一种用于混凝土裂缝自修复的矿化微生物的筛选方法

一种用于混凝土裂缝自修复的矿化微生物的筛选方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于混凝土裂缝自修复的矿化微生物的筛选方法，包括以下步骤：对菌株进行活化及培养，制成细胞悬浮液；对细胞悬浮液进行紫外诱变后加入碱性培养基中进行培养；将获得的培养液稀释成不同的浓度后在不同的平板上分别进行培养；随机挑取复数个单菌落分别保存于装有固体培养基的微孔板的孔中倒置培养；将微孔板中的菌落接种于装有发酵培养基的深孔板对应的孔中静置培养；将深孔板放置于深孔板离心机中分离出上清液作为待测样品；测定样品中的钙离子浓度和钙矿化率，筛选出优良菌株。本发明的筛选方法具有微量化、小型化和平行化的特点，可以同时处理大量样品，节省人力、物力及时间，大幅提高筛选效率。
【专利说明】一种用于混凝土裂缝自修复的矿化微生物的筛选方法[【技术领域】]
[0001]本发明涉及微生物育种，尤其涉及一种用于混凝土裂缝自修复的矿化微生物的筛选方法。
[【背景技术】]
[0002]混凝土结构的开裂不仅危害建筑材料的完整性，导致承载力和耐久性降低，而且可能导致重大安全事故和人员伤亡。目前，混凝土裂缝的检查和修复主要依赖人工操作，这种方法不仅成效有限而且耗资巨大，相比之下，混凝土自修复是一种更具可持续性和相对低成本的修复方法，近年来成为土木工程领域的研究热点。混凝土自修复又分为物理自修复、化学自修复和微生物自修复。其中微生物自修复是指掺入混凝土中的矿化微生物在裂缝形成后诱导矿化沉积作用产生碳酸钙以达到自动修复裂缝的目的。相对于传统修复加固材料，微生物矿化沉积材料反应条件温和、负面效应弱且相容性好，不会对结构及环境造成不可逆反应，对生态平衡有积极作用。
[0003]具有碳酸钙沉积活性的菌株几乎涵盖了各个微生物类群，用于混凝土自修复的微生物主要是芽孢杆菌属的某些种类，其中，厌氧菌如巴氏芽孢杆菌主要利用脲酶作用分解尿素产生二氧化碳，而好氧菌如科氏芽孢杆菌、假坚强芽孢杆菌等主要利用呼吸作用产生二氧化碳，二氧化碳在高碱环境下迅速转化为碳酸根，达到一定浓度后与钙离子反应形成碳酸钙，晶体逐渐长大，直到堵塞裂缝。然而，这些菌株在自修复混凝土实际应用中的效果却差强人意，其主要原因在于微生物对混凝土内高碱环境的适应能力和碳酸钙沉积活性的双重不足。
[0004]高效矿化菌种是混凝土微生物自修复的基础。在建立简便准确的菌株活性评价方法的基础上从自然界筛选或对现有菌株进行遗传物质改造一直是获得优良菌种的重要途径。
[0005]传统矿化微生物筛选方法一般以250ml三角瓶作为发酵容器，每瓶装培养液50ml，每个样品需要3-4ml显色液；传统方法以单通道移液器进行接种取样稀释等操作；传统方法以分光光度计作为检测仪器，每个样品需要50 μ L左右发酵液，3000 μ L显色应用液，每I个样品的检测需要IOs左右；因此，常规的筛选方法工作量大、效率低而且成本高昂。
[
【发明内容】
]
[0006]本发明要解决的技术问题是提供一种工作量小、效率高而且成本低廉的用于混凝土裂缝自修复的矿化微生物的筛选方法。
[0007]为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，一种用于混凝土裂缝自修复的矿化微生物的筛选方法，包括以下步骤:
[0008]101)对菌株进行活化及培养，制成细胞悬浮液；
[0009]102)对细胞悬浮液进行紫外诱变后加入碱性培养基中进行培养；[0010]103)将步骤102中获得的培养液稀释成不同的浓度后在不同的平板上分别进行培养；随机挑取复数个单菌落分别保存于装有固体培养基的微孔板的孔中倒置培养；
[0011]104)将微孔板中的菌落接种于装有发酵培养基的深孔板对应的孔中静置培养；
[0012]105)将深孔板放置于深孔板离心机中分离出上清液作为待测样品；
[0013]106)测定样品中的钙离子浓度和钙矿化率，筛选出优良菌株。
