金银花萃菊免疫增强剂的药效学和毒理学试验方法
【专利摘要】本发明公开了一种金银花萃菊免疫增强剂的药效学和毒理学试验方法，药效学实验方法包括制备免疫增强剂、养殖场常见致病菌种的制备、免疫增强剂抑菌试验、免疫增强剂对致热家兔模型的退热作用的实验、免疫增强剂对咳喘小白鼠模型的作用的实验等。病毒学实验方法包括小鼠急性毒性实验、大鼠长期毒性实验、实验结果分析。本发明提供的试验方法表明免疫增强剂制剂具有明显的抗菌、退热和止咳平喘作用，血液学检查也显示中中草药组的各项免疫指标高于空白对照组；毒性试验也证明用过此药的实验动物体重、重要器官脏器系数及肉眼观察均无明显的差异或异常，证明金银花萃菊免疫增强剂是一种高效、安全的中草药制剂。
【专利说明】金银花萃菊免疫增强剂的药效学和毒理学试验方法【技术领域】
[0001]本发明属于临床医学领域，尤其涉及一种金银花萃菊免疫增强剂的药效学和毒理学试验方法。
【背景技术】
[0002]金银花萃菊免疫增强剂是按照祖国医学的基础理论和辨证施治原则，结合畜禽的病理生理特征，组合一些能调动动物体全身免疫系统的中草药研制而成的高效免疫调节剂，该制剂具有明显的抗菌、退热和止咳平喘作用，这些年来先后在多个养殖场进行临床试验和应用研究，取得了很好的效果。为了验证此制剂的临床药效和安全性，现需要对对金银花萃菊免疫增强剂进行药效学和毒理学试验研究。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种金银花萃菊免疫增强剂的药效学和毒理学试验方法，旨在验证金银花萃菊免疫增强剂的临床药效和安全性。
[0004]本发明是这样实现的，金银花萃菊免疫增强剂的药效学实验方法包括制备金银花萃菊免疫增强剂、养殖场常见致病菌种的制备、金银花萃菊免疫增强剂抑菌试验、金银花萃菊免疫增强剂对致热家兔模型的退热作用的实验、金银花萃菊免疫增强剂对咳喘小白鼠模型的作用的实验、金银花萃菊免疫增强剂对小白鼠IgM、C3和C4的影响的试验、实验结果分析。其具体步骤如下:
[0005]第一步，制备金银花萃菊免疫增强剂。金银花萃菊的处方由金银花、萃菊、鱼腥草、筋骨草、连翘、黄芩、板蓝根、黄芪、柴胡、甘草等10多味中草药组成，制备时精选上述各种地道优质的中草药，按一定比例称取后，粉碎成粗粉末，用水浸泡30分钟以后，置于锅内煎3次，合并三次滤液，浓缩成1:1煎剂(按每ml药液含Ig原药)，装瓶灭菌备用。
[0006]第二步，养殖场常见致病菌种的制备。选用养殖场常见的几种致病菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、痢疾杆菌和副伤寒杆菌)，菌株从某个养殖场分离培养而得，由福建农林大学动物科学学院传染病教研室鉴定保存和提供，细菌的培养繁殖采用普通营养琼脂培养基，具体制备方法为将营养琼脂完全溶解后，经12rC、20min高压灭菌后，倒入培养皿，平铺成3~5mm的培养基，冷却凝固后备用；菌株接种采用接种环和划线法；接种后置于37°C恒温培养箱培养24h，置于4°C冰箱中保存备用。
[0007]第三步，金银花萃菊免疫增强剂抑菌试验。将直径为6_的圆形滤纸片高压灭菌、干燥后置于1:1浓度的中草药煎剂浓缩液中浸润备用，然后在无菌操作柜内采用无菌操作法分别用不同涂布棒将上述菌株的新鲜培养物均匀地涂抹在琼脂培养基上，再将浸润过中草药的纸片均匀间隔紧贴于培养基表面，调整按压纸片使其接触良好后置于37°C恒温培养箱培养24h，然后取出观察其抑菌圈，测量抑菌圈直径D(mm)并记录其结果。判定标准按照《中药药理学》及《抗菌药物药敏试验判定标准》规定，抑菌圈直径< IOmm为低敏，抑菌圈直径> 10~18mm为中度敏感，抑菌圈直径> 18mm为高度敏感。