用于向整个皮质中分布高水平治疗剂以治疗神经障碍的方法

专利名称：用于向整个皮质中分布高水平治疗剂以治疗神经障碍的方法
用于向整个皮质中分布高水平治疗剂以治疗神经障碍的方
法相关申请的交叉引用本申请要求2009年1月四日提交的美国临时专利申请序列号61/148，302的优先权，其全文以引用的方式明确地并入本文。关于联邦资助的研究或开发的声明本发明是在美国国立卫生研究院(NIH)所获得的批准号为5R01NS56107-2的政府资助下完成的。美国政府拥有本发明的某些权利。
技术领域：
本发明涉及用于治疗涉及皮质的神经障碍的方法，以及将治疗剂递送到皮质的方法。
背景技术：
神经障碍的有效治疗已在很大程度上受到与对受侵袭的细胞群递送治疗剂有关的问题的阻碍。足够的递送在涉及皮质的神经障碍中已经特别成问题。例如，使用基因治疗载体来治疗涉及皮质的神经障碍仍然是一项挑战，这在很大程度上是由于将载体有效递送到受侵袭区域中的足够数目的皮质神经元的物理限制所致。 虽然多种直接皮质输注在小动物脑中可以是有效的(例如Vite等，Arm Neurol 57(3) 355-364,2005 ；及 Vite 等，Gene Ther 10(22) :1874_1881，2003)，但是随着脑组织的结构和体积在灵长类动物中的增加，经由直接皮质输注来实现广泛的皮质递送变得几乎是不可能的。虽然可以通过立体定位神经外科输注来可靠地完成特定核的病灶靶向，但是通过直接输注病毒载体不容易靶向灵长类动物大脑皮质的大量褶皱布置。已经报道了病毒载体的轴突和跨突触运输以及在注射部位远端部位处的载体编码基因的表达。例如，Aubourg等，US 2005/0032219公开了将重组腺相关病毒(AAV)注射到胼胝体和脑桥中导致与注射部位连接的许多部位(包括前脑皮质、嗅球、纹状体、丘脑、 视核、下丘和脊髓)处的基因表达。另外，Passini等，US 2006/01719 公开了将重组AAV 注射到溶酶体贮积症小鼠模型的海马体中导致对侧齿状回、CA3区、内侧隔核和内嗅皮质中的基因表达。然而，在每种报道的啮齿类动物模型中，在皮质的某些区域中仅有有限的表达，而指定的运输途径与灵长类动物脑中相应的途径的相关性仍不清楚。因此，在人脑中安全地实现广泛的治疗剂分布的困难已经阻碍了对影响大皮质域的多种神经障碍(包括创伤性脑损伤、中风、酶功能障碍病症和痴呆)的潜在治疗的进展。发明概述本发明人已经发现可通过以对流增强递送(CED)的方式将治疗剂递送到丘脑来实现治疗剂在灵长类动物皮质内的不曾有的分布量。采用本文中所公开的方法可以在甚至对灵长类动物丘脑进行单次施药的情况下实现治疗剂的高水平且广泛的皮质分布。因此， 通过向丘脑的CED可以达到治疗神经障碍(如创伤性脑损伤、中风、酶功能障碍病症、痴呆
4和影响大面积皮质的其它神经障碍)的目的。通过CED向丘脑递送可不再需要对皮质中的多个部位进行直接和反复的递送，而这种直接和反复的递送已经妨碍了许多神经障碍的治疗。此外，本方法采用顺向运输，其在皮质神经元及由其促进的逆向运输在许多神经障碍中可能受到损害时仍可起作用。另外，可以将治疗剂进一步递送到与皮质域连接的三级部位， 该皮质域通过丘脑递送被供以治疗剂，增加了可通过本方法治疗的细胞群和病症的范围。虽然本发明涉及轴突运输，但是本发明源于下面的情况，当通过适当的手段向丘脑递送时，灵长类动物丘脑皮质投射能够将治疗剂传送到皮质，这种能力是先前未曾观察到的，而且也是不平常的。尽管证实了小实验动物中的运输现象和非丘脑皮质途径(例如 US2006/0171926, US 2005/0032219)，但本发明所公开的灵长类动物丘脑皮质投射将大量的病毒载体顺向递送到灵长类动物皮质的广泛区域并实现大皮质域中的治疗相关量的分布的能力仍然是未知的。此外，如本文中所详述，治疗载体向丘脑的CED似乎是达到一定丘脑水平所必需的，所述一定的丘脑水平促进皮质中的高水平表达和广泛分布，而且不再需要直接皮质递送到受侵袭的皮质区以治疗特定的神经障碍。因此，在一方面，本发明提供治疗涉及皮质的神经障碍(本文中称为“皮质神经障碍”)的方法。该方法涉及通过CED将治疗剂递送到丘脑。优选的皮质神经障碍涉及大面积的皮质，优选涉及皮质的不止一个功能区，优选涉及皮质的不止一个叶，并多达及包括整个皮质。优选的皮质神经障碍包括但不限于创伤性脑损伤；中风；酶功能障碍病症；精神疾病，包括创伤后压力综合征；神经退行性疾病，包括亨廷顿氏病、帕金森氏病和阿尔茨海默氏病；癫痫；和认知障碍，包括痴呆症、 自闭症和抑郁症。优选的酶功能障碍病症包括但不限于脑白质营养不良，包括卡纳万氏病(Canavan' s disease)；和溶酶体贮积病(LSD)，包括尼曼匹克病(Niemann-Pick disease)、戈谢病(Gaucher disease)、巴藤病(Batten disease)、法布里病(Fabry disease)禾口庞贝氏症(Pompe disease)。在一个优选的实施方案中，皮质神经障碍涉及至少第一和第二皮质神经元群，它们分别由起源于第一和第二丘脑核的丘脑皮质投射支配，其中的丘脑核是不同的。在一个优选的实施方案中，皮质神经障碍涉及皮质的不止一个功能区。在一个优选的实施方案中，皮质神经障碍涉及皮质的不止一个叶。在一个实施方案中，皮质神经障碍涉及与皮质连接的三级神经元群。在一个优选的实施方案中，递送到丘脑的治疗剂是包含治疗性核酸的病毒颗粒。 在一个优选的实施方案中，该病毒颗粒是AAV颗粒。在一个优选的实施方案中，该AAV颗粒选自 AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8 和 AAV9。在一个优选的实施方案中，病毒颗粒包含编码治疗性蛋白质的核酸。在一个实施方案中，治疗性蛋白质是酶。在一个实施方案中，治疗性蛋白质选自生长因子，包括神经营养因子；激素；免疫调节肽和蛋白质，包括细胞因子；和神经调节肽。在一个实施方案中，皮质神经障碍是A型尼曼匹克病，且治疗性蛋白质是人酸性鞘磷脂酶。在一个优选的实施方案中，递送后在脑中产生编码的治疗性蛋白质达至少六个月。在一个实施方案中，递送到丘脑的治疗剂是治疗性蛋白质。主题治疗性蛋白质能够易位到皮质。在一个实施方案中，治疗性蛋白质是酶。在一个实施方案中，治疗性蛋白质选自生长因子，包括神经营养因子；激素；免疫调节肽和蛋白质，包括细胞因子；和神经调节肽。在一个实施方案中，皮质神经障碍是A型尼曼匹克病，且治疗性蛋白质是人酸性鞘磷脂酶。在一个实施方案中，所述方法包括通过CED将治疗剂单次输注到丘脑。在另一实施方案中，所述方法包括通过CED将治疗剂不止一次输注到丘脑。在一个优选的实施方案中，将治疗剂递送到丘脑中的不止一处位置。在一个实施方案中，使用不止一个插管来将治疗剂递送到不止一处位置。在一个优选的实施方案中，将治疗剂在两侧递送到丘脑。在一个优选的实施方案中，将治疗剂在两侧递送到相应的丘脑核。在一个实施方案中，所述方法进一步包括将治疗剂递送到脑干。在一个实施方案中，通过CED的递送包括步进(st印ping)。在一个优选的实施方案中，将示踪剂(优选MRI对比增强剂)与治疗剂输注物共递送，以对输注物的组织分布进行实时监测。在一方面，本发明提供将治疗剂递送到灵长类动物的皮质的方法，包括通过CED 将治疗剂递送到丘脑。在一个优选的实施方案中，将治疗剂递送到丘脑中的不止一处位置。在一个实施方案中，使用不止一个导管来将治疗剂递送到不止一处位置。在一个优选的实施方案中，将治疗剂递送到至少第一和第二皮质神经元群，它们分别由起源于第一和第二丘脑核的丘脑皮质投射支配，其中丘脑核是不同的。在一个优选的实施方案中，将治疗剂递送到皮质的不止一个功能区。在一个优选的实施方案中，将治疗剂递送到皮质的不止一个叶。在一个优选的实施方案中，治疗剂是包含编码治疗性蛋白质的核酸的病毒颗粒。在一个优选的实施方案中，该病毒颗粒是AAV颗粒。在一个优选的实施方案中，该 AAV 颗粒选自 AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8 和 AAV9。在一个实施方案中，治疗剂是蛋白质。在一个优选的实施方案中，将治疗剂递送到丘脑中的不止一处位置。在一个实施方案中，使用不止一个插管来将治疗剂递送到不止一处位置。在一个优选的实施方案中，将治疗剂在两侧递送到丘脑。在一个优选的实施方案中，将治疗剂在两侧递送到相应的丘脑核。在一个实施方案中，所述方法进一步包括将治疗剂递送到脑干。在一个实施方案中，通过CED的递送包括步进。在一个优选的实施方案中，将示踪剂(优选MRI对比增强剂)与治疗剂输注物共递送，以对输注物的组织分布进行实时监测。

图1 将AAV2-GDNF输注到丘脑当中后的⑶NF蛋白分布。㈧通过在丘脑输注同侧的前额叶皮质中的IHC染色检测出的GDNF表达。(B，C)在皮质区8中的多层间发现大
6量的非锥体GDNF阳性神经元。(D，G)在扣带回皮质、前运动皮质和侧前额叶皮质中的GDNF IHC染色。(E，F，H，I)在表达⑶NF的前运动皮质(区6)的板层V和VI中的锥体神经元。 强GDNF免疫阳性染色在锥体神经元上方的皮质层中是明显的。(J)在经输注的丘脑中加强的GDNF阳性染色和在体觉皮质(区3)和运动皮质(区4)中的皮质GDNF表达。(K，L)在体觉皮质的板层V和VI中的⑶NF阳性神经元。AP 与前囱的前/后距离(按mm计)。比例尺500 μ m(B, Ε, H, K)，100 μ m(C，F，I，L)。图2 将AAV2-GDNF输注到右丘脑中之后的⑶NF表达水平。(A-F)经⑶NF IHC染色的切片的假彩色图像，其示出丘脑和皮质两者中的GDNF分布的梯度。蓝色代表DAB染色的最高强度，而红色代表最低强度。图A和D中的数字代表从相邻组织块测量的不同脑区中的GDNF蛋白水平(μ gGDNF/mg总蛋白质)。(B，C，E，F)皮质的更高放大率示出板层III/ IV中的高强度GDNF染色和板层V/VI锥体神经元中存在GDNF的高胞质。与前囱的前/后距离(按 mm 计)。比例尺10mm(A，D)，500ym(B，E)，100ym(C，F)。图3 将AAV2-GFP输注到左丘脑后的GFP的皮质表达。在不同皮质区内发现个别的GFP免疫阳性神经元。(A，B)皮质锥体神经元是GFP阳性神经元的主要类型。还在皮质中发现没有锥体形态的神经元，包括(C)篮状神经元和(D)神经胶质样细胞。(E，F)还在额叶皮质中发现大量的GFP阳性纤维网络。比例尺500 μ m(A，Ε)，100 μ m(B，C)，50 μ m(D， F)。图4 图3中示出的在将AAV2-GFP通过CED递送到动物后的丘脑中的GFP免疫染色。特定丘脑核被转导，这导致GFP的相应皮质递送。图5 用于CNS实质输注物递送的阵列CED元件。(A) T2加权MR图像，其示出具有位于头骨表面上的烟囱式阵列的NHP脑(B).