专利名称：用于制备hpv疫苗和由其转化的重组乳酸菌的稳定组成型高表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于制备HPV治疗性疫苗的表面表达载体，其中所述表面表达载体含有编码具有氨基酸序列SEQ ID NO :1的r印E突变蛋白的基因、启动子、聚-γ-谷氨酸合成酶复合基因、以及与该聚-Y -谷氨酸合成酶复合基因连接的基因，其编码与人类乳头瘤病毒的肿瘤诱导相关的抗原蛋白。
背景技术：
已知，用于表达大量外源蛋白质的有用外源蛋白质的产生取决于基因的拷贝数， 即质粒的数量，以及用于控制转录的启动子强度。据报道，除了常规频繁使用的高表达启动子之外，可以通过改变单个细菌内质粒载体的数量来提高靶蛋白的表达(Tomio，Μ.等， Appl. Microbiol. Biotechnol. , 28:170,1988)。同样，据报道在微型 F 质粒中的 R印E 突变体能够改变单个细菌内的25个质粒(Yasuo，K.等，J. Biol. Chem. , 267:11520， 1992)。据估计，人类乳头瘤病毒(HPV)感染了全世界50%以上的成年人。特别是，据报道， 包括HPV16、18、31和45四种类型的HPV引发了 80%以上的宫颈癌病例(Lowy，D. R.等， Proc. Nat. Acad. Sci. , 91 :2436,1994)0宫颈癌是仅次于乳腺癌的第二大最常见女性疾病，根据WHO (世界卫生组织)的估计，全世界每年新发生的宫颈癌病例超过500，000件，而且全世界每年有300，000名以上的患者死于宫颈癌。尤其在发展中国家，宫颈癌更是女性的头号杀手(Pisani，P.等，Int. J. Cancer, 55:891，1993)。IARC报道显示，发展中国家慢性HPV感染患者的数量明显高于发达国家，根除HPV感染的最有效的手段是施用HPV预防性疫苗。与宫颈癌相关的疫苗的开发集中于预防性疫苗和治疗性疫苗两类上。该预防性疫苗旨在通过HPV L1/L2抗原产生较强的中和抗体，从而防止宿主感染HPV，并且即使在已经被感染的情况下防止病情恶化。另一方面，该治疗性疫苗针对HPV E6/E7，旨在诱导对退化形成的病变或恶性肿瘤发生特异性细胞免疫应答。因为HPV E6/E7蛋白是与HPV感染细胞的致癌作用有关的癌症特异性抗原，已经将E6/E7蛋白在宫颈癌的免疫治疗中的用途作为靶标持续的进行了研究。实际上，已有报道称，当对注射过肿瘤细胞的鼠施用在微生物系统中合成的HPV E6/E7蛋白时，其抑制或延迟肿瘤的形成(Gao，L.等，J. Gen. Viol.，75:157，1994，Meneguzzi, G.等， Virology, 181:62，1991 )。然而，与其他情况相似，在使用活病毒疫苗的实例中，可能产生与过量病毒复制有关的问题。因此，在许多情况下，只将活病毒疫苗用于研究目的，其缺陷在于，需要花费很长的时间才能将其商业化并且需要大量的临床试验。与此同时，也在积极进行包括细菌载体的疫苗的开发研究，而且已有报道称，在稀释的鼠伤寒沙门菌中合成的HPV 16 VLP在鼠的粘膜内或整个身体内诱导抗原特异性抗体的产生(Denis, N.等，Infection and immunity, 65 :3328, 1997)。至于由合成肽组成的疫苗，只合成用来诱导免疫应答的表位来用于疫苗接种，并且已经对引发细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对HPV 16 E6/E7应答的表位进行了说明(Ressing，Μ. Ε.等，J. Immunol., 154 :5934, 1995)。