[0014]以上所述的筛选方法，步骤101包括将菌株在琼脂平板上划线活化，28°C -32°C培养20-28小时，取单菌落点接种于新的琼脂平板，28°C _32°C培养10_14h后用90_110mM的碳酸钠缓冲液洗下菌苔制成细胞悬液。
[0015]以上所述的筛选方法，步骤102包括将细胞悬浮液和磁力搅拌器的转子置于培养皿中，将培养皿置于磁力搅拌器上，开动磁力搅拌器，用紫外灯照射10-20min后,将细胞悬液加入到碱性培养基中培养5-6h ;步骤103包括将培养液的浓度按一定的梯度稀释，将定量的不同浓度的稀释液涂布于碱性琼脂平板，每个梯度涂布复数个平板，28°C _32°C培养2-4天，挑取复数个单菌落，保存于装有碱性固体培养基的微孔板的孔中，28°C _32°C、倒置培养 24-48h。
[0016]以上所述的筛选方法，步骤104包括将微孔板中的菌落用多通道移液器对应的接种于装有发酵培养基的深孔板I对应的孔中，于28°c -32°c静置培养36-60h ;将深孔板I中的发酵液对应地接种到装有发酵培养基的深孔板II对应的孔中，于28°C -32°C静置培养
6-8天；将深孔板II放置于深孔板离心机中离心得到的上清液即为待测样品。
[0017]以上所述的筛选方法，步骤105包括以微量化稀释法将待测样品稀释3-5倍，在透明微孔板中加入钙离子显色应用液，加入待测样品混匀，避光反应5-15min;反应结束后，采用酶标仪测定显色反应液的吸光度，根据标准曲线和待测样品稀释倍数计算待测样品中钙离子浓度和钙矿化率。
[0018]以上所述的筛选方法，碱性培养基的组分和制备方法如下，酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，碳酸钠10g/L ;按以上浓度称量酵母粉和胰蛋白胨溶解于900ml水中，称量碳酸钠溶解于100ml水中，两种溶液灭菌后混匀；碱性固体培养基的组分和制备方法如下:酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，碳酸钠10g/L，琼脂粉15g ;按以上浓度称量酵母粉、胰蛋白胨和琼脂粉溶解于900ml水中；称量碳酸钠溶解于100ml水中,两种溶液灭菌后混匀。
[0019]以上所述的筛选方法，发酵培养基的组分和制备方法如下:L_乳酸钠5-10g/L,硝酸钠 l_2g/L，酵母粉 0.5-2g/L，磷酸二氢钾 0.01-0.02g/L,氯化镁 0.05—0.lg/L,CAPSl 1-22.13g/L，氯化钠 5_30g/L，硫酸钠 3_4g/L，氯化钾 0.677g/L，溴化钾 0.05-0.15g/L,硼酸 0.02-0.03g/L,氟化钠 0.002-0.003g/L,氯化钙 1-1.3g/L，氯化锶 0.01-0.02g/L,去离子水IL ;按照以上浓度称量氯化钙、氯化锶和氯化镁溶解于180-220ml水中；称量CAPS溶解于130-170ml水中，用氢氧化钠溶液将CAPS溶液的pH值调整至9.6-10.5 ;其他组分溶解于630-670ml水中；上述3种溶液115_121°C灭菌15_30min后混匀。
[0020]以上所述的筛选方法，将`钙原子光谱分析标准浓缩液用去离子水配制梯度浓度钙离子溶液用多通道移液枪吸取定量的各浓度钙离子溶液加入透明微孔板中，每个浓度加3个孔，用多通道移液枪向加有梯度浓度钙离子溶液的孔中加入定量钙离子显色应用液混匀，避光反应5-15min ;反应结束后，采用酶标仪测定显色反应液的在575nm的吸光度，以钙离子浓度为X坐标，光吸收值为Y坐标，得到标准曲线。[0021]以上所述的筛选方法，钙离子显色应用液由显色剂与缓冲液等体积混合配制，其中，显色剂的配制方法如下:500mg8-羟基喹啉中溶解于5000 μ L的浓盐酸中，加入邻-甲酚酞络合酮25mg完全溶解后，再加ImL聚乙二醇辛基苯基醚混匀，然后加去离子水至500ml ;缓冲液为浓度89.14g/L的AMP水溶液。
[0022]以上所述的筛选方法，所述的菌株是DSM8715。
[0023]本发明用于混凝土裂缝自修复的矿化微生物的筛选方法具有微量化、小型化和平行化的特点，可以同时处理大量样品，节省人力、物力及时间，大幅提高筛选效率。