利用这些烟囱式设计的阵列来安全地插入抗回流、梯级设计的插管(C)以有效地将输注物递送到CNS实质中。图6 近实时CED在NHP丘脑和脑干中的术中用途。在MRI上显现为对比分界的 AAV2-hASM-HA/Gd输注指示插管尖端在靶定区中的放置(A-B ；白色箭头)。如连续MR图像采集中所显示，注意输注物体积的增加是时间的函数。图7 在丘脑(黑色符号)和脑干(白色符号)中共输注AAV2-hASM_HA和Gd。将不同量的输注物单次递送到丘脑(黑色圆圈，N = 10 ；平均Vi Vd比例3. 86[SEM+/"0. 25]) 和脑干(白色圆圈，N = 6 ；平均Vi Vd比例3. 3[SEM+/-0. 17])中。Vi与Vd之间是线性关系(总体上，N= 16，R2 = 0.93)，其中与丘脑相比递送到脑干区域的Vi更高。这两个区域中的比例间没有发现显著差异(P > 0. 05)。图8 反复的丘脑和脑干输注的Vi与Vd比较。在由AAV2-hASM_HA/Gd(白色框，N =5 ；平均Vi Vd比例3. 72[SEM+/"0. 24], R2 = 0. 98)组成的随后输注中反复在仅Gd输注(黑色框，N= 5 ；平均 Vi Vd 比例 3. 74[SEM+/-0. 25]，R2 = 0. 96)期间的初始 Vi Vd 递送参数。注意在用或不用治疗剂的连续输注中观察到一致的分布模式(总体上，N= 10， R2 = 0. 96)。在初次或二次输注间没有发现显著差异(P > 0. 05)。图9 丘脑和脑干中的hASM和HA染色的共定位。丘脑(A_C ；左侧，hASM
和 ΗΑ
；右侧，hASM
和 HA
)和脑干输注区(D-F ； hASM
和HA
)中针对hASM或HA表位染色的相似免疫反应性区域。注意代表对每次输注测量的区的黑线和白线(黑线=抗hASM;白线=抗HA)的重叠。
图10 丘脑和脑干中的AAV输注和转导。代表丘脑和脑干输注的DICOM MR图像 (A和E)，以及在解剖上与相应的MRI匹配的经免疫染色的脑切片(B和F)。高倍放大图像显示在每个靶定区中含有显著的神经元转导(HA表达)的输注中心(C-D和G-H)。图11 :hASM-HA的皮质表达。(A)直接将输注物递送到丘脑中揭示治疗剂大量分布到前额叶皮质区域中。(B)更高的放大率图像指示皮质神经元的AAV转导(HA阳性)。发明详述如本文中所使用，“皮质神经障碍”指涉及皮质的神经障碍。皮质神经障碍是如下的神经障碍，其(i)涉及与丘脑在解剖上直接连接的皮质中的细胞群，和/或(ii)涉及与 (i)中的皮质细胞群在解剖上直接连接的细胞群。优选的皮质神经障碍涉及大皮质区，优选皮质的不止一个功能区，优选皮质的不止一个叶，且多达及包括整个皮质。优选的皮质神经障碍包括但不限于创伤性脑损伤；中风；酶功能障碍病症；精神疾病，包括创伤后压力综合征；神经退行性疾病，包括亨延顿氏舞蹈症、帕金森病和阿耳茨海默氏病；癫痫；和认知障碍，包括痴呆、孤独症和抑郁症。优选的酶功能障碍病症包括但不限于脑白质营养不良，包括卡纳万氏病；和溶酶体贮积症(LSD)，包括尼曼匹克病、戈谢病、巴藤病、法布瑞氏症和庞贝氏症。病症的此列表是示例性的而且是非限制性的。哪些神经障碍适合于通过基于皮质病理学和神经解剖学连通性的本方法来治疗对于适度熟练的技术人员是显而易见的。如本文中所使用，“皮质”指大脑皮质。施用方法本方法包括将治疗剂直接递送到丘脑。通过对流增强递送(CED)来完成递送以在患者中实现治疗剂的有效运输。术语“患者”、“受试者”和“个体”在本文中可互换使用，并且指大的哺乳动物，优选的是灵长类动物，最优选的是人。“患者”不包括小的哺乳动物，如啮齿类动物。“CED”意为以大于0. 5 μ L/分钟的速率输注。优选地，使用合适的导管或插管，优选梯级设计的无回流插管来完成CED。方法涉及至少靠近靶丘脑组织放置插管的尖端，优选将尖端插入丘脑中。在放置插管后，将其与泵连接，所述泵经由插管尖端将治疗剂递送到靶丘脑组织。在输注过程中维持自插管尖端起的压力梯度。术中MRI(iMRI)及使用示踪剂来监测输注是非常优选的。“靠近”靶丘脑群意为在靶群的有效距离内。特别地，就相对于靶丘脑组织放置插管而言，靠近指在通过CED递送时使得输注物将到达靶组织的距离。在一个优选的实施方案中，CED包括0. 5 μ L/分钟-10 μ L/分钟的输注速率。在一个优选的实施方案中，CED包括输注速率，其大于约0. 5 μ L/分钟、更优选地大于约0. 7 μ L/分钟、更优选地大于约1 μ L/分钟、更优选地大于约1. 2 μ L/分钟、更优选地大于约1. 5 μ L/分钟、更优选地大于约1. 7 μ L/分钟、更优选地大于约2 μ L/分钟、更优选地大于约2. 2 μ L/分钟、更优选地大于约2. 5 μ L/分钟、更优选地大于约2. 7 μ L/分钟且更优选地大于约3 μ L/分钟，以及优选地小于约25 μ L/分钟、更优选地小于约20 μ L/分钟、更优选地小于约15 μ L/分钟、更优选地小于约12 μ L/分钟、更优选地小于约10 μ L/分钟。在一个优选的实施方案中，CED包括递送过程中的流速递增增加，称为“步进”。优选地，步进包括介于0. 5 μ L/分钟和10 μ L/分钟之间的输注速率。
在一个优选的实施方案中，步进包括输注速率，其大于约0. 5 μ L/分钟、更优选地大于约0. 7 μ L/分钟、更优选地大于约1 μ L/分钟、更优选地大于约1. 2 μ L/分钟、更优选地大于约1. 5 μ L/分钟、更优选地大于约1. 7 μ L/分钟、更优选地大于约2 μ L/分钟、更优选地大于约2. 2 μ L/分钟、更优选地大于约2. 5 μ L/分钟、更优选地大于约2. 7 μ L/分钟且更优选地大于约3 μ L/分钟，以及优选地小于约25 μ L/分钟、更优选地小于20 μ L/分钟、 更优选地小于约15 μ L/分钟、更优选地小于约12 μ L/分钟且更优选地小于约10 μ L/分钟。在一个优选的实施方案中，将梯级设计的无回流插管与泵连接，所述泵产生足够的压力以便以受控的速率使输注物流过插管到达靶组织。可以使用任何合适的流速，使得以合适的水平维持颅内压，从而不损害脑组织。可以使用不止一个插管，但是单个插管是优选的。根据适合于所治疗的皮质神经障碍和患者响应，递送可以一次或不止一次完成， 且其是适度熟练技术人员容易确定的。在一个实施方案中，通过使用促进剂来进一步增加渗透。促进剂能够进一步有助于将输注物递送到靶组织。当递送的治疗剂是治疗性蛋白质时，促进剂是特别优选的。特别优选的是低分子量肝素。参见例如2007年4月25日提交的USSN 11/740，124，其以引用的方式明确地并入本文。在一个非常优选的实施方案中，将示踪剂(优选的是MRI对比增强剂)与治疗剂输注物共递送以对输注物的组织分布进行实时监测。参见例如Fiandaca等，NeuroImage, 2008年11月27日(印刷前的电子出版)。参见例如2007年4月沈日提交的USSN 11/740，508，及2007年4月25日提交的USSN 11/740，124，二者以引用的方式明确地并入本文。使用示踪剂可以提示递送的停止。也可以使用本领域中已知的其它示踪和成像手段来追踪输注物分布。可以以此方式施用任何合适量的输注物。合适量是在治疗上有效而不引起过多不期望的副作用的量。如本领域技术人员所认可，对于病毒颗粒输注物，合适量将取决于效价、感染性、靶组织的体积、活性剂的性质和其它因素。优选地，Vi Vd比例至少是1 1。关于CED方法的进一步的教导，参见例如Saito等，Exp. Neurol.，196 =381-389, 2005 ；Krauze 等，Exp. Neurol. , 196 104-111, 2005 ；Krauze 等，Brain Res. Brain Res. Protocol.，16 :20-26, 2005 ；美国专利申请公开 No. 2006/0073101 ；及美国专利 No. 5，720，720，每篇的全文以引用的方式并入本文。还可参见Noble等，Cancer Res. 2006 年 3 月 1 日；66 (5) :2801-6 ；Saito 等，J Neurosci Methods. 2006 年 6 月 30 日；154 (1-2) 225-32 ；Hadaczek 等，Hum Gene Ther. 2006 年 3 月；17 (3) :291-302 ；及 Hadaczek 等，Mol Ther. 2006年7月；14(1) :69_78，每篇的全文以引用的方式并入本文。还可参见2007年4月沈日提交的USSN 11/740，M8，其全文以引用的方式明确地并入本文。还可参见美国专利No. 6，953，575，其全文以引用的方式明确地并入本文。在一个非常优选的实施方案中，用CED相容的无回流梯级设计插管完成CED方法。 此类非常优选的插管公开在Krauze等，JNeurosurg. 2005年11月；103 (5) :923-9(其全文以引用的方式并入本文)及美国专利申请公开No. US 2006/0135945A1 (其全文以引用的方式并入本文)和美国专利申请公开No. US 2007/008^95Α1(其全文以引用的方式并入本文)。关于用于本发明的优选插管的更多内容，参见PCT/US08/64011。用于本发明的示例性泵系统包括美国专利No. 7，351，239、No. 7，341，577、 No. 6，042，579、No. 5，735，815 和 No. 4，692，147 中所描述的可植入系统。任选地，本治疗方法包括一次或多次术前诊断测定皮质神经障碍的存在。优选地， 完成的诊断测定包括神经成像。在一个实施方案中，诊断测定涉及遗传测试。优选地，该方法还包括术前成像以立体定向确定靶定丘脑群的位置。在一个优选的实施方案中，所述方法另外包括施用过程中的成像以监测插管定位。在一个实施方案中，所述方法包括使用神经导航系统，例如参见美国专利申请公开 No. 2002/0095081，其全文以引用的方式并入本文。在一个方面，本发明提供了汇编数据的方法，所述数据获自通过CED递送的输注物分布的基于图像的监测。数据可以包括但不限于输注物的体积、分布体积、神经解剖学分布、遗传数据、输注参数、插管参数和插管布置数据。在一个实施方案中，本发明提供了包含此类数据的数据库。在一个实施方案中，数据库可用于导出描述皮质神经障碍患者的CNS 中的输注物分布的算法，而且可以用于为治疗递送建模。设想可以在本文的方法中使用主题治疗剂的组合。例如，设想可以使用不止一种类型的病毒颗粒，而且病毒颗粒输注物可以在组合治疗中与有效量的第二治疗剂一起施用。第二药剂可以或不可递送到丘脑。接受治疗剂递送的具体丘脑核将取决于所治疗的皮质神经障碍。