除了这种尝试之外，正在进行对使用转基因蔬菜本身(从包括西红柿和土豆的蔬菜中获得)作为口服疫苗或可食用疫苗，以在植物中产生病毒抗原的研究。其典型的实施例包括乙肝肝炎表面抗原颗粒(ThavalEi, Y. F.和 Artzen, C. J. , Pro. Natl. Acad. Sci. USA.， 92 :3358, 1995)和乳头瘤病毒的衣壳蛋白Ll和L2 (韩国专利注册号0366608)。然而，由于HPV Ll蛋白表达量少而且存在有关纯化的问题，使该植物系统在商业应用方面受限。因此，鉴于HPV受感染人群主要集中在发展中国家的事实，急需开发一种以更为经济和稳定的方式来制备HPV抗原的方法，以预防和治疗源自口腔龋齿或生殖器的皮肤黏膜内的乳头瘤病毒的肿瘤。本发明的发明人之前开发过用于在转化的重组微生物表面上有效表达HPV抗原蛋白的载体，以及在该微生物表面上表达HPV抗原蛋白的方法(韩国专利注册号0609866)。因此，本发明的发明人进行大量的努力开发了下述载体，其能够在转化的重组乳酸菌表面上更稳定地和组成型地高水平表达HPV抗原蛋白，并由此发现在用含有MpE突变基因的载体转化的重组微生物中，更稳定地高水平表达HPV抗原蛋白，从而完成本发明。
发明内容
本发明的主要目的在于提供载体，其通过使用MpE突变基因，能够在转化的重组乳酸菌表面上稳定和组成型地高水平表达HPV抗原蛋白。本发明的另一目的在于提供用所述表达载体转化的重组乳酸菌和使用所述乳酸菌制备HPV抗原蛋白的方法。本发明还一目的在于提供治疗宫颈癌的疫苗，其包含所述转化的重组乳酸菌。为了达到以上目的，本发明提供了表面表达载体，其含有具有氨基酸序列SEQ ID NO :1的MpE突变基因、启动子、聚-Y -谷氨酸合成酶复合基因、以及与该聚-Y -谷氨酸合成酶复合基因连接的基因，其编码人类乳头瘤病毒的肿瘤诱导相关抗原蛋白。本发明还提供了用所述载体转化的重组微生物。本发明还提供了用于治疗宫颈癌的疫苗，其含有作为活性成分的具有在其表面表达的HPV抗原蛋白的重组微生物。本发明还提供了制备微生物的方法，所述微生物具有在其表面表达的HPV抗原， 该方法包含以下步骤培养用所述载体转化的重组微生物以在该微生物表面表达HPV抗原，收集具有在其表面表达的HPV抗原的重组微生物。本发明还提供了治疗宫颈癌的疫苗，其含有，作为活性成分的通过所述方法制备的并且具有在其表面表达的HPV抗原的微生物。
图1示出了引入MpE突变基因的pKV-Pald-PgsA-淀粉酶载体的酶切图。图2示出了在微生物表面表达E7基因的两种表达载体的酶切图。
图3示出了用pKV-Pald-PgsA-E7转化的乳酸菌表面上的E7的表达进行蛋白质印迹分析的结果。图4示出了一个计划表，用于对鼠施用乳酸菌以检验在其表面上表达E7转化的重组乳酸菌的免疫应答诱导能力。图5示出了通过口服施用在其表面上表达E7转化的重组乳酸菌，在IgG和IgA中的变化。图6示出了通过口服施用在其表面上表达E7转化的重组乳酸菌，E7特异性 IFN-Y分泌的分析结果。图7示出了通过口服施用在其表面上表达E7转化的重组乳酸菌并确定肿瘤尺寸是否增加来进行肿瘤攻击试验的结果。图8示出了在微生物表面上表达E7 (Rb)基因的表达载体的酶切图。图9示出了用pKV-Pald-PgsA-E7 (Rb)转化的重组乳酸菌表面上E7 (Rb)表达的分析结果。图10示出了 E7特异性酶联免疫吸附试验(ELISA)的结果。图11示出了通过口服施用在其表面上表达E7 (Rb)转化的重组乳酸菌，E7 (Rb) 特异性IFN-γ分泌的分析结果。