[0008]第四步，金银花萃菊免疫增强剂对致热家兔模型的退热作用的实验。供试大耳白兔若干，，选择健康无病、体温合格大耳白兔18只，体温合格的标准范围为38.6-39.5°C,每天测肛温3次，预试3d后，然后随机分为3组，试验前禁食12h但不禁水，试验开始前30min，再测肛温3次，每次5min，取其平均值作为该试验兔的基础体温。按照中草药药理试验方法学所嘱进行家兔模型造病，给每只实验兔耳缘静脉注射2，4- 二硝基苯酚lml/100g (15mg/kg)待试验兔致热后30min，按照3组不同分组给药治疗，其中A组用人导尿管经口给兔胃内灌入金银花萃菊浓缩液10ml/kg/只；B组给予复方阿司匹林100mg/kg-l ；C组对照组给予生理盐水10mi/kg/只；实验动物均采用灌胃法给药。给药后30，60，90，120，180，240，300，360min分别测定试验兔肛温3次，取其平均值，并以该试验兔体温与基础体温的差值作为观察指标进行t检验，比较中西药对各组试验兔的退热作用。
[0009]第五步，金银花萃菊免疫增强剂对咳喘小白鼠模型的作用的实验。供试小白鼠30只，随机分成3组，每只重25±5g，雌雄各半兼用。其中A组金银花萃菊口服液组0.5ml(20g/kg)/只；B组复方磷酸可待因口服液30mg/kg ；c组生理盐水对照组0.5ml (20g/kg)/只；实验动物均采用灌胃法给药，试验第一天上、下午各给药I次，试验第2天上午给药Ih后，将实验动物放入装有恒压喷雾装置的箱笼中，在恒压下将浓氨水以喷雾状态均匀进入箱笼中，气压表上的压力以0.2个大气压或18.7kPa (HOmmHg)为宜，喷雾时间约为30min，观察各组实验动物的咳嗽症状出现时间，典型咳嗽为小白鼠腹肌收缩，同时张大口，并有咳嗽声。计算各组动物的咳嗽症状的潜伏期和镇咳率。
[0010]第六步，金银花萃菊免疫增强剂对小白鼠IgM、c3和c4的影响的试验。供试小白鼠60只，每只重25 ±5g，雌雄各半兼用，随机分成3大组，每大组20只，每大组分成两个小组，每小组10只，分为对照组和实验组。每小组实验小白鼠饲喂相应的金银花萃菊口服液
0.3ml/只/d ;对照组灌喂生理盐水，0.3ml/只/d。连续饲养两周，进行采血检验(眼珠采血)。将小白鼠从笼中取出，右手提起住尾巴迅速旋转，使其眩晕，然后，放在地上，右手后拽尾巴，待小鼠前蹿时，左手食指和拇指迅速夹住其耳朵后的皮肤，再将尾巴握在掌中，使其眼珠突出，用镊子将眼珠 拔出，滴出的血用小清瓶接住，标上记号。将采到的血相应的加入到做好标记的离心管中，低温离心8000rpmX3min,取上清液,于_20°C保存。将采到的血相应的加入到做好标记的离心管中，低温离心8000rpmX3min,取上清液,于_20°C保存。不加抗凝剂的立即离心，取血清。免疫球蛋白含量的检测委托福建省第二人民医院，检测方法采用免疫比浊法。
[0011]第七步，实验结果分析。
[0012]进一步，金银花萃菊免疫增强剂的药效学实验动物为供试小白鼠90只，每只重25±5g，大耳白兔18只，体重1.5±0.25kg。
[0013]进一步，金银花萃菊免疫增强剂的药效学实验仪器包括恒压喷雾装置(由玻璃喷雾器、空压机、压力表和动物容器组成)、离心机(型号，FT120型)、酶标仪(型号，P-E4100型)、恒温培养箱(型号，DU640)。
[0014]金银花萃菊免疫增强剂的病毒学实验方法包括小鼠急性毒性实验、大鼠长期毒性实验、实验结果分析。具体步骤如下:
[0015]第一步，小鼠急性毒性实验。包括I次最大给药量测定实验和Id最大给药量测定实验。[0016]I次最大给药量测定实验步骤如下:将40只小鼠，雌雄各半，随机分为2组，即对照组和金银花萃菊免疫增强剂组，每组20只，雌雄各半。禁食禁水12h，按40mL/kg剂量灌胃，对照组则给同量蒸馏水，观察7d，记录小鼠的毒性反应症状及死亡情况；实验结束后处死、解剖，称量小鼠给药前和给药后第7d的体重。肉眼观察小鼠主要脏器组织病变情况。
[0017]Id最大给药量测定实验步骤如下:将40只小鼠，雌雄各半，随机分为2组，每组20只，雌雄各半。禁食禁水12h，按40mL/kg剂量的金银花萃菊免疫增强剂灌胃3次/d，每次间隔8h，对照组则采用同量蒸馏水灌胃，观察7d，记录实验小鼠的毒性反应症状及死亡情况；实验结束后处死。肉眼观察小鼠主要脏器组织病变情况。 [0018]第二步，大鼠长期毒性实验。将大鼠预试观察7d后，按性别和体重随机分为4组，雌雄各半。第I组为空白对照组给予同量蒸馏水、第2、3、4组为金银花萃菊免疫增强剂实验组高、中、低3个档次剂量组(20.0g, 10.0g, 5.0g生药/kg)，每组20只，各组均按灌胃给药，给药量为20ml/kg.1次/d，连续给药2个月(8周)。给药前及给药期间每周称实验动物体重2次，并根据体重变化适当调整给药剂量。实验期间每天观察大鼠体征、一般状态、登记其摄食量、饮水及粪便状况。于末次给药后24h，各组均取10只动物，雌雄各半；处死后剖杀取血，检查血液学和血液生化学指标。取血后立即剖取动物心、肝、脾、肺、肾、睾丸(附睾)、卵巢、子宫、十二指肠、脑、肾上腺、甲状腺、胸腺等脏器称重，根据体重计算器官重量系数(脏器系数)。将上述脏器肉眼观察其变化，然后用10%的甲醛溶液固定，制作上述脏器组织切片，镜检其病理组织学变化，观察免疫增强剂对大鼠肝肾功能的影响。
[0019]第三步，实验结果分析。
[0020]本发明通过对金银花萃菊免疫增强剂的药效学和毒理学试验研究，表明，金银花萃菊免疫增强剂制剂具有明显的抗菌、退热和止咳平喘作用，血液学检查也显示中中草药组的各项免疫指标高于空白对照组；毒性试验也证明用过此药的实验动物体重、重要器官脏器系数及肉眼观察均无明显的差异或异常，由此证明金银花萃菊免疫增强剂是一种高效、安全的中草药制剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1是金银花萃菊免疫增强剂的药效学实验方法的流程图。
[0022]图2是金银花萃菊免疫增强剂的病毒学实验方法的流程图。
【具体实施方式】
[0023]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0024]图1示出了金银花萃菊免疫增强剂的药效学实验方法的流程。如图所示，金银花萃菊免疫增强剂的药效学实验方法包括:
[0025]制备金银花萃菊免疫增强剂SlOl ；
[0026]养殖场常见致病菌种的制备S102 ;
[0027]金银花萃菊免疫增强剂抑菌试验S103 ；
[0028]金银花萃菊免疫增强剂对致热家兔模型的退热作用的实验S104 ；[0029]金银花萃菊免疫增强剂对咳喘小白鼠模型的作用的实验S105 ；
[0030]金银花萃菊免疫增强剂对小白鼠IgM、c3和c4的影响的试验S106 ；
[0031]实验结果分析S107。
[0032]其具体步骤如下:
[0033] 第一步，制备金银花萃菊免疫增强剂。金银花萃菊的处方由金银花、萃菊、鱼腥草、筋骨草、连翘、黄芩、板蓝根、黄芪、柴胡、甘草等10多味中草药组成，制备时精选上述各种地道优质的中草药，按一定比例称取后，粉碎成粗粉末，用水浸泡30分钟以后，置于锅内煎3次，合并三次滤液，浓缩成1:1煎剂(按每ml药液含Ig原药)，装瓶灭菌备用。