基于本领域中的神经解剖学知识，哪些皮质群在任何给定的皮质神经障碍中受到影响，及因此哪些丘脑核应当被靶定对于适度熟练的技术人员是显而易见的。例如，参见McFarland等， J. Neurosci. ,22 :8117_8132，2002，其以引用的方式明确地并入本文。在一个优选的实施方案中，将治疗剂递送到多个丘脑核。可以用一个或多个输注插管来完成此类递送。对于涉及相对更离散的皮质区和/或支配此类相对更离散的皮质域的三级CNS群的病症，且特别在治疗剂在靶皮质域外部的皮质区中可能具有不期望的效果的情况下，将治疗剂递送到一个或多个选定的支配靶皮质域的丘脑核，由此将皮质分布限制于期望的皮质域。在一个实施方案中，所述方法包括将治疗剂施用到单一丘脑位置。在另一个实施方案中，所述方法包括将治疗剂施用到不止一处丘脑位置。在一个实施方案中，所述方法包括在两侧施用治疗剂。在一个优选的实施方案中，所述方法包括在两侧将治疗剂施用到相应的丘脑核。在适合于所治疗的皮质神经障碍的情况下，可以靶向投射到受影响的皮质区域的任何丘脑核以用于递送。在一个优选的实施方案中，所述方法包括将治疗剂递送到一个或多个丘脑核，其选自前核群、背内侧核、腹侧、腹前测、腹外侧、腹后外侧、腹后内侧、外侧核群、中线核群、丘脑枕、外侧或内侧膝状体核。在一个实施方案中，所述方法进一步包括将治疗剂施用于脑干。此实施方案在皮质神经障碍进一步涉及脑干的情况下是特别优选的。例如，对于治疗许多皮质神经障碍 (包括溶酶体贮积症)的呼吸方面，期望将治疗剂另外施用到脑干。用于丘脑递送的治疗性蛋白质可以递送到丘脑的治疗性蛋白质能够易位到皮质。在一个实施方案中，治疗性蛋白质是酶。在一个实施方案中，治疗性蛋白质选自生长因子，包括神经营养因子；激素；免疫调节肽和蛋白质，包括细胞因子；和神经调节肽。在一个优选的实施方案中，本发明的治疗性蛋白质选自NGF、BDNF, NT_3、NT-4/5、 NT-6、GDNF、CNTF、LIF、IGF-l、b-FGF、neurturin、pers^)hin、artemin、TGFa 、TGF0 、IGF_2、 PDGF、EGF、向心素(cardiotropin)、EGF、IGF、VEGF、Sonic hedgehog (SHH)、BMP、FGF20、VIP、 PDGF、多效生长因子(PTN)和HGF。治疗性蛋白质中包括治疗性蛋白质衍生物，包括生长因子衍生物。关于治疗性蛋白质的进一步的讨论，参见例如2007年4月25日提交的USSN 11/740，124，其全部内容通过引用的方式明确地并入本文。可以递送到丘脑的治疗性蛋白质包括由如下文所描述的治疗性核酸编码的蛋白质，其中治疗性蛋白质能够易位到皮质。病毒颗粒和基因转移在一个实施方案中，本方法包括通过包含编码治疗性蛋白质的核酸的病毒颗粒转导丘脑神经元、丘脑神经元中的治疗性蛋白质的表达以及将治疗性蛋白质顺向运输到皮质。在一个实施方案中，本方法包括将包含编码治疗性蛋白质的核酸的病毒颗粒顺向易位到皮质中的神经元、皮质神经元的转导以及皮质神经元中的治疗性蛋白质的表达。在一个实施方案中，本方法包括通过包含编码治疗性蛋白质的核酸的第一病毒颗粒转导丘脑神经元、丘脑神经元中的治疗性蛋白质的表达、将治疗性蛋白质顺向运输到皮质以及将包含编码治疗性蛋白质的核酸的第二病毒颗粒顺向易位到皮质中的神经元、皮质神经元的转导以及皮质神经元中的治疗性蛋白质的表达。在一个实施方案中，本方法进一步包括将病毒颗粒和/或治疗性蛋白质易位到与皮质区连接的三级神经元群，从丘脑接受治疗剂的皮质神经元位于该皮质区。三级位点可以是端脑中不与受试者丘脑核直接连接的位置。在一个特别优选的实施方案中，三级位点是基底前脑。此方法对于治疗阿耳茨海默氏病是非常优选的。可以在本发明中使用任何可以携带治疗性核酸并转导丘脑和/或皮质神经元从而生成治疗剂(例如，编码的治疗性蛋白质)的病毒颗粒。在病毒能够在皮质神经元中而不是在丘脑神经元中生成治疗剂的情况下，病毒必须能够易位。在病毒能够在丘脑神经元中而不是在皮质神经元中生成治疗剂的情况下，治疗剂必须能够易位到皮质。一种用于本发明的优选的病毒颗粒是能够从丘脑易位到皮质的病毒颗粒。优选的病毒颗粒中包括腺伴随病毒(AAV)。包括作为混杂物的AAV 1_11(例如，参见 Choi 等，“AAV Hybrid Serotypes Improved Vectors for Gene Delivery",Curr Gene Ther. 2005 年 6 月；5(3) :299-310)。优选的 AAV 包括但不限于 AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、 AAV6、AAV7、AAV8和AAV9。特别优选的是AAV2。如本文中所使用，“AAV”指重组AAV (即， 那些人工改造成携带治疗性核酸的AVV)，及天然AAV。重组AAV在本文中又称为“rAAV”。“基因转移”或“基因递送”指用于将外源DNA可靠地插入宿主细胞中的方法或系统。此类方法可以导致非整合的转移DNA的瞬时表达、转移的复制子(例如，附加体)的染色体外复制和表达或转移的遗传物质向宿主细胞的基因组DNA中的整合。已经开发出用于将基因转移到哺乳动物中的许多系统。参见例如美国专利No. 5，399，346，其全文通过引用的方式明确地并入本文。“载体”意为在与适当的控制元件结合时能够复制，且其能在细胞间转移基因序列
11的任何遗传成分，如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒粒子等。因此，该术语包括克隆和表达运载体，以及病毒载体。“重组病毒”意为已经例如通过将异源核酸构建体添加或插入到颗粒中而发生遗传改变的病毒。“AAV病毒粒子”或“AAV颗粒”意为完整的病毒颗粒，如野生型(wt) AAV病毒颗粒 (其包含与AAV衣壳蛋白质外壳相关的线性、单链AAV核酸基因组)或重组AAV颗粒。就这一点而言，任意互补有义单链AAV核酸分子(例如“有义”或“反义”链)可以被包装到任一种AAV病毒粒子中，而且这两条链具有同等感染性。“重组AAV病毒粒子”(有时称为“rAAV病毒粒子”或“rAAV颗粒”)优选地是由 AAV蛋白质壳构成的具感染性的复制缺陷型病毒，所述AAV蛋白质壳包封在两侧侧翼都有 AAV ITR的目标异源核苷酸序列。rAAV病毒粒子可以在合适的宿主细胞中生成，所述合适的宿主细胞已经具有导入其中的AAV载体、AAV辅助功能及辅佐功能。如此，使宿主细胞能够编码AAV多肽，其是将AAV载体(含有靶重组核苷酸序列)包装到感染性重组病毒粒子中以供随后进行基因递送所需要的。术语“转染”或“转导”用于指细胞摄取外源DNA，并且在已经将外源DNA导入细胞膜内部时，细胞已经被“转染”或“转导”。多种转染技术是本领域普遍已知的。参见例如 Graham等(1973) Virology, 52 :456, Sambrook 等(1989)Molecular Cloning, a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratories,New York,Davis等(1986)Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier 和 Chu 等，(1981)Genel3 :197。可以使用此类技术来将一种或多种外源DNA部分(如核苷酸整合载体和其它核酸分子)导入合适的宿主细胞中。术语“宿主细胞”表示例如可以是或者已经作为AAV辅助构建体、AAV载体质粒、辅佐功能载体或其它转移DNA的受体使用的微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。该术语包括已经被转染的初始细胞的后代。因此，如本文中所使用，“宿主细胞”一般指已经用外源DNA序列转染的细胞。应当理解，由于天然的、偶然的或有意的突变，单一亲本细胞的后代可以在形态学或基因组或总DNA互补物上不必与初始亲本完全相同。如本文中所使用，术语“细胞系”指能够在体外连续或持续生长和分裂的细胞群。 通常，细胞系是源自单一祖细胞的克隆群。本领域中进一步已知的是，在此类克隆群的存储或转移过程中，可以在核型上发生自发或诱导的变化。因此，源自所提及的细胞系的细胞可以与祖细胞或培养物不完全相同，并且所提及的细胞系包括此类变异体。术语“异源的”在其涉及核酸序列(如编码序列和控制序列)时表示通常不连接在一起，和/或通常与特定细胞无关的序列。因此，核酸构建体或载体的“异源”区是在另一个核酸分子内或附接于另一个核酸分子的核酸片段，发现该核酸分子与其它天然分子没有关联。例如，核酸构建体的异源区可以包括侧翼有发现与天然编码序列没有关联的序列的编码序列。异源编码序列的另一个例子是其中没有发现天然的编码序列本身(例如，具有与天然基因不同的密码子的合成序列)的构建体。类似地，出于本发明的目的，将认为经通常不存在于细胞中的构建体转化的细胞是异源的。如本文中所使用，等位基因变异或天然发生的突变事件不产生异源DNA。“编码序列”或“编码”特定蛋白质的序列指在适当的调节序列的控制下放置时在体外或在体内被转录(在DNA的情况下)和翻译(在mRNA的情况下)成多肽的核酸序列。通过5'(氨基)端的起始密码子和3'(羧基)端的翻译终止密码子来确定编码序列的边界。编码序列可以包括但不限于来自原核或真核mRNA的cDNA、来自原核或真核DNA的基因组DNA序列以及甚至合成的DNA序列。转录终止序列将通常位于编码序列的3'。“核酸”序列指DNA或RNA序列。该术语涵盖包括DNA和RNA的任何已知碱基类似物的序列，例如但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、氮丙啶基胞嘧啶 (aziridinylcytosine)、假异胞嘧啶(pseudoisocytosine)、5_(羧基羟基甲基)尿嘧啶、 5-氟尿嘧啶、5-嗅尿嘧啶、5羧基甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、 β -D-甘露糖基Q核苷(beta-D-mannosylqueosine)、5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟乙酸、 oxybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、2_巯基胞嘧啶、5-甲基_2_硫尿嘧啶、2_硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟乙酸、假尿嘧啶、Q核苷、2-巯基胞嘧啶和2，6- 二氨基嘌呤。