具体实施例方式一方面，本发明针对表面表达载体，其含有具有氨基酸序列SEQ ID NO 1的MpE 突变基因、启动子、聚-Y -谷氨酸合成酶复合基因和与该聚-Y -谷氨酸合成酶复合基因连接的基因，其编码人类乳头瘤病毒的肿瘤诱导相关抗原蛋白。在本发明中，将具有氨基酸序列SEQ ID NO=I的MpE突变基因，与来自干酪乳杆菌的醛缩酶基因的醛缩酶启动子(Paid) —起引入到转化的微生物中，该突变基因可以在转化的微生物中稳定存在。结果观察到，在该微生物中的靶蛋白表达提高。为了确定本发明的穿梭载体在重组微生物中稳定存在，并确定靶蛋白在重组微生物中表达，将淀粉酶基因作为靶基因引入到重组微生物中，并且分析该淀粉酶在该重组微生物中的表达。此外，定位作为表面锚定基元的聚-Y -谷氨酸合成酶复合基因以使其在与靶蛋白连接的状态下表达，以用于靶蛋白的表面表达。在此，该聚-Y -谷氨酸合成酶复合基因优选地是pgsBCA，更优选地是pgsA (韩国专利注册号469800)。在本发明的一实施例中，将HPV16 E7编码基因与pgsA融合，以使HPV16 E7蛋白作为靶蛋白与I^gsA的C端末端融合，从而制备能够在乳酸菌的表面上组成型地表达HPV抗原蛋白的pKV-Pald-PgsA-E7载体。此外，将该表达载体插入到干酪乳杆菌中，从而制备表达HPV抗原蛋白的转化的重组乳酸菌。如本发明所使用的，术语“靶蛋白，，或“外源蛋白，，是指在表达该蛋白的转化的宿主细胞中通常不能被发现的蛋白。例如，当进行操作使来源于病毒或来源于肿瘤的蛋白在乳酸菌中人工表达时，该蛋白被称为外源蛋白或靶蛋白。另一方面，本发明还针对用所述载体转化的重组微生物，该重组微生物在其表面上表达HPV抗原蛋白，本发明还针对治疗宫颈癌的疫苗，其包含转化的重组微生物作为活性成分。
如本发明所使用的，术语“宿主”或“微生物”是指益生的革兰氏阳性细菌的乳酸菌，用于筛选益生的微生物的普遍标准包括以下几个方面(i)来自人类的微生物；(ii) 对胆汁、酸、酶和氧具有稳定性；(iii)能够粘附在肠粘膜；(iv)在人类胃肠道内具有生存 (colonization)潜力；(ν)产生抗菌物质；以及(vi)具有可证实的功效和安全性。基于这种标准，显而易见的是乳酸菌与人体友好且对人体无害。因此，当将使用乳酸菌作为宿主的转化体应用于人体上以递送基因或蛋白质来预防或治疗疾病时，与制备菌株的疫苗的常规方法不同，其不需要清除菌株的步骤。在本发明中，作为宿主使用的乳酸菌包括乳酸杆菌属、链球菌属和双歧杆菌属。典型地，所述乳酸杆菌属包括嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌、德氏乳杆菌、约氏乳杆菌LJI、罗伊氏乳杆菌和保加利亚乳杆菌；所述链球菌属包括嗜热链球菌，所述双歧杆菌属包括婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌、长双歧杆菌、假长鞭双歧杆菌、短双歧杆菌、乳双歧杆菌恥-12和青春双歧杆菌。优选地，将乳酸杆菌属作为宿主使用。另一方面，本发明针对一种方法，其用于制备具有在其表面上表达的HPV抗原的微生物，该方法包含以下步骤培养用所述载体转化的重组微生物以在该微生物表面上表达HPV抗原；并收集具有在其表面上表达的HPV抗原的该重组微生物。根据本发明，可以根据本领域内众所周知的方法和培养条件，其包括可以适当控制的培养温度和时间以及培养基的PH值，来培养重组微生物。使用常规分离技术，例如离心或过滤，可实现对来自培养基的重组微生物细胞的收集。另一方面，本发明针对一种治疗宫颈癌的疫苗，其包含通过所述方法制备的并具有在其表面表达的HPV抗原的微生物作为活性成分。此外，本发明针对一种用于治疗宫颈癌的口服性疫苗。疫苗是使用活生物体来刺激免疫系统以达到预防疾病目的的药物。