[【专利附图】

【附图说明】]
[0024]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0025]图1是本发明实施例1高效矿化微生物高通量筛选流程图。[0026]图2是本发明实施例296孔板法的钙离子显色反应产物光吸收曲线图。
[0027]图3是本发明实施例296孔板法的邻甲酚酞络合酮法检测钙离子的标准曲线图。
[0028]图4是本发明实施例2不同碳源培养条件下Bacillus pseudofirmus DSM8715在固体培养基上的碳酸钙产量图
[0029]图5是本发明实施例1菌株DSM8715高效矿化突变株与出发菌株的矿化活性比较图。
[【具体实施方式】]
[0030]以下通过实施例对本发明进行更为具体的说明，实施例中所提及的内容并非对本发明的限定。
[0031]实施例1
[0032]Bacillus pseudof irmus DSM8715的诱变及高效矿化突变株的高通量筛选的方法如下:
[0033]将4°C保存的菌株DSM8715 (ATCC700159-DSM8715)在ASWM4琼脂平板上划线活化，30°C培养I天，用接种环取单菌落点接于新的ASWM4琼脂平板接着用无菌玻璃棒涂满整个平板。
[0034]30°C培养12h后用IOOmM碳酸钠溶液洗下菌苔制成细胞悬液。用YK-Heber型细菌计数板计数细胞浓度，将细胞悬液用IOOmM碳酸钠稀释至108cells/mL。
[0035]取7mL细胞悬浮液和磁力搅拌器直径3cm的转子放置到直径9cm的培养皿中，将培养皿至于超净台内的磁力搅拌器上中，调节转速，垫高磁力搅拌器使其台面距离紫外灯约20cm，打开培养皿盖和紫外灯，紫外照射16min后，将细胞悬液加入碱性LB培养基培养5~6ho
[0036]用IOOmM碳酸钠溶液将细菌培养液浓度梯度稀释至10_7，取10_4，10_5，10_6，10_7稀释液200 μ L涂布于碱性LB琼脂平板，每个梯度涂布3个平板，30°C培养2_4天。
[0037]其中，碱性LB培养基的组分和制备方法如下，酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，碳酸钠10g/L ;按以上浓度称量酵母粉和胰蛋白胨溶解于900ml水中；称量碳酸钠溶解于100ml水中；两种溶液灭菌后于无菌超净工作台中混匀分装于培养容器如三角瓶中即可使用。
[0038]随机挑取1000个单菌落，保存于装有碱性LB固体培养基的96孔透明微孔板的孔中，30°C、倒置培养24-48h;每一孔中的菌株由该孔所在透明微孔板的编号、行号和列号组合命名。
[0039]其中，碱性LB固体培养基的组分和制备方法如下:酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，碳酸钠10g/L，琼脂粉15g ;按以上浓度称量酵母粉、胰蛋白胨和琼脂粉溶解于900ml水中；称量碳酸钠溶解于100ml水中；两种溶液灭菌后于无菌超净工作台中趁热混匀并分装于96孔板孔中，每孔300 μ L)
[0040]将透明微孔板中的菌落用多通道移液器对应的接种于装有ASWM4发酵培养基的深孔板I对应的孔中，盖上8层纱布和在对应孔处有小孔的塑料盖子，于30°C静置培养48h ；
[0041]将深孔板I中的发酵液对应地接种到装有发酵培养基的深孔板II对应的孔中，盖上8层纱布和在对应孔处有小孔的塑料盖子，于30°C静置培养168h ;将深孔板II放置于深孔板离心机中，3000Xg离心lOmin。深孔板II孔中的上清液即为待测样品。
[0042]以微量化稀释法将上清液稀释3-5倍，在透明微孔板中加入钙离子显色应用液，加入待测样品混匀，以培养基做空白对照，避光反应5-15min。反应结束后，采用酶标仪测定显色反应液的吸光度，根据标准曲线和发酵液稀释倍数计算上清液中钙离子浓度和钙矿化率。