术语DNA “控制序列”包括但不限于启动子序列、聚腺苷酸化信号、转录终止序列、 上游调节域、复制起点、内部核糖体进入位点(“IRES”)、增强子等，它们共同提供受体细胞中的编码序列的复制、转录和翻译。不是所有这些控制序列需要总是存在，只要选定的编码序列能够在合适的宿主细胞中复制、转录和翻译。术语“启动子区”在本文中以其普通的含义使用，指包含DNA调节序列的核苷酸区，其中所述调节序列源自能够结合RNA聚合酶，并启动下游(3'方向)编码序列的转录的基因。“可操作连接”指以下的元件布置，其中配置如此描述的构件，使得执行其通常的功能。因此，与编码序列可操作连接的控制序列能够影响编码序列的表达。控制序列不需要与编码序列是连续的，只要它们发挥功能以指导其表达。因此，例如，居间的未翻译但转录序列可以存在于启动子序列与编码序列之间，而且仍可以认为启动子序列与编码序列“可操作连接”。在提及核苷酸序列时，“分离的”意为指定的分子在基本上没有相同类型的其它生物大分子的情况下存在。因此，“编码特定多肽的分离的核酸分子”指基本上没有不编码该多肽的其它核酸分子的核酸分子；然而，该分子可以包含不对组合物的基本特征产生不利影响的一些其它碱基或部分。为了在整个本申请中描述特定核酸分子中的核苷酸序列的相对位置，如在将特定核苷酸序列描述为相对于另一个序列位于“上游”、“下游”、“3' ”、或“5' ”时，应当理解， 如本领域中常规的，它是所提及的DNA分子的“有义”或“编码”链中的序列位置。“基因”指含有至少一个开放阅读框的多核苷酸，所述可读框能够在转录或翻译后编码特定多肽或蛋白质。可以使用本文中所描述的任何多核苷酸序列来鉴别与其关联的基因的较大片段或全长编码序列。分离较大片段序列的方法是本领域技术人员已知的。如本文中所描述，认为两个核酸片段“选择性杂交”。两个核酸分子之间的序列同一性程度影响此类分子间的杂交事件的效率和强度。部分相同的核酸序列将至少部分抑制完全相同的序列与靶分子杂交。可以使用本领域中公知的杂交测定(例如，Southern印迹、 Northern 印迹、溶液杂交等，参见 Sambrook,等,Molecular Cloning ALaboratory Manual, 第二版，(1989)Cold Spring Harbor, N. Y.)来评估完全相同的序列的杂交的抑制。可以使用不同程度的选择性，例如使用从低变化到高的严格性的条件来进行此类测定。若采用低严格性条件，则可以使用第二探针来评估非特异性结合的缺乏，所述第二探针甚至缺乏部分的序列同一性程度(例如，与靶分子具有小于约30%序列同一性的探针)，使得在没有非特异性结合事件的情况下，第二探针将不与靶物杂交。在利用基于杂交的检测系统时，选择与靶核酸序列互补的核酸探针，然后通过选择合适的条件，探针和靶分子彼此“选择性杂交”或结合以形成杂交分子。能够在“中等严格”条件下与靶序列选择性杂交的核酸分子通常在允许检测以下的靶核酸序列的条件下杂交，所述靶核酸序列长度为至少约10-14个核苷酸且与选定的核酸探针的序列具有至少约 70%序列同一性。严格杂交条件通常允许检测长度为至少约10-14个核苷酸且与选定的核酸探针的序列具有大于约90-95 %的序列同一性的靶核酸序列。如本领域中已知，可以确定在探针和靶物具有特定序列同一性程度情况下可用于探针/靶物杂交的杂交条件(参见例如 Nucleic Acid Hybridization :A Practical Approach, B. D. Hames 禾口 S. J. Higgins编著，(1985) Oxford ； Washington, DC ； IRL Press)。关于杂交的严格性条件，本领域中公知的是，可以通过改变一些因素和改变洗涤条件，采用多种等同条件来建立特定的严格性，这些因素包括探针和靶序列的长度和性质、各个序列的碱基组成、盐和其它杂交溶液组分的浓度、杂交溶液中阻断剂(例如，甲酰胺、硫酸葡聚糖和聚乙二醇)的存在或缺乏、杂交反应温度和时间参数。遵循本领域中的标准方法来选择特定组的杂交条件(参见例如Sambrook，等，Molecular Cloning =A Laboratory Manual,第二版，(1989)Cold Spring Harbor, N. Y.)。用于测定核酸和氨基酸“序列同一性”或“同源性”的技术也是本领域中已知的。 通常，此类技术包括测定基因的mRNA的核苷酸序列和/或测定由其编码的氨基酸序列，并将这些序列与第二核苷酸或氨基酸序列比较。一般地，“同一性”分别指两个多核苷酸或多肽序列的精确的核苷酸间或氨基酸间对应。两个或多个序列(多核苷酸或氨基酸)可以通过测定其“百分比同一性”来比较。两个序列(无论是核酸还是氨基酸序列)的百分比同一性是两个比对的序列之间的精确匹配数目除以较短序列的长度并乘以100。通过 Smith 禾口 Waterman，Advances in Applied Mathematics 2:482—489(1981)的局部同源性算法来提供核酸序列的近似比对。可以通过使用由Dayhoff，Atlas of Protein Sequences and Structure，Μ· 0. Dayhoff 编著，5 ±曾干Ij 3 :353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D. C. , USA 开发，并由 Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6) 6745-6763(1986)标准化的评分矩阵来将此算法应用到氨基酸序列。Genetics Computer Group (Madison, Wis.)在“BestFit”实用新型申请中提供了此算法用于测定序列百分比同一性的示例性执行。Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual (序列分析包程序手册)，第 8 版(1995)(可获自 Genetics Computer Group,Madison, Wis.)中描述了此方法的缺省参数。在本发明的语境中的建立百分比同一性的优选方法是使用由爱丁堡大学获得版权的，由 John F. Collins 和 Shane S. Sturrok 开发的，且由 IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, Calif.)发布的MPSRCH程序包。通过此套包，可以采用Smith-Waterman
14算法，其中对评分表使用缺省参数(例如空格开放罚分(gap open penalty)为12，空格延伸罚分(gap extension penalty)为1，而空格为6)。从所产生的数据看，“匹配”数值反映“序列同一性”。其它适合于计算序列间的百分比同一性或相似性的程序一般是本领域中已知的，例如另一种算法程序是与缺省参数一起使用的BLAST。例如，可以使用 BLASTN和BLASTP，其使用下列缺省参数进行遗传密码=标准的；滤器=无；链=两条；截留=60 ；预期=10 ；矩阵=BL0SUM62 ；描述=50个序列；分类=高得分；数据库=非冗余， GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS 翻译+Swiss 蛋白 +Spupdate+PIR。可以在以下因特网地址找到这些程序的详情http://www. ncbi. nlm. gov/cgi-bin/BLAST。或者，可以通过在同源区间形成稳定的双链体的条件下杂交多核苷酸，接着用单链特异性核酸酶消化，并对经消化的片段进行大小测定来确定同源性。如使用上述方法所测定，当序列在分子的限定长度里表现出至少约80% -85%，优选地至少约90%，且最优选地至少约95% -98%序列同一性时，两个DNA，或两个多肽序列是彼此“基本上同源的”。 如本文中所使用，基本上同源的也指与指定的DNA或多肽序列显示完全同一性的序列。可以在例如如该特定系统所限定的严格条件下在Southern杂交实验中鉴别基本上同源的 DNA序列。限定合适的杂交条件在本领域技术范围内。参见例如Sambrook等，见上文；DNA Cloning,见上文；Nucleic Acid Hybridization,见上文。病毒载体的构建可以利用分子生物学领域中公知的方法(参见例如Ausubel或Maniatis，见上文)来构建可用于实施本发明的基因递送运载体。本文中的描述应当解释为示例性的，而非限制性的。通常，从编码转基因或与转基因对应的多核苷酸、合适的调节元件和生成介导细胞转导的病毒蛋白所必需的元件装配携带转基因的病毒载体。例如，在一个优选的实施方案中，采用腺伴随病毒(AAV)载体。通用方法一种获得病毒载体的核苷酸组分的优选方法是PCR。MacPherson等，PCR =A PRACTICAL APPROACH, (IRL Press at Oxford University Press, (1991))中教导了 PCR 的一般过程。可以凭经验确定每个应用反应的PCR条件。许多参数影响反应的成功。在这些参数中的是退火温度和时间、延伸时间、Mg2+和ATP浓度、pH，和引物、模板和脱氧核糖核苷酸的相对浓度。在扩增后，可以通过琼脂糖凝胶电泳，接着用溴化乙锭染色和紫外线照明显现来检测所得的片段。用于获得多核苷酸的另一种方法是通过酶消化。例如，可以通过用合适的识别限制酶来消化合适的载体，从而生成核苷酸序列。然后，可以酌情将所得的片段连接在一起。使用本领域中公知的方法来将多核苷酸插入载体基因组中。例如，可以在合适的条件下使插入物和载体DNA与限制酶接触以在每个分子上产生可以彼此配对并用连接酶连接的互补末端或平端。或者，可以将合成的核酸接头与多核苷酸的末端连接。这些合成的接头可以含有与载体DNA中的特定限制性位点对应的核酸序列。其它手段是本领域中已知的且可用的。逆转录病毒和腺病毒载体已经使用许多基于病毒的系统进行基因递送。参见例如美国专利No. 5，576，201， 通过引用的方式明确地并入本文。例如，逆转录病毒系统是已知的，而且一般采用具有整合的缺陷型原病毒(“辅助者”)的包装系，所述缺陷型原病毒表达病毒的所有基因，但是由于称为PSi序列的包装信号的缺失而不能包装其自身的基因组。因此，该细胞系生成空的病毒壳。生成系可以源自包装系，其除了辅助者外，还含有病毒载体，该病毒载体包括病毒的复制和包装需要的顺式序列(称为长末端重复(LTR))。可以将目标基因插入载体中，并包装在由逆转录病毒辅助者合成的病毒壳中。然后，可以将重组病毒分离，并递送到受试者。 (参见例如，美国专利No. 5，219，740)。代表性的逆转录病毒载体包括但不限于如在例如美国专利No. 