[0034]第二步，养殖场常见致病菌种的制备。选用养殖场常见的几种致病菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、痢疾杆菌和副伤寒杆菌)，菌株从某个养殖场分离培养而得，由福建农林大学动物科学学院传染病教研室鉴定保存和提供，细菌的培养繁殖采用普通营养琼脂培养基，具体制备方法为将营养琼脂完全溶解后，经12rC、20min高压灭菌后，倒入培养皿，平铺成3~5mm的培养基，冷却凝固后备用；菌株接种采用接种环和划线法；接种后置于37°C恒温培养箱培养24h，置于4°C冰箱中保存备用。
[0035]第三步，金银花萃菊免疫增强剂抑菌试验。将直径为6_的圆形滤纸片高压灭菌、干燥后置于1:1浓度的中草药煎剂浓缩液中浸润备用，然后在无菌操作柜内采用无菌操作法分别用不同涂布棒将上述菌株的新鲜培养物均匀地涂抹在琼脂培养基上，再将浸润过中草药的纸片均匀间隔紧贴于培养基表面，调整按压纸片使其接触良好后置于37°C恒温培养箱培养24h，然后取出观察其抑菌圈，测量抑菌圈直径D(mm)并记录其结果。判定标准按照《中药药理学》及《抗菌药物药敏试验判定标准》规定，抑菌圈直径< IOmm为低敏，抑菌圈直径> 10~18mm为中度敏感，抑菌圈直径> 18mm为高度敏感。
[0036]第四步，金银花萃菊免疫增强剂对致热家兔模型的退热作用的实验。供试大耳白兔若干，，选择健康无病、体温合格大耳白兔18只，体温合格的标准范围为38.6-39.5°C,每天测肛温3次，预试3d后，然后随机分为3组，试验前禁食12h但不禁水，试验开始前30min，再测肛温3次，每次5min，取其平均值作为该试验兔的基础体温。按照中草药药理试验方法学所嘱进行家兔模型造病，给每只实验兔耳缘静脉注射2，4- 二硝基苯酚lml/100g (15mg/kg)待试验兔致热后30mi n，按照3组不同分组给药治疗，其中A组用人导尿管经口给兔胃内灌入金银花萃菊浓缩液10ml/kg/只；B组给予复方阿司匹林100mg/kg-l ；C组对照组给予生理盐水10ml/kg/只；实验动物均采用灌胃法给药。给药后30，60，90，120，180，240，300，360min分别测定试验兔肛温3次，取其平均值，并以该试验兔体温与基础体温的差值作为观察指标进行t检验，比较中西药对各组试验兔的退热作用。
[0037]第五步，金银花萃菊免疫增强剂对咳喘小白鼠模型的作用的实验。供试小白鼠30只，随机分成3组，每只重25±5g，雌雄各半兼用。其中A组金银花萃菊口服液组0.5ml(20g/kg)/只；B组复方磷酸可待因口服液30mg/kg ；c组生理盐水对照组0.5ml (20g/kg)/只；实验动物均采用灌胃法给药，试验第一天上、下午各给药I次，试验第2天上午给药Ih后，将实验动物放入装有恒压喷雾装置的箱笼中，在恒压下将浓氨水以喷雾状态均匀进入箱笼中，气压表上的压力以0.2个大气压或18.7kPa (HOmmHg)为宜，喷雾时间约为30min，观察各组实验动物的咳嗽症状出现时间，典型咳嗽为小白鼠腹肌收缩，同时张大口，并有咳嗽声。计算各组动物的咳嗽症状的潜伏期和镇咳率。[0038]第六步，金银花萃菊免疫增强剂对小白鼠IgM、c3和c4的影响的试验。供试小白鼠60只，每只重25 ±5g，雌雄各半兼用，随机分成3大组，每大组20只，每大组分成两个小组，每小组10只，分为对照组和实验组。每小组实验小白鼠饲喂相应的金银花萃菊口服液