[0043]钙矿化率=(CcrC1 VCtl ;其中Ctl指培养基中的初始钙离子浓度，初始钙离子浓度即培养基中的钙离子浓度，由培养基的配方决定K1指经过7天培养后发酵液中的残钙浓度，筛选结果获得了 I株钙矿化率提高了 11.1%的突变菌株B388，菌株的钙矿化率结果见图5。
[0044]实施例2:
[0045]不同碳源培养条件下Bacillus pseudof irmus DSM8715在固体培养基上的碳酸钙
产量:`
[0046]分别配制基本培养基-鹿糖B-Sugar,基本培养基-葡萄糖B-Glucose,基本培养基-糖蜜B-Molasses，基本培养基-酵母粉B-yeast extract (ASWM4)，基本培养基-固体培养基Basic medium。将ASWM4培养基配方中的酵母粉成分删除即为basic medium培养基，分别用lg/L蔗糖、葡萄糖或糖蜜代替酵母粉，即为B-Sugar培养基，B-Glucose培养基和B-Molasses培养基。
[0047]ASWM4发酵培养基的配方及制备方法如下:L_乳酸钠5_10g/L，硝酸钠l_2g/L，酵母粉0.5-2g/L，磷酸二氢钾0.01-0.02g/L，氯化镁0.05—0.lg/L, CAPS (3-环已氨基丙磺酸)11-22.13g/L，氯化钠 5-30g/L，硫酸钠 3_4g/L，氯化钾 0.677g/L，溴化钾 0.05-0.15g/L，硼酸 0.02-0.03g/L,氟化钠 0.002-0.003g/L,氯化钙 1-1.3g/L，氯化锶 0.01-0.02g/L,去离子水1L。
[0048]配制方法:按照以上浓度称量氯化钙、氯化锶和氯化镁溶解于200ml水中；称量CAPS溶解于150ml水中，用6M氢氧化钠溶液将CAPS溶液的pH值调整至9.6-10.5 ;其他成分溶解于650ml水中；将以上3种溶液115-121 °C高压湿热灭菌15_30min后在无菌超净工作台中混匀并用多通道移液器分装至96孔板中备用。
[0049]向4行6列的24孔板中每个孔中加入2mL培养基，每种培养基仅加一列，即每种培养基4个孔，5种培养基共20个孔中加有培养基，用8通道可调移液枪各接种10 μ L菌株DSM8715种子液，每种培养基接种I列中的3个孔，另外一个孔不接种，30°C静置培养7天，以未接种固体培养基为对照。
[0050]用解剖针将每个孔中的固体培养基捣成小块，用药匙挖出，放入50mL离心管中，加入30mL去离子水，10(TC水浴直至培养基融化，放于漩涡振荡器上震荡2min，10(TC水浴静置lOmin，倾去上清，再加入30mL煮沸的去离子水，振荡后倾去上清，如此反复，共洗涤5次并振荡后倾去上清，最后放入80°C烘箱中干燥12小时，至水分完全蒸发，剩余的即为碳酸钙。
[0051]分别向离心管中加入2mL0.5M稀盐酸，旋紧盖子后涡旋振荡lmin，静置12h。在离心机上以4500 X g离心15min，各取上清液50-100 μ L，转移至各孔装有200 μ L0.5Μ稀盐酸的透明微孔板的对应孔中，用多通道移液枪吹吸混匀。
[0052]用量程为10微升的多通道移液枪吸取3.75 μ L加入另一个新的透明微孔板中，用量程为300微升的多通道移液枪向加有待测样品的孔中加入300 μ L钙离子显色应用液，以不加氯化钙的ASWM4培养基做空白对照，避光反应5-15min。反应结束后，采用酶标仪测定显色反应液的在575nm的吸光度，根据标准曲线和稀释倍数计算不同孔中上清液中钙离子浓度，进而根据样品体积再计算出不同孔中的碳酸钙产量。
[0053]邻-甲酚酞络合酮(OCPC)显色剂的配制:称取8-羟基喹啉500mg置烧杯中，加浓盐酸5000 μ L，使其溶解并转入500ml容量瓶中，再加入邻-甲酚酞络合酮25mg，待完全溶解后，加ImL聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-1OO)混匀，然后加去离子水至500ml，置聚乙烯瓶内4°C保存。
[0054]AMP碱性缓冲液的配制:于IL容量瓶中置去离子水500mL，加入AMP89.14g，待完全溶解后加水至1L,置聚乙烯瓶中4°C保存。