5，219，740(其全文通过引用的方式并入本文)中所描述的LHL、N2、LNSAL、LSHL 和LHL2载体及这些载体的衍生物。可以使用本领域中公知的技术来构建逆转录病毒载体。 参见例如美国专利 No. 5，219，740 ；Mann 等(1983)Cell33 153-159。已经开发基于腺病毒的系统用于基因递送，而且适合于依照本文中所描述的方法递送。人腺病毒是双链DNA病毒，其通过受体介导的胞吞而进入细胞。这些病毒特别好地适合于基因转移，因为它们易于生长和操作，而且它们在体内和在体外表现出宽泛的宿主范围。腺病毒感染静止的及正在复制的靶细胞。与整合到宿主基因组中的逆转录病毒不同，腺病毒在染色体外存留，因此使与插入诱变有关的风险最小化。病毒容易以高效价生成，而且是稳定的，从而它可以被纯化并储存。即使处于有复制能力的形式，腺病毒仅引起低水平的发病率，而且与人恶性肿瘤无关。因而，已经开发出利用这些优点的腺病毒载体。关于腺病毒载体及其用途的描述，参见例如Haj-Ahmad和Graham(1986) J.Virol. 57 267-274 ;Bett 等(1993)J. Virol. 67 :5911-5921 ;Mittereder 等(1994)Human Gene Therapy 5 :717-729 ；Seth ^ (1994) J. Virol. 68 :933-940 ；Barr 等(1994) Gene Therapyl 51-58 ；Berkner, K. L. (1988)BioTechniques 6 :616-629 ；Rich φ (1993)Human Gene Therapy 4 :461_4760AAV表达载体在一个优选的实施方案中，用于本方法的病毒载体是AAV载体。“AAV载体”意为源自腺伴随病毒血清型的载体，包括但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAVX7等。 典型的AAV载体可以具有被全部或部分删除的一个或多个AAV野生型基因，优选的是rep 和/或cap基因，但是保留功能性侧翼ITR序列。功能性ITR序列是AAV病毒粒子的拯救 (rescue)、复制和包装所必需的。AAV载体至少包括病毒的复制和包装需要的那些顺式序列 (例如功能性ITR)。ITR不需要是野生型核苷酸序列，并且可以例如通过核苷酸的插入、缺失或取代来改变，只要该序列提供功能性释放、复制和包装。关于各种AAV血清型的更多内容，参见例如Cearley等，Molecular Therapy, 16 1710-1718，2008，其全文通过引用的方式明确地并入本文。可以使用已知的技术来构建AAV表达载体以在转录方向上提供作为可操作连接的构件的控制元件，包括转录起始区、目标DNA和转录终止区。控制元件选择为在丘脑和/ 或皮质神经元中有功能。可以包括其它控制元件。含有可操作连接的构件的所得构建体以功能性AAV ITR序列为边界(5'和3')。“腺伴随病毒末端反向重复”或“AAV ITR"意为在AAV基因组的每个末端处找到的作为DNA复制起点及作为病毒的包装信号一起顺式发挥作用的本领域公认的区域。AAV ITR与AAV rep编码区一起使置于两个侧翼ITR间的核苷酸序列从哺乳动物细胞基因组中有效的切除和释放及整合到哺乳动物细胞基因组中。AAV ITR区的核苷酸序列是已知的。关于AAV-2序列，参见例如Kotin，R.M. (1994) Human Gene Therapy 5 :793-801 ；Berns,K. I. "Parvoviridae and their Replication"in Fundamental Virology，第 2 版，(B. N. Fields 和 D. Μ· Knipe 编著)。如本文中所使用， "AAV ITR”不需要具有所描述的野生型核苷酸序列，但是可以例如通过核苷酸的插入、缺失或取代来改变。或者，AAV ITR可以源自数种AAV血清型的任何一种，包括但不限于AAV-I、 AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAVX7等。此外，在AAV载体中的选定核苷酸序列侧翼的5‘ 和3' ITR未必是相同的或源自相同MV血清型或隔离群，只要它们如预期的那样发挥作用，即，以允许从宿主细胞基因组或载体切除和释放目标序列，以及在AAV Rep基因产物存在于细胞中时允许异源序列整合到受体细胞基因组中。适合用于AAV载体的DNA分子将包括例如编码受体受试者缺乏或缺失的蛋白质的基因或编码具有期望的生物学或治疗效果的蛋白质(例如，酶或神经营养因子)的基因。适度熟练的技术人员将能够基于所治疗的神经障碍来确定哪个因子是合适的。选定的核苷酸序列与指导其在受试者体内的转录或表达的控制元件可操作连接。 此类控制元件可以包含通常与选定的基因连接的控制序列。或者，可以采用异源控制序列。 有用的异源控制序列一般包括那些源自编码哺乳动物或病毒基因的序列的控制序列。例子包括但不限于SV40早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子、腺病毒主要晚期启动子 (Ad MLP)、单纯疱疹病毒(HSV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子(如CMV立即早期启动子区，CMVIE)、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子、合成启动子、杂合启动子等。此外，源自非病毒基因(如鼠金属硫蛋白基因)的序列也将在本文中得到应用。此类启动子序列可商购自例如 Stratagene (San Diego, Calif.)0在一个实施方案中，使用在丘脑神经元中可操作的启动子。在一个实施方案中，使用在皮质神经元中可操作的启动子。在一个实施方案中，使用在丘脑和皮质神经元两者中都可操作的启动子。出于本发明的目的，异源启动子和其它控制元件，如CNS特异性和诱导型启动子、 增强子等，都将具有特定用途。异源启动子的例子包括CMB启动子。CNS特异性启动子的例子包括那些从髓磷脂碱性蛋白(MBP)、神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)基因分离的启动子。诱导型启动子的例子包括对于蜕皮激素，四环素、缺氧和尼美舒利(aufin)的DNA响应元件。可以通过将选定的序列直接插入已经自其切除主要AAV开放阅读框(“0RF") 的AAV基因组中来构建AAV表达载体，该AAV表达载体包含通过AAV ITR连接的目标DNA 分子。还可以删除AAV基因组的其它部分，只要ITR的足够部分保持允许复制和包装功能。 可以使用本领域中公知的技术来设计此类构建体。参见例如美国专利No. 5，173，414和 No. 5，139,941 ；国际公开 No. WO 92/01070 (1992 年 1 月 23 日公布)和 WO 93/03769(1993 年 3 月 4 日公布)；Lebkowski 等(1988)Molec. Cell. Biol. 8 :3988-3996 ；Vincent 等 (1990)Vaccines90(Cold Spring Harbor Laboratory Press) ；Carter, B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3 :533-539 ；Muzyczka, N. (1992)Current Topics in Microbiol, and Immunol. 158 :97-129 ；Kotin, R. Μ. (1994)Human Gene Therapy 5: 793-801 ；Shelling and Smith(1994)Gene Therapy 1 :165-169 ；和 Zhou 等(1994)J.Exp·Med. 179 :1867_1875。或者，AAV ITR可以从病毒基因组或从含有其的AAV载体中切除，并使用标准的连接技术，如在Sambrook等(见上文中)所描述的技术融合存在于另一个载体中的选定核酸构建体的 5'和 3'。例如，可以在 20mM Tris-Cl pH 7. 5、10mM MgCl2UOmM DTT、33yg/ mlBSA、10mM-50mM NaCl 禾Π 40 μ M ΑΤΡ、0· 01-0. 02 (Weiss)单位 T4DNA 连接酶中于 0°C (对于“粘性末端”连接)或ImM ATP,0. 3-0. 6 (Weiss)单位T4DNA连接酶中于14°C (对于“平端”连接)实现连接。通常以30-100 μ g/ml总DNA浓度(5_100ηΜ总终浓度)来实施分子间“粘性末端”连接。已经在例如美国专利No. 5，139，941中描述了含有ITR的AAV载体。 特别地，其中描述了数种AAV载体，其以保藏号53222、53223、53224、53225和532 可获自美国模式培养物保藏所("ATCC“)。另外，可以合成的方式生成嵌合基因以包含在一个或多个选定的核酸序列的5' 和3'排列的AAV ITR序列。可以使用哺乳动物CNS细胞中用于表达嵌合基因序列的优选密码子。从通过标准方法制备的重叠的寡核苷酸装配完整的嵌合序列。参见例如 Edge, Nature (1981) 292 :756 ；Nambair 等 Science (1984) 223 :1299 Jay 等 J. Biol. Chem. (1984)259 :6311ο为了生成rAAV病毒粒子，使用已知的技术(如通过转染)来将AAV表达载体导入到合适的宿主细胞中。许多转染技术一般是本领域中已知的。参见例如Graham等(1973) Virology, 52 :456, Sambrook 等(1989)Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis 等(1986)Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier和Chu等(1981)Gene 13 :197。特别合适的转染方法包括磷酸钙共沉淀(Graham等(197 Virol. 52 :456-467)、直接微注射到培养的细胞中(Capecchi， M.R. (1980) Cell 22 :479-488)、电穿孔(Shigekawa等(1988)BioTechniques 6:742-751)、 脂质体介导的基因转移(Mannino等(1988)BioTechniques 6 :682-690)、脂质介导的转导 (Feigner 等(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417)和使用高速微粒子发射技术的核酸递送(Klein 等(1987)Nature327 :70-73)。