0.3ml/只/d ;对照组灌喂生理盐水，0.3ml/只/d。连续饲养两周，进行采血检验(眼珠采血)。将小白鼠从笼中取出，右手提起住尾巴迅速旋转，使其眩晕，然后，放在地上，右手后拽尾巴，待小鼠前蹿时，左手食指和拇指迅速夹住其耳朵后的皮肤，再将尾巴握在掌中，使其眼珠突出，用镊子将眼珠拔出，滴出的血用小清瓶接住，标上记号。将采到的血相应的加入到做好标记的离心管中，低温离心8000rpmX3mi η,取上清液,于_20°C保存。将采到的血相应的加入到做好标记的离心管中，低温离心8000rpmX3min,取上清液,于_20°C保存。不加抗凝剂的立即离心，取血清。免疫球蛋白含量的检测委托福建省第二人民医院，检测方法采用免疫比浊法。
[0039]第七步，实验结果分析。
[0040]进一步，金银花萃菊免疫增强剂的药效学实验动物为供试小白鼠90只，每只重25±5g，大耳白兔18只，体重1.5±0.25kg。
[0041]进一步，金银花萃菊免疫增强剂的药效学实验仪器包括恒压喷雾装置(由玻璃喷雾器、空压机、压力表和动物容器组成)、离心机(型号，FT120型)、酶标仪(型号，P-E4100型)、恒温培养箱(型号，DU640)。
[0042]图2示出了金银花萃菊免疫增强剂的病毒学实验方法的流程图，如图所示，金银花萃菊免疫增强剂的病毒学实验方法包括:
[0043]小鼠急性毒性实验S201
[0044]大鼠长期毒性实验S202
[0045]实验结果分析S203。
[0046]具体步骤如下:
[0047]第一步，小鼠急性毒性实验。
[0048]包括I次最大给药量测定实验和Id最大给药量测定实验。
[0049]I次最大给药量测定实验步骤如下:将40只小鼠，雌雄各半，随机分为2组，即对照组和金银花萃菊免疫增强剂组，每组20只，雌雄各半。禁食禁水12h，按40mL/kg剂量灌胃，对照组则给同量蒸馏水，观察7d，记录小鼠的毒性反应症状及死亡情况；实验结束后处死、解剖，称量小鼠给药前和给药后第7d的体重。肉眼观察小鼠主要脏器组织病变情况。
[0050]Id最大给药量测定实验步骤如下:将40只小鼠，雌雄各半，随机分为2组，每组20只，雌雄各半。禁食禁水12h，按40mL/kg剂量的金银花萃菊免疫增强剂灌胃3次/d，每次间隔8h，对照组则采用同量蒸馏水灌胃，观察7d，记录实验小鼠的毒性反应症状及死亡情况；实验结束后处死。肉眼观察小鼠主要脏器组织病变情况。
[0051]第二步，大鼠长期毒性实验。将大鼠预试观察7d后，按性别和体重随机分为4组，雌雄各半。第I组为空白对照组给予同量蒸馏水、第2、3、4组为金银花萃菊免疫增强剂实验组高、中、低3个档次剂量组(20.0g, 10.0g, 5.0g生药/kg)，每组20只，各组均按灌胃给药，给药量为20ml/kg.1次/d，连续给药2个月(8周)。给药前及给药期间每周称实验动物体重2次，并根据体重变化适当调整给药剂量。实验期间每天观察大鼠体征、一般状态、登记其摄食量、饮水及粪便状况。于末次给药后24h，各组均取10只动物，雌雄各半；处死后剖杀取血，检查血液学和血液生化学指标。取血后立即剖取动物心、肝、脾、肺、肾、睾丸(附睾)、卵巢、子宫、十二指肠、脑、肾上腺、甲状腺、胸腺等脏器称重，根据体重计算器官重量系数(脏器系数)。将上述脏器肉眼观察其变化，然后用10%的甲醛溶液固定，制作上述脏器组织切片，镜检其病理组织学变化，观察免疫增强剂对大鼠肝肾功能的影响。
[0052]第三步，实验结果分析。