免疫活化是指通过在生物体内产生抗体、刺激T淋巴细胞或刺激其他免疫细胞(比如巨噬细胞)来有效地清除抗原的过程。本领域技术人员很容易理解与这些细节有关的免疫学详细概要 (Barrett, J. Τ.，Textbook of Immunology, 1983)。可以对哺乳动物和更优选地人类施用转化的微生物疫苗，其表达作为抗原的靶蛋白。可以使用标准技术制备疫苗组合物。适于施用的剂量随着基因产物的抗原性而改变，并且其可以达到的量可使疫苗能够充分诱导典型的免疫应答。可以通过惯常的实验程序容易地测定该剂量。疫苗的典型初始剂量为0.001至1 mg抗原/kg重量。如有必要，可以增加剂量来提供优选的保护水平，或以多重剂量的使用该疫苗。本领域技术人员能够测定该剂量，并且可以随配制方法、施用类型、患者年龄、体重、性别、病情严重程度、饮食、施用频率、施用途径、排泄率和应答敏感度而改变。本发明的用于制备编码HPV抗原蛋白E7的HPV疫苗的表面表达载体的最优选实施方案是一种表面表达载体，其包含编码具有氨基酸序列SEQ ID NO 1的MpE突变蛋白的基因、来自乳酸菌的醛缩酶启动子、选自用于表面表达的/7^si 、/7^sC和/^d的聚-Y -谷氨酸合成酶复合基因和与该聚-Y -谷氨酸合成酶复合基因连接的基因，其编码人类乳头瘤病毒的肿瘤诱导相关抗原蛋白E7。可以培养用该载体转化的重组乳酸菌来在其表面上表达HPV抗原蛋白E7，然后将其作为疫苗直接使用。本发明的用于制备编码HPV抗原蛋白E7 (Rb)的HPV疫苗的表面表达载体的最优选实施方案是一种表面表达载体，其包含编码具有氨基酸序列SEQ ID NO 1的MpE突变蛋白的基因、来自乳酸菌的醛缩酶启动子、选自用于表面表达的和/ ^的聚-Y-谷氨酸合成酶复合基因和与该聚-Y -谷氨酸合成酶复合基因连接的基因编码，其编码人类乳头瘤病毒的肿瘤诱导相关抗原蛋白E7 (Rb)。可以培养用该载体转化的重组乳酸菌来在其表面上表达HPV抗原蛋白E7 (Rb)，然后将其作为疫苗直接使用。为了使疫苗在产生抗体中有效，必须在体内释放抗原性物质，以使接种疫苗的个体的抗体产生机制开始起作用。因此，必须将基因产物的微生物载体优选引入到体内以用于免疫应答。为了通过存在于本发明的转化的重组乳酸菌内的抗原来刺激优选的应答，优选地口服施用该疫苗或直接将其以喷洒的形式向子宫颈施用。为了给受试者口服施用该疫苗组合物，优选地以亲液的形式提供该疫苗组合物， 例如胶囊的形式。以肠溶包衣的形式提供该胶囊，其含有丙烯酸树脂S、丙烯酸树脂L、乙酰纤维素、纤维素邻苯二甲酸或羟脯氨酰甲基纤维素。可以将该胶囊以其在诸如悬浮液的亲液材料中重构之后形成的可以施用的形式或当胶囊使用。优选地在具有适于该转化的重组微生物生存的PH值的缓冲液中进行该重构。为了保护该转化的重组微生物和疫苗不受胃酸侵害，优选在每次施用疫苗前先施用碳酸氢盐制剂。可以选择制备用于肠胃外投药、鼻内施用或乳房内施用的疫苗。
具体实施例以下，将参照实施例对本发明作进一步详述。对本领域普通技术人员显而易见的是，这些实施例只用于说明目的，而不能被理解为限制本发明的范围，也就是说以下步骤将作为说明性步骤进行描述，而不限制本发明的范围。实施例1 含有repE突变基因的表面表达载体(pKV-Pald-PgsAL-淀粉酶)的制备在该实施例中，为了在宿主细胞内稳定表达载体，构建了包含MPE突变基因并显示出
提高的靶蛋白表达水平的表面表达载体。首先，为了在乳酸菌中进一步提高靶蛋白的表达，获得了来自干酪乳杆菌的醛缩酶启动子的片段。使用PDT-PgsA-淀粉酶(在韩国专利
发明者夫厦玲, 成文喜, 李日汉 申请人:国民大学校产学合作团, 生物领先公司, 韩国生命工学研究院