出于本发明的目的，产生rAAV病毒粒子的适合宿主细胞包括可以或者已经作为异源DNA分子的受体使用的微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。该术语包括已经被转染的初始细胞的后代。因此，如本文中所使用，“宿主细胞” 一般指已经用外源DNA序列转染的细胞。来自稳定的人细胞系四3(以保藏号ATCC CRL1573通过例如美国模式培养物保藏所可容易地获得)的细胞是本发明的实践中优选的。特别地，人细胞系293是一种已经用腺病毒5型DNA片段转化(Graham等(1977) J. Gen. Virol. 36 :59)，而且表达腺病毒 Ela和Elb基因(Aiello等(1979) Virology 94 :460)的人胚胎肾细胞系。293细胞系容易转染，而且提供一种产生rAAV病毒粒子的特别方便的平台。AAV辅助功能必须使含有上文所描述的AAV表达载体的宿主细胞能够提供AAV辅助功能以复制并包装侧翼有AAV ITR的核苷酸序列，从而产生rAAV病毒粒子。AAV辅助功能一般是可以进行表达以提供AAV基因产物的源自AAV的编码序列，所述AAV基因产物继而在生产性AAV 复制方面反式发挥功能。AAV辅助功能在本文中用于补充AAV表达载体缺失的必要AAV功能。因此，AAV辅助功能包括主要AAVORF中的一个或二者，即r印和cap编码区，或其功能同系物。已经显示了 R印表达产物具有许多功能，包括AAV DNA复制起点的识别、结合和产生切口 ；DNA解螺旋酶活性和调控从AAV (或其它异源)启动子的转录等。Cap表达产物提供必要的包装功能。AAV辅助功能在本文中用于补充AAV载体缺失的反式AAV功能。术语“AAV辅助构建体”一般指包含提供从AAV载体缺失的AAV功能的核苷酸序列的核酸分子，该AAV载体将用于产生供递送目的核苷酸序列用的转导载体。通常使用AAV 辅助构建体来提供AAV rep和/或cap基因的瞬时表达以补充缺失的对裂解AAV复制必需的AAv功能；然而，辅助构建体缺乏AAV ITR，而且自身既不能复制也不能包装。AAV辅助构建体可以为质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒粒子的形式。已经描述了许多AAV 辅助构建体，如通常使用的质粒pAAV/Ad和ΡΠΕ9+45，其编码R印和Cap表达产物两者。 参见例如 Samulski 等(1989) J. Virol. 63 :3822-3828 ；及 McCarty 等(1991) J. Virol. 65 2936-2945.已经描述了编码R印和/或Cap表达产物的许多其它载体。参见例如美国专利 No. 5，139，941。"AAV r印编码区”意为本领域公认的编码复制蛋白R印78、R印68、R印52和R印 40的AAV基因组的区域。已经显示了这些R印表达产物具有许多功能，包括AAV DNA复制起点的识别、结合和产生切口、DNA解螺旋酶活性和调控从AAV(或其它异源)启动子的转录。R印表达产物是复制AAV基因组共同需要的。关于AAV r印编码区的描述，参见例如 Muzyczka, N. (1992)Current Topics in Microbiol. And Immunol. 158 :97-129 ;R Kotin, R. M. (1994)Human Gene Therapy 5:793-801。AAV r印编码区的合适的同系物包括人疱疹病毒6 (HHV-6) r印基因，已知该基因也介导AAV-2DNA复制(Thomson等(1994) Virology 204 :304-311)。"AAV cap编码区”意为本领域公认的编码衣壳蛋白VP1、VP2和VP3或其功能同系物的AAV基因组的区域。这些Cap表达产物提供包装病毒基因组共同所需要的包装功能。 关于AAV cap编码区的描述，参见例如Muzyczka, N.和Kotin, R. M.(见上文)。通过在转染AAV表达载体前或同时用AAV辅助构建体转染宿主细胞来将AAV辅助功能导入宿主细胞中。因此，使用AAV辅助构建体来至少提供AAV r印和/或cap基因的瞬时表达以补充缺失的对生产性AAV感染所必需的AAV功能。AAV辅助构建体缺乏AAV ITR, 而且自身既不能复制也不能包装。这些构建体可以为质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒粒子的形式。已经描述了许多AAV辅助构建体，如通常使用的质粒pAAV/Ad和pIM29+45， 其编码Rep和Cap表达产物两者。参见例如Samulski等(1989) J. Virol. 63 =3822-3828 ； 及McCarty等(1991) J. Virol. 65 :2936_四45。已经描述了编码R印和/或Cap表达产物的许多其它载体。参见例如美国专利No. 5，139，941。可以构建AAV表达载体和AAV辅助构建体两者以含有一种或多种任选的选择标志。合适的标志物包括如下的基因，其在合适的选择性培养基中培养细胞时，对已经用含有选择标志的核酸构建体转染的那些细胞赋予抗生素抗性或敏感性，使那些细胞具有颜色，或者改变那些细胞的抗原性特征。可用于本发明实践的数种选择标志基因包括潮霉素 B抗性基因(编码氨基糖苷磷酸转移酶(APH))，其允许通过赋予对G418(可获自Sigma， St. Louis,Mo.)的抗性在哺乳动物细胞中选择。其它合适的标志物是本领域技术人员已知的。
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AAV辅佐功能还必须让宿主细胞(或包装细胞)能够提供非源自AAV的功能，或“辅佐功能”以产生rAAV病毒粒子。辅佐功能是AAV在其复制方面依赖的非源自AAV的病毒和/或细胞功能。因此，辅佐功能至少包括AAV复制中需要的那些非AAV蛋白和RNA，包括那些参与AAV 基因转录的活化、阶段特异性AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、Cap表达产物的合成和AAV衣壳装配的非AAV蛋白和RNA。基于病毒的辅佐功能可以源自任何已知的辅助病毒。特别地，可以使用本领域技术人员已知的方法来将辅佐功能导入宿主细胞中，然后在宿主细胞中表达。通常，通过用无关的辅助病毒感染宿主细胞来提供辅佐功能。许多合适的辅助病毒是已知的，包括腺病毒；疱疹病毒，如单纯疱疹病毒1和2型；和牛痘病毒。 非病毒辅佐功能也将在本文中得到应用，如通过使用多种已知试剂中的任何一种进行细胞同步化提供的辅佐功能。参见例如Buller等(1981) J. Virol 40 :241-247 ；McPherson等 (1985)Virology 147 :217-222 ；Schlehofer ^ (1986)Virology 152:110-117。或者，可以使用辅佐功能载体来提供辅佐功能。辅佐功能载体包括提供一种或多种辅佐功能的核苷酸序列。辅佐功能载体能够被导入合适的宿主细胞中，以支持宿主细胞中的有效的AAV病毒粒子产生。辅佐功能载体可以为质粒、噬菌体、转座子或粘粒形式。辅佐载体也可以为一种或多种线性化DNA或RNA片段形式，其在与合适的控制元件和酶结合时可以在宿主细胞中被转录或表达以提供辅佐功能。参见例如1997年3月15日公布的国际公开 No. WO 97/175480可以从天然来源(如腺病毒颗粒的基因组)获得，或者使用本领域中已知的重组或合成方法来构建提供辅佐功能的核酸序列。在这点上，源自腺病毒的辅佐功能已经得到广泛的研究，而且已经鉴别并部分表征了涉及辅佐功能的许多腺病毒基因。参见例如 Carter, B. J. (1990) "Adeno-Associated Virus Helper Functions,，，于 CRCHandbook of Parvoviruses,第 I 卷(P. Tijssen 编著),及 Muzyczka, N. (1992) Curr. Topics. Microbiol, and Immun. 158 :97-129。特别地，认为早期腺病毒基因区Ela、E2a、E4、VAI RNA和可能Elb 参与辅佐过程。Janik 等(1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 1925-1929。还已经描述了源自疱疹病毒的辅佐功能。参见例如^ung等(1979)Prog. Med. Virol. 25 :113。还已经描述了源自牛痘病毒的辅佐功能。参见例如Carter，B. J. (1990)，见上文，Schlehofer等(1986) Virologyl52 :110_117。由于用辅助病毒感染宿主细胞，或者用辅佐功能载体转染宿主细胞，所以表达反式激活AAV辅助构建体的辅佐功能以产生AAV Rep和/或Cap蛋白。R印表达产物从AAV 表达载体切割重组DNA(包括目的DNA)。R印蛋白还用来复制AAV基因组。表达的Cap蛋白装配成衣壳，并将重组AAV基因组包装到衣壳中。因此，接着发生生产性AAV复制，并且 DNA被包装到rAAV病毒粒子中。重组AAV复制后，可以使用多种常规的纯化方法，如CsCl梯度，来从宿主细胞纯化 rAAV病毒粒子。此外，若采用感染来表达辅佐功能，则可以使用已知的方法来将残留的辅助病毒灭活。例如，可以通过加热到约60°C的温度达例如20分钟或更长来使腺病毒灭活。 因为AAV是极端热稳定的，而辅助腺病毒是热不稳定的，所以此处理仅使辅助病毒有效地灭活。然后，将所得的rAAV病毒粒子准备好用于向CNS进行DNA递送。