[0053]上述虽然结合附图对本发明的【具体实施方式】进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性的劳动即 可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种金银花萃菊免疫增强剂的药效学实验方法，其特征在于，所述的金银花萃菊免疫增强剂的药效学实验方法包括制备金银花萃菊免疫增强剂、养殖场常见致病菌种的制备、金银花萃菊免疫增强剂抑菌试验、金银花萃菊免疫增强剂对致热家兔模型的退热作用的实验、金银花萃菊免疫增强剂对咳喘小白鼠模型的作用的实验、金银花萃菊免疫增强剂对小白鼠IgM、c3和c4的影响的试验、实验结果分析；具体步骤如下: 第一步，制备金银花萃菊免疫增强剂；金银花萃菊的处方由金银花、萃菊、鱼腥草、筋骨草、连翘、黄芩、板蓝根、黄芪、柴胡、甘草组成，制备时精选上述各种地道优质的中草药，按比例称取后，粉碎成粗粉末，用水浸泡30分钟以后，置于锅内煎3次，合并三次滤液，浓缩成I:1煎剂，按每ml药液含Ig原药，装瓶灭菌备用； 第二步，养殖场常见致病菌种的制备；选用养殖场常见的致病菌，细菌的培养繁殖采用普通营养琼脂培养基，具体制备方法为将营养琼脂完全溶解后，经12rC、20min高压灭菌后，倒入培养皿，平铺成3~5mm的培养基，冷却凝固后备用；菌株接种采用接种环和划线法；接种后置于37°C恒温培养箱培养24h，置于4°C冰箱中保存备用， 第三步，金银花萃菊免疫增强剂抑菌试验；将直径为6_的圆形滤纸片高压灭菌、干燥后置于1:1浓度的中草药煎剂浓缩液中浸润备用，然后在无菌操作柜内采用无菌操作法分别用不同涂布棒将上述菌株的新鲜培养物均匀地涂抹在琼脂培养基上，再将浸润过中草药的纸片均匀间隔紧贴于培养基表面，调整按压纸片使其接触良好后置于37°C恒温培养箱培养24h，然后取出观察其抑菌圈，测量抑菌圈直径D(mm)并记录其结果；判定标准按照《中药药理学》及《抗菌药物药敏试验判定标准》规定，抑菌圈直径< IOmm为低敏，抑菌圈直径> 10~18mm为中度敏感，抑菌圈直径> 18mm为高度敏感； 第四步，金银花萃菊免疫增强剂对致热家兔模型的退热作用的实验；供试大耳白兔若干，，选择健康无病、体温合格大耳白兔18只，体温合格的标准范围为38.6-39.5°C，每天测肛温3次，预试3d后，然后随机分为3组，试验前禁食12h但不禁水，试验开始前30min，再测肛温3次，每次5min，取其`平均值作为该试验兔的基础体温；按照中草药药理试验方法学所嘱进行家兔模型造病，给每只实验兔耳缘静脉注射2,4- 二硝基苯酹lml/100g (15mg/kg)待试验兔致热后30mi n，按照3组不同分组给药治疗，其中A组用人导尿管经口给兔胃内灌入金银花萃菊浓缩液10ml/kg/只；B组给予复方阿司匹林100mg/kg-l ；C组对照组给予生理盐水10ml/kg/只；实验动物均采用灌胃法给药；给药后30，60，90，120，180，240，300，360min分别测定试验兔肛温3次，取其平均值，并以该试验兔体温与基础体温的差值作为观察指标进行t检验，比较中西药对各组试验兔的退热作用； 第五步，金银花萃菊免疫增强剂对咳喘小白鼠模型的作用的实验；供试小白鼠30只，随机分成3组，每只重25±5g，雌雄各半兼用；其中A组金银花萃菊口服液组0.5ml (20g/kg) /只；B组复方磷酸可待因口服液30mg/kg ；c组生理盐水对照组0.5ml (20g/kg)/只；实验动物均采用灌胃法给药，试验第一天上、下午各给药I次，试验第2天上午给药Ih后，将实验动物放入装有恒压喷雾装置的箱笼中，在恒压下将浓氨水以喷雾状态均匀进入箱笼中，气压表上的压力以0.2个大气压或18.7kPa(HOmmHg)为宜，喷雾时间约为30min，观察各组实验动物的咳嗽症状出现时间，典型咳嗽为小白鼠腹肌收缩，同时张大口，并有咳嗽声；计算各组动物的咳嗽症状的潜伏期和镇咳率； 第六步，金银花萃菊免疫增强剂对小白鼠IgM、c3和c4的影响的试验；供试小白鼠60只，每只重25 ±5g，雌雄各半兼用，随机分成3大组，每大组20只，每大组分成两个小组，每小组10只，分为对照组和实验组；每小组实验小白鼠饲喂相应的金银花萃菊口服液0.3ml/只/d ;对照组灌喂生理盐水，0.3ml/只/d ;连续饲养两周，进行采血检验；将小白鼠从笼中取出，右手提起住尾巴迅速旋转，使其眩晕，然后，放在地上，右手后拽尾巴，待小鼠前蹿时，左手食指和拇指迅速夹住其耳朵后的皮肤，再将尾巴握在掌中，使其眼珠突出，用镊子将眼珠拔出，滴出的血用小清瓶接住，标上记号；将采到的血相应的加入到做好标记的离心管中，低温离心8000rpmX3min,取上清液,于_20°C保存；将采到的血相应的加入到做好标记的离心管中，低温离心8000rpmX 3min,取上清液，于-20 V保存；不加抗凝剂的立即离心，取血清； 第七步，实验结果分析。
2.如权利要求1所述的金银花萃菊免疫增强剂的药效学试验方法，其特征在于，所述的金银花萃菊免疫增强剂的药效学实验动物为供试小白鼠90只，每只重25±5g，大耳白兔18 只，体重 1.5±0.25kg。
3.如权利要求1所述的金银花萃菊免疫增强剂的药效学试验方法，其特征在于，所述的金银花萃菊免疫增强剂的药效学实验仪器包括由玻璃喷雾器、空压机、压力表和动物容器组成的恒压喷雾装置、离心机、酶标仪、恒温培养箱。
4.一种金银花萃菊免疫增强剂的病毒学实验方法，其特征在于，所述的金银花萃菊免疫增强剂的病毒学实验方法包括小鼠急性毒性实验、大鼠长期毒性实验、实验结果分析；具体步骤如下: 第一步，小鼠急性毒性实验； 包括I次最大给药量测定实验和Id最大给药量测定实验； I次最大给药量测定实验步骤如下:将40只小鼠，雌雄各半，随机分为2组，即对照组和金银花萃菊免疫增强剂组，每`组20只，雌雄各半；禁食禁水12h，按40mL/kg剂量灌胃，对照组则给同量蒸馏水，观察7d，记录小鼠的毒性反应症状及死亡情况；实验结束后处死、解剖，称量小鼠给药前和给药后第7d的体重，肉眼观察小鼠主要脏器组织病变情况； Id最大给药量测定实验步骤如下:将40只小鼠，雌雄各半，随机分为2组，每组20只，雌雄各半，禁食禁水12h，按40mL/kg剂量的金银花萃菊免疫增强剂灌胃3次/d，每次间隔8h，对照组则采用同量蒸馏水灌胃，观察7d，记录实验小鼠的毒性反应症状及死亡情况；实验结束后处死，肉眼观察小鼠主要脏器组织病变情况； 第二步，大鼠长期毒性实验；将大鼠预试观察7d后，按性别和体重随机分为4组，雌雄各半，第I组为空白对照组给予同量蒸馏水、第2、3、4组为金银花萃菊免疫增强剂实验组高、中、低3个档次剂量组，每组20只，各组均按灌胃给药，给药量为20ml/kg.1次/d，连续给药2个月；给药前及给药期间每周称实验动物体重2次，并根据体重变化适当调整给药剂量，实验期间每天观察大鼠体征、一般状态、登记其摄食量、饮水及粪便状况，于末次给药后24h，各组均取10只动物，雌雄各半；处死后剖杀取血，检查血液学和血液生化学指标，取血后立即剖取动物心、肝、脾、肺、肾、睾丸、卵巢、子宫、十二指肠、脑、肾上腺、甲状腺、胸腺等脏器称重，根据体重计算器官重量系数(脏器系数)，将上述脏器肉眼观察其变化，然后用10%的甲醛溶液固定，制作上述脏器组织切片，镜检其病理组织学变化，观察免疫增强剂对大鼠肝肾功能的影响；第三步，实验结果 分析。
【文档编号】C12Q1/18GK103484524SQ201310442426
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月26日 优先权日:2013年9月26日
【发明者】邱思锋, 吴德峰 申请人:邱思锋