[0055]显色应用液的配制:临用前，根据所需用量多少，将OCPC显色剂与AMP缓冲液等体积混合。混合后，吸取300 μ L显色应用液加入透明微孔板孔中，用酶标仪检测检测其对波长575nm光的光吸收值，若0D575在0.3以下，则表示该溶液合格，可以使用。
`[0056]标准曲线的制作:用IOOmL容量瓶定容稀释钙原子光谱分析标准浓缩液(钙原子光谱分析标准浓缩液1.0OgCa, sigma公司产品)至10g/L (250mM)分装后于_20°C保存备用。用去离子水配制梯度浓度钙离子溶液:0.25mM, 0.5mM, ImM, 2mM, 3mM, 4mM, 5mM。用10微升的多通道移液枪吸取3.75 μ L各浓度钙离子溶液加入透明微孔板中，每个浓度加3个孔，用300微升的多通道移液枪向加有梯度浓度钙离子溶液的孔中加入300 μ L钙离子显色应用液混匀，以去离子水做空白对照，避光反应5-15min。反应结束后，采用酶标仪测定显色反应液的在575nm的吸光度，以钙离子浓度为横坐标，0D575值为纵坐标，绘制标准曲线，结果如图3。标准曲线的二元拟合方程为:y=0.1009x-0.0006，R2=0.9992。
[0057]不同碳源培养条件下Bacillus pseudof irmus DSM8715发酵液残钙检测结果如图4。
[0058]本发明以上实施例以微孔板为操作平台的微生物培养及活性测定方法的建立，为菌种筛选过程中实现高通量奠定了基础。微孔板体系的菌株筛选方法具有微量化、小型化和平行化的特点，因此采用高通量策略筛选高效矿化微生物能同时处理大量样品，节省人力、物力及时间，大幅提闻筛选效率。
[0059]本发明以上实施例高通量筛选方法以96孔板作为发酵容器，每孔装液300 μ L，每个样品仅需要300 μ L显色液，节省培养液和显色液，成本大幅降低；[0060]本发明以上实施例的高通量筛选方法以多通道移液器(6通道，8通道或12通道移液器)进行接种取样稀释等操作，每次操作可以相应完成6-12个样品的接种、取样或稀释，实现操作的批量化，提高了操作效率；[0061]本发明以上实施例高通量检测方法每个样品只需要3 μ L左右，每板96个样品检测时间只需要30s，大大缩短了检测所需时间，提高了检测效率。
【权利要求】
1.一种用于混凝土裂缝自修复的矿化微生物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤: 101)对菌株进行活化及培养，制成细胞悬浮液； 102)对细胞悬浮液进行紫外诱变后加入碱性培养基中进行培养； 103)将步骤102中获得的培养液稀释成不同的浓度后在不同的平板上分别进行培养；随机挑取复数个单菌落分别保存于装有固体培养基的微孔板的孔中倒置培养； 104)将微孔板中的菌落接种于装有发酵培养基的深孔板对应的孔中静置培养； 105)将深孔板放置于深孔板离心机中分离出上清液作为待测样品； 106)测定样品中的钙离子浓度和钙矿化率，筛选出优良菌株。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤101包括将菌株在琼脂平板上划线活化，28°C _32°C培养20-28h，取单菌落点接种于新的琼脂平板，28°C _32°C培养10_14h后用90-1 IOmM的碳酸钠缓冲液洗下菌苔制成细胞悬液。
3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤102包括将细胞悬浮液和磁力搅拌器的转子置于培养皿中，将培养皿置于磁力搅拌器上，开动磁力搅拌器，用紫外灯照射10-20min后，将细胞悬液加入到碱性培养基中培养5_6h ;步骤103包括将培养液的浓度按一定的梯度稀释，将定量的不同浓度的稀释液涂布于碱性琼脂平板，每个梯度涂布复数个平板，28°C _32°C培养2-4天，挑取复数个单菌落，保存于装有碱性固体培养基的微孔板的孔中，28°C -32°C、倒置培养24-48h。