对于体内递送，会将rAAV病毒粒子配制成药物组合物。治疗性核酸和编码的蛋白质治疗性核酸包括直接是治疗性的核酸及产生治疗剂(例如治疗性蛋白质)的核酸。治疗性蛋白质包括有生物活性的变异体和片段。如本文中所使用，术语“变异体” 包括其中已经从亲本蛋白质的氨基酸序列内的残基删除氨基酸(“缺失变异体”)，将氨基酸插入亲本的氨基酸序列内的残基中(“添加变异体”)，或者用氨基酸取代亲本蛋白质的氨基酸序列内的残基(“取代变异体”)的多肽。通过将合适的核苷酸变化引入编码多肽的 DNA中来制备此类变异体。本领域技术人员将显而易见的是，可以进行缺失、插入和取代的许多组合，条件是最终的分子是有生物学活性的。治疗性蛋白质包括但不限于酶；生长因子，包括神经营养因子；激素；免疫调节肽和蛋白质，包括细胞因子；和神经调节肽。在一个优选的实施方案中，本发明的治疗性蛋白质选自NGF、BDNF、NT-3、NT_4/5、 NT-6、GDNF、CNTF、LIF、IGF-l、b-FGF、neurturin、pers^)hin、artemin、TGFa 、TGF0 、IGF_2、 PDGF、EGF、向心素(cardiotropin)、EGF、IGF、VEGF、Sonic hedgehog (SHH)、BMP、FGF20、VIP、 PDGF、多效营养因子(PTN)、和HGF。在一个实施方案中，治疗性蛋白质能够在丘脑中生成，并在大脑皮质中释放。所使用的治疗性核酸的类型将取决于所治疗的神经障碍。哪些神经障碍适合于通过基于皮质病理学和神经解剖学连通性的本方法来治疗对于适度熟练技术人员将是显而易见的。例如，可以使用病毒颗粒来完成基因疗法，所述病毒颗粒提供神经障碍(例如，卡纳万病)中缺乏的酶的生成。或者，可以使用病毒颗粒来进行基因疗法，所述病毒颗粒提供神经营养因子(例如，NGF)的生成以在阿耳茨海默氏病中维持神经障碍中受损的神经元 (例如神经支配皮质的基底前脑神经元)群。可以在本发明中使用备选的治疗剂，包括但不限于SiRNA和其它用于基因沉默的手段。药物组合物和施用药物组合物将包含目标治疗剂的治疗有效量，即足以减轻或改善所讨论的病症的症状的量或足以赋予期望的益处的量。药物组合物还将含有药学上可接受的赋形剂。此类赋形剂包括自身不诱导对接受组合物的个体有害的抗体的生成，而且可以在没有过度毒性的情况下施用的任何药剂。药学可接受的赋形剂包括但不限于山梨糖醇、吐温80和液体， 如水、盐水、甘油和乙醇。人工CSF也可以在本方法中使用。其中可以包括药学可接受的盐，例如无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；和有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、 丙二酸盐、苯甲酸盐等。另外，辅助物质(如湿润剂或乳化剂)、PH缓冲物质等可以存在于此类媒介物中。关于药学上可接受的赋形剂的全面讨论在REMINGTON’ S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co.，N. J. 1991)中可获得。本领域技术人员将确定最佳的药物制剂。主治内科医生将考虑修改药物作用的各种因素来确定用于治疗上文所描述的疾患的方法中涉及的最终的剂量方案。随着研究进行，将出现关于治疗各种神经障碍的适当剂量水平的更多信息。
药物组合物可以包括其它药用剂、药剂、载体、佐剂、稀释剂等。“药学上可接受的” 意为不是生物学或其它方面不期望的材料，即，所述材料可以与选定的药剂一起对个体施用，而不引起任何不期望的生物效果或以有害的方式与含有其的药物组合物的任何其它组分相互作用。在一个优选的实施方案中，本发明的药物组合物可通过CED局部递送到受试者的 CNS 中。在一个实施方案中，药物组合物包括促进剂。促进剂能够进一步有助于将输注物递送到靶组织。当治疗剂是治疗性蛋白质时，促进剂是特别优选的。一旦已经配制出药物组合物，便可以将其作为溶液、悬浮液、凝胶、乳剂、固体或脱水或冻干粉末储存于无菌小瓶中。此类制剂可以以即用形式或需要在施用前重建的形式 (例如冻干)储存。考虑到本说明书的教导，本领域技术人员显而易见的是，可以凭经验确定必须添加的有效量的治疗剂。可以在整个治疗过程中连续地或间歇地以一剂实现施用。“有效量” 是足以实现有益的或期望的结果的量。有效量可以在一次或多次施用、应用或剂量中施用。在向丘脑递送的治疗剂是治疗性蛋白质的实施方案中，优选不止一剂。参见例如 2007年4月25日提交的USSN 11/740，124，其全文通过引用的方式并入本文。术语“受试者”、“个体”或“患者”在本文中可互换使用，并且指大型哺乳动物，优选的是灵长类动物，且最优选的是人，而且不包括小型哺乳动物，如啮齿类动物。设想联合疗法。例如，在涉及病毒载体的方法中，应当理解，可以通过递送的病毒载体表达不止一种转基因。或者，还可以将单独的载体(每种表达一种或多种不同转基因) 递送到CNS。此外，还设想通过本发明的方法递送的治疗剂(包括病毒载体)与其它合适的组合物和疗法组合。递送装置任何对流增强递送装置可以适用于递送治疗剂。在一个优选的实施方案中， 装置是渗透泵或输注泵。渗透泵和输注泵两者都可商购自多个供应商，例如Alzet Corporation，Hamilton Corporation，Alza，Inc.，Palo Alto，Calif·)。通常，经由 CED 装置如下递送治疗剂。将导管、插管或其它注射装置插入选定受试者的CNS组织中。考虑到本文中的教导，本领域的合理技术人员可以容易地确定适合于插入的坐标。可以以如下方式进行定位使用通过受试者脑的CT和/或MRI成像获得的解剖图来帮助将注射装置引导到选定的目标。或者，可以进行递送的iMRI和实时成像。
用于本发明的示例性泵系统包括美国专利No. 7，351，239 ；7, 341，577 ； 6，042，579 ；5, 735，815和4，692，147中所描述的可植入系统。PCT/US08/64011中描述了用于本发明的示例性导管。本文中描述了其它示例性导管。所有引文的全文通过弓丨用的方式明确地并入本文。实验丘脑内AAV2载体递送后的分布广泛的转基因蛋白质表达图1-4AAV2-GDNF驱动由经转导的神经元大量分泌胶质细胞源性神经营养因子(⑶NF)， 其可以通过免疫组织化学来视觉检测，并可通过组织提取物的ELISA来量化。通过对流增强递送将AAV2-GDNF输注到丘脑中后，在输注部位同侧的额皮质中检测出大量的GDNF免疫阳性染色。如图1中所示出，GDNF的表达从前额联合皮质区(皮质区9和10)延伸到额视区(区8)、前运动皮质(区6)、主要体觉皮质区(区3、1和2)到主要运动皮质(区4)，而且包括扣带回皮质(区23、24、32)和布罗卡区(区44、45)中的表达。将皮质中的⑶NF表达定位于灰质，其中下面的白质束中明显缺乏⑶NF阳性染色。在丘脑中发现相似的模式， 其中GDNF表达也包含在输注靶定的丘脑核的灰质边界内，没有输注相关的AAV2-GDNF载体 “泄露”或回流到非靶定区中的证据。在所分析的任何切片中发现对侧半球中没有GDNF染色。除个别神经元细胞体和细胞过程的强烈染色外，在额皮质的多层间观察到具有强度梯度的GDNF染色，所述强度梯度在皮质III和IV层中最高(图2)。大皮质区的宏观上明显的⑶NF染色与⑶NF阳性神经元纤维和细胞体的存在相关；然而，在用观察到的表明分泌GDNF的广泛的非细胞染色通过显微镜检查时，免疫染色的总体强度不反映特定区中的GDNF阳性神经元的真实数目。将皮质内的大多数GDNF阳性神经元在形态学上鉴别为位于具有向覆盖层中的轴突投射的皮质V/VI层中的锥体神经元 (图1E、F)。GDNF阳性神经元的密度在前皮质中是特别高的，所述前皮质包括前额皮质区 8，其中在II-IV层中观察到大量的非锥体神经元(图1A-C)。在AAV2-GDNF递送后6个月量化丘脑、纹状体和各个皮质区中存在的⑶NF蛋白水平。经载体输注的丘脑中的GDNF范围为每mg蛋白质12至40ng(对侧半球小于0. 6ng)， 而在同侧额皮质中范围为1至7ng(在对侧皮质中没有检测出GDNF)。图2中的数值表明 GDNF量化与相邻冠状组织块的GDNF免疫染色的近似相关性。AAV2载体的丘脑皮质运输和皮质神经元的转导利用AAV2-GFP递送后在经转导的细胞中的绿色荧光蛋白(GFP)的胞质表达和积累来评估在NHP中的丘脑输注后经转导的神经元的定位。在丘脑和额皮质两者中分析GFP 表达以调查丘脑中的AAV2载体分布与表明AAV2载体的丘脑皮质轴突运输的特定皮质区域中的神经元的转导之间的相关性。在4只NHP(ID号V422、V632、V655和V991)中就含有GFP免疫阳性神经元的特定丘脑核而言评估丘脑内的AAV2-GFP输注的分布。由于插管定位的差异小，每只动物在GFP 染色的丘脑分布上显示一些差异(图4)。总之，丘脑内的AAV2-GFP转导在猴V422中最广泛，其中GFP表达遍及腹外侧核、腹前核和内侧背核，以喙状突起的方式延伸到前核中。猴 V632显示更多的后部输注，其中GFP阳性神经元从腹前核延伸到腹后核。猴V655具有受限的GFP阳性神经元分布，主要包含在内侧背核和腹外侧核内。猴V991接受稍多的AAV2-GFP 外侧输注，这导致腹外侧核和腹前核的转导，其中还在内囊中观察到GFP表达。在V655和 V991中发现载体泄露/回流退回插管束进入侧脑室中的证据，而在另两只动物中没有发现。此回流导致丘脑中更小的转导区。对额皮质进行免疫组织化学分析以分析其中GFP阳性神经元细胞体和过程明显可区分的额皮质的特定区域(图3A，B)。将大多数GFP阳性神经元鉴别为位于V/VI层中的锥体神经元。然而，发现更小的数目的其它GFP阳性细胞，其具有篮神经元和神经胶质的形态(图3E，F)。另外，我们还观察到其中GFP染色被定位到IV层中的纤维的区域(图3C， D)。与经AAV2-GDNF治疗的猴形成对比，所有转基因蛋白质(GFP)染色明显定位于神经元结构，这表明与⑶NF的分泌和胞外扩散相比，GFP特别在神经元内胞内积累。
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来自4只猴的经GFP免疫染色的冠状切片的系统扫描鉴别额皮质中含有GFP阳性神经元的特定区域。关于丘脑神经元的AAV-GFP转导，皮质中的GFP阳性细胞分布对于每只猴略有不同(表1)。其中一致地发现大多数GFP阳性神经元的主要区域是次级运动皮质 (区6)和额视区(区8)。在每只动物中，前扣带回皮质(区M和32)也含有GFP阳性神经元。另外，还在其它皮质区，包括主要运动皮质(区4)、体觉皮质(区3和幻、后扣带回皮质(区23和31)和布罗卡区(区44和45)中发现GFP阳性神经元。如表1中所概括， 猴V422在额视区和布罗卡区中具有相当的GFP阳性神经元分布。猴V632是在主要体觉皮质中具有GFP表达，但是在布罗卡区中缺乏任何表达的唯一的动物。猴V655在所分析的大多数皮质区间表现出分散的GFP阳性皮质神经元分布。猴V991具有受限的表达，其中仅在前扣带回皮质、次级运动皮质和额视区中发现GFP阳性神经元。未曾在输注部位对侧的半球中观察到GFP阳性细胞。⑶NF从皮质易位到三级CNS位点基底前脑使用本文中所描述的方法进行AAV2-GDNF递送6个月后量化基底前脑中存在的 ⑶NF蛋白水平。受试者是图2中呈现的受试者。结果是经处理侧=0.91ng⑶NF/mg蛋白质；对侧=0. 45ng⑶NF/mg蛋白质。结果确定经由丘脑递送到皮质群的治疗剂可以运输到与皮质连接的三级神经元群。在阿耳茨海默氏病的非人灵长类动物模型中在丘脑皮质基因递送之后通过从皮质的运输向基底前脑递送NGF制备包含编码NGF的治疗性核酸的AAV2颗粒。