTGAGGATTCA -3’
5’ - CCGTATCTGTCTCCATTTCCTCCA -3’。
[0013]所述的单碱基延伸rsl0482672多态性位点的引物:
5’ _ TTTTTTTTTTTTTTGCCATCCTTGTAATCTTTGTGGT -3’
所述的单碱基延伸rs4912905多态性位点的引物:
5，rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp
GGTTTCTGTGACACAATTCTGTTT -3’
所述的单碱基延伸rsl7100234多态性位点的引物:
5，rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp
AATAGCGTCAACCAGTCATTTCA -3，
所述的单碱基延伸rs7701443多态性位点的引物:
5’ - TTTCCCAGTATAAGGCTGCAGGG -3’。
[0014]本发明还提供了一种基于GR基因多态性检测糖皮质激素治疗SLE疗效的方法，包括以下步骤:
(1)DNA的提取；
(2)PCR扩增反应；(3)纯化反应；
(4)单碱基延伸反应；
(5)基因分型；
(6)疗效判断:GR基因分型结果中rsl0482672多态性位点为T(CT+TT)的患者疗效差，rs4912905多态性位点为C (GC+CC)的患者疗效好，rsl7100234多态性位点为A (CA+AA)的患者疗好，rs7701443多态性位点为A (AA)的患者疗效差。
[0015]所述PCR 扩增反应中包括有 rsl0482672，rs4912905, rsl7100234, rs7701443 四对扩增多态性位点的引物。
[0016]所述单碱基延伸反应中包括有rsl0482672，rs4912905, rsl7100234, rs7701443四条单碱基延伸多态性位点的引物。
[0017]所述的糖皮质激素包括但不限于泼尼松、氢化可的松、可的松、强的松、强的松龙、甲强龙、甲基泼尼松、对氟米松、氟泼尼松龙、氯地米松、地塞米松、倍他米松等。
[0018]所述的疗效为患者治疗后临床症状是否缓解,缓解为疗效好，没有缓解为疗效差。
[0019]本发明通过前瞻性的队列研究提出了基于GR基因rsl0482672，rs4912905，rsl7100234和rs7701443多态性位点检测糖皮质激素治疗SLE疗效的方法和试剂盒。根据rsl0482672，rs4912905，rsl7100234和rs7701443多态性位点不同基因型的患者临床疗效的差异，进行了卡方检验和回归分析。结果发现，rsl0482672，rs4912905，rsl7100234和rs7701443多态性位点基因型分布均符合Hardy-Weinburg平衡；rsl0482672，rs4912905,rsl7100234和rs7701443多态性位点和糖皮质激素治疗SLE的疗效之间存在显著关联，rsl0482672，rs4912905，rsl7100234和rs7701443多态性位点能够用来检测糖皮质激素治疗SLE的疗效，其中，rsl04826`72多态性位点为T (CT+TT)的患者疗效差，rs4912905多态性位点为C (GC+CC)的患者疗效好，rsl7100234多态性位点为A (CA+AA)的患者疗好，rs7701443多态性位点为A (AA)的患者疗效差。
[0020]本发明提供了一种基于GR基因多态性检测糖皮质激素治疗SLE疗效的试剂盒和方法，为实现SLE患者的个体化治疗提供了新的思路和方法，有利于风湿科医生治疗SLE病人时，能够在充分考虑每个病人的遗传因素基础上制定安全、合理、有效、经济的药物治疗方案。
[0021]
【具体实施方式】
[0022]下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解为，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。
[0023]本发明的基于GR基因多态性检测糖皮质激素治疗SLE疗效的试剂盒由以下试剂组成:
(I)扩增多态性位点的引物；
【权利要求】
1.一种检测糖皮质激素治疗SLE疗效的试剂盒，其特征在于，包括以下试剂，保存温度为-20 0C: (1)检测GR基因序列的引物， (2)PCR扩增酶，纯化PCR产物的纯化酶及相应缓冲液，
(3)dNTP, (4)单碱基延伸反应酶及相应的缓冲液； 所述的检测GR基因序列的引物包括扩增基因序列多态性位点的引物，以及单碱基延伸基因序列多态性位点的延伸引物； 所述的基因序列的分子标记为rsl0482672，rs4912905, rsl7100234和rs7701443 ； 所述的扩增rsl0482672多态性位点的引物: ， 5’ - CAAAGCAGGGCTGGGCTTTACT -3’ ， 5’ - TGTTGTGTTTGCATATCCATGAGAGTT -3’ 所述的扩增rs4912905多态性位点的引物: ， 5， - GAAGAACTTGCCAAGAGGCTAGAGAA -3，
，5’ - CAATTCATTGACCTTACAGMTCACTGG -3’ 所述的扩增rsl7100234多态性位点的引物:
，5， - GCATAAAGCCAAAACCTGAAAAGAAGA -3，
，5， - AAATGGGGCCAGCCTACAACTG -3， 所述的扩增rs7701443多态性位点的引物:
，5’ - GCTACCAATGACTAACACTTTGAGGATTCA -3’
，5’ - CCGTATCTGTCTCCATTTCCTCCA -3’ ； 所述的单碱基延伸rsl0482672多态性位点的引物: ， 5’ _ TTTTTTTTTTTTTTGCCATCCTTGTAATCTTTGTGGT -3’ 所述的单碱基延伸rs4912905多态性位点的引物:
，5，rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp
GGTTTCTGTGACACAATTCTGTTT -3’ 所述的单碱基延伸rsl7100234多态性位点的引物:
， 5，rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp
AATAGCGTCAACCAGTCATTTCA -3， 所述的单碱基延伸rs7701443多态性位点的引物: ， 5’ - TTTCCCAGTATAAGGCTGCAGGG -3’。
【文档编号】C12Q1/68GK103468812SQ201310426341
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月17日 优先权日:2013年9月17日
【发明者】邹延峰, 叶冬青, 徐建华 申请人:安徽医科大学