4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤104包括将微孔板中的菌落用多通道移液器对应的接种于装有发酵培养基的深孔板I对应的孔中，于28°C _32°C静置培养36-60h ;将深孔板I中的发酵液对应地接种到装有发酵培养基的深孔板II对应的孔中，于28°C -32°C静置培养6-8天；将深孔板II放置于深孔板离心机中离心得到的上清液即为待测样品。
5.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤105包括以微量化稀释法将待测样品稀释3-5倍，在透明微孔板中加入钙离子显色应用液，加入待测样品混匀，避光反应5-15min;反应结束后，采用酶标仪测定显色反应液的吸光度，根据标准曲线和待测样品稀释倍数计算待测样品中钙离子浓度和钙矿化率。
6.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，碱性培养基的组分和制备方法如下，酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，碳酸钠10g/L;按以上浓度称量酵母粉和胰蛋白胨溶解于900ml水中，称量碳酸钠溶解于100ml水中，两种溶液灭菌后混匀；碱性固体培养基的组分和制备方法如下:酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，碳酸钠10g/L，琼脂粉15g ;按以上浓度称量酵母粉、胰蛋白胨和琼脂粉溶解于900ml水中；称量碳酸钠溶解于100ml水中,两种溶液灭菌后混匀。
7.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，发酵培养基的组分和制备方法如下，L-乳酸钠5-10g/L，硝酸钠l_2g/L，酵母粉0.5_2g/L，磷酸二氢钾0.01-0.02g/L,氯化镁.0.05—0.lg/L，CAPSl 1-22.13g/L，氯化钠 5_30g/L，硫酸钠 3_4g/L，氯化钾 0.677g/L，溴化钾 0.05-0.15g/L，硼酸 0.02-0.03g/L,氟化钠 0.002-0.003g/L,氯化钙 1-1.3g/L，氯化锶.0.01-0.02g/L，去离子水IL ;按照以上浓度称量氯化钙、氯化锶和氯化镁溶解于180-220ml水中；称量CAPS溶解于130-170ml水中，用氢氧化钠溶液将CAPS溶液的pH值调整至`9.6-10.5 ;其他组分溶解于630-670ml水中；上述3种溶液115_121°C灭菌15_30min后混匀。
8.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，将钙原子光谱分析标准浓缩液用去离子水配制梯度浓度钙离子溶液用多通道移液枪吸取定量的各浓度钙离子溶液加入透明微孔板中，每个浓度加3个孔，用多通道移液枪向加有梯度浓度钙离子溶液的孔中加入定量钙离子显色应用液混匀，避光反应5-15min ;反应结束后,采用酶标仪测定显色反应液的在575nm的吸光度，以钙离子浓度为X坐标，光吸收值为Y坐标，得到标准曲线。
9.根据权利要求8所述的筛选方法，其特征在于，钙离子显色应用液由显色剂与缓冲液等体积混合配制，其中，显色剂的配制方法如下:500mg8-羟基喹啉中溶解于5000 μ L的浓盐酸中，加入邻-甲酚酞络合酮25mg完全溶解后，再加ImL聚乙二醇辛基苯基醚混匀，然后加去离子水至500ml ;缓冲液为浓度89.14g/L的AMP水溶液。
10.根据权利要求1至9中任一权利要求所述的筛选方法，其特征在于，所述的菌株是DSM8715。`
【文档编号】C12N15/01GK103509784SQ201310430855
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年9月18日 优先权日:2013年9月18日
【发明者】张金龙, 邢锋, 邓旭, 韩宁旭, 陆燕, 廖云静, 庾添玉, 卢靖坤 申请人:深圳大学