将AAV2颗粒递送到老年非人灵长类动物(为阿耳茨海默氏病的本领域公认的模型)的丘脑。参见例如等， "Aged non-human primates -.an animal model of age-associated neurodegenerative disease”，Brain Pathol.，1 =287-296,1991 优选地，将AAV2递送到前核、内侧背核、腹前核、腹外侧核和腹后核中的一种或多种，其中腹核是优选的。AAV2颗粒转导丘脑神经元，而 NGF被易位到皮质。AAV2颗粒也易位到皮质，包括扣回带皮质，转导其中的神经元，并在皮质中生成NGF。NGF和/或AAV2颗粒从皮质易位到基底前脑，并支持其中的神经元的存活和/或胆碱能表型。在阿耳茨海默氏病中在丘脑皮质基因递送之后通过从皮质的运输向基底前脑递送NGF制备包含编码NGF的治疗性核酸的AAV2颗粒。将AAV2颗粒递送到阿耳茨海默氏病患者的丘脑，优选地递送到前核、内侧背核、腹前核、腹外侧核和腹后核中的一种或多种， 其中腹核是优选的。AAV2颗粒转导丘脑神经元，而NGF被易位到皮质。AAV2颗粒也易位到皮质，包括扣回带皮质，转导其中的神经元，并在皮质中生成NGF。NGF和/或AAV2颗粒从皮质易位到基底前脑，并支持其中的神经元的存活和/或胆碱能表型。通过此方法，将NGF形式的营养支持经由其生理目标(即，皮质)递送到基底前脑。对皮质的天然基底前脑神经支配得到加强(例如，可以提高出芽)而不是转移，因为它可以是通过来自辅助非生理部位的神经营养供应，而且支持存活和/或胆碱能表型。讨论我们将AAV2-GDNF输注到丘脑中，并且在额皮质中观察到高浓度的⑶NF。皮质中的GDNF似乎很大程度上定位于其中已知大多数丘脑皮质轴突受神经支配的板层III和IV，这表明自丘脑末端的分泌。除胞外GDNF染色外，相同皮质区内的许多板层V/VI锥体神经元也含有⑶NF，这表明皮质神经元被AAV2-GDNF转导。额皮质中的许多⑶NF阳性神经元位于离AAV2-GDNF输注部位超过20mm，即比仅通过载体输注可解释的距离显著更大的距离。由于皮质和丘脑外部没有检测出显著的⑶NF表达，丘脑和皮质间的此特定运输表明⑶NF蛋白和AAV2载体两者的轴突介导的运输。因为与⑶NF不同，GFP保持为细胞质的，并且因此表明直接的细胞转导，所以用 AAV2-GFP进一步研究AAV2的轴突运输。皮质神经元的⑶NF胞质染色在理论上是由摄取分泌的GDNF造成。通过绘制每只猴的额皮质中的GFP阳性神经元的定位并分析皮质细胞的此转导连同对每次输注观察到的AAV2-GFP载体的丘脑分布，我们能够推断丘脑皮质投射的一些已知的构造组织(5，6)，这表明AAV2载体沿着单一轴突投射的主动运输。在大多数受限的丘脑输注中，GFP很大程度上包含在背内侧和腹外侧丘脑核的神经元内。因此，用此受限的输注作为起始参照，假设位于每个受试者的次级运动皮质和前额皮质中的GFP阳性神经元至少部分源自沿着连接内侧丘脑核和次级运动皮质的轴突投射的AAV2载体运输。先前已经显示了内侧核群的神经元将传出投射发送到额皮质，这与这些目前的观察结果(3， 7) 一致。转导腹前和腹外侧丘脑核的略多的前输注导致与内侧丘脑输注非常相似的皮质 GFP表达模式，其中在次级运动皮质、扣带回皮质和额视区中观察到的GFP阳性细胞。虽然丘脑皮质投射是非常有构造组织的，但是在尤其来自相邻丘脑结构的皮质连接上有相当的重叠。AAV2-GFP转导传播到前丘脑核在布罗卡区中产生GFP阳性神经元，而向腹后核的更多尾侧传播导致主要体觉皮质和主要运动皮质中出现GFP阳性神经元。丘脑皮质投射的构造组织与观察到的皮质转导区之间的相关性表明通过顺向轴突运输介导AAV2向皮质的转移。最近在小鼠脑中观察到其它AVV血清型1和9的可能的顺向运输(12)。然而，交互投射和小鼠脑的小尺寸阻止运输机制的结论性确定。方法和材料-图1-4手术递送通过我们先前已经描述的对流增强递送(CED)方案(1 将含有在巨细胞病毒启动子控制下的人⑶NF cDNA (AAV2-⑶NF)或GFPcDNA (AAV2-GFP)的重组AAV2载体输注到6只成年猕猴的右丘脑中。根据国立健康研究所指南(National Institutes of Health guidelines)和经加利福尼亚大学旧金山分校的机构动物护理和使用委员会 (Institutional Animal Care and Use Committee at the University of California San Francisco)批准的方案进行所有实验。AAV的制备通过三重转染技术(14，15)来构建重组AAV2_GDNF(人神经胶质源性神经营养因子)。在具有重组杆状病毒的昆虫细胞中生成AAV2-GFP(16)。对这两种载体进行CsCl梯度离心以除去空的衣壳。以每ml磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)和Pluronic F-68 (0. 001% ν/ ν)为1. OX IO13和1. 1 X IO13个载体基因组的储液浓度获得AAV2-GFP和AAV2-GDNF。免疫组织化学对经Zamboni 固定的 40 μ m 冠状切片用针对 GDNF (1 500，AF-212-NA，R&D Systems)和GFP(1 500，AB3080，Chemicon)的抗体进行免疫染色，所述冠状切片涵盖整个额皮质，而且以后部方向延伸到丘脑水平。通过参考！"he Rhesus Monkey Brain inStereotacticCoordinates (17)来分析⑶NF和GFP免疫阳性神经元的定位以鉴别皮质和丘脑中的特定的免疫染色区。⑶NF蛋白ELISA如图1中示出的相邻组织块的经⑶NF免疫染色的切片上所指示，从经AAV2-GDNF 输注的猴的多个皮质、丘脑和纹状体区采集来自新鲜冷冻组织的3mm冠状块的组织环切样本。通过用对人GDNF特异的市售GDNF ELISA试剂盒(Emax⑶NF ELISA, Promega, WI)进行的ELISA测定来量化所表达的⑶NF蛋白水平。表1皮质中的GFP阳性神经元的相对分布
权利要求
1.一种对有需要的患者治疗皮质神经障碍的方法，包括通过对流增强递送(CED)将治疗剂递送到丘脑。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗剂是包含编码治疗性蛋白质的核酸的病毒颗粒。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述病毒颗粒是AAV颗粒。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述AAV颗粒选自AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、 AAV7.AAV8 禾口 AAV9。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗剂是蛋白质。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述皮质神经障碍选自创伤性脑损伤、中风、酶功能障碍病症、精神疾病、神经退行性疾病、癫痫和认知障碍。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述皮质神经障碍涉及至少第一和第二皮质神经元群，它们分别由起源于第一和第二丘脑核的丘脑皮质投射支配，其中所述丘脑核是不同的。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述皮质神经障碍涉及所述大脑皮质的不止一个功能区。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述皮质神经障碍涉及所述大脑皮质的不止一个叶。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述皮质神经障碍涉及与所述皮质连接的三级神经元群。
11.根据权利要求1所述的方法，其中将所述治疗剂递送到所述丘脑中的不止一处位置。
12.根据权利要求11所述的方法，其中使用不止一个插管来递送所述治疗剂。
13.根据权利要求1所述的方法，包括反复递送所述治疗剂。
14.根据权利要求11所述的方法，包括将所述治疗剂在两侧递送到所述丘脑。
15.根据权利要求14所述的方法，包括将所述治疗剂在两侧递送到相应的丘脑核。
16.根据权利要求2所述的方法，其中递送后在所述脑中产生所述治疗性蛋白质达至少六个月。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述CED包括步进(st印ping)。
18.根据权利要求1所述的方法，进一步包括示踪剂的CED。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述示踪剂是MRI对比增强剂。
20.根据权利要求19所述的方法，进一步包括通过MRI对所述MRI对比增强剂的组织分布进行实时监测。
21.一种将治疗剂递送到灵长类动物的皮质的方法，包括通过CED将治疗剂递送到丘脑。
22.根据权利要求21所述的方法，其中将所述治疗剂递送到所述丘脑中的不止一处位置。
23.根据权利要求22所述的方法，其中使用不止一个插管来递送所述治疗剂。
24.根据权利要求21所述的方法，包括反复递送所述治疗剂。
25.根据权利要求21所述的方法，其中将所述治疗剂递送到所述大脑皮质的不止一个功能区。
26.根据权利要求21所述的方法，其中将所述治疗剂递送到所述大脑皮质的不止一个叶。
27.根据权利要求21所述的方法，其中所述治疗剂是包含编码治疗性蛋白质的核酸的病毒颗粒。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述病毒颗粒是AAV颗粒。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述AAV颗粒选自AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、 AAV6、AAV7、AAV8 和 AAV9。
30.根据权利要求21所述的方法，其中所述治疗剂是蛋白质。
全文摘要
本发明提供治疗神经障碍的方法，涉及通过对流增强递送来对丘脑施用治疗剂。
文档编号C12N15/864GK102369024SQ201080010954
公开日2012年3月7日 申请日期2010年1月29日 优先权日2009年1月29日
发明者A·P·克尔斯, K·班基维兹 申请人:加利福尼亚大学董事会