一株同步处理市政污水和实现油脂积累的小球藻的制作方法
【专利摘要】一株同步处理市政污水和实现油脂积累的小球藻，它涉及一种小球藻。本发明是要解决微藻生物柴油生产系统与市政污水处理系统耦合过程中遇到的藻种抗逆性较差、藻细胞脂含量低、去污染能力差、难以降解污水中的碳源物质并且在污水中生长需添加外源营养物质的问题。本发明小球藻（Chlorella?sp.）PF2，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2013年7月30日，保藏号为CGMCC?No.8014。本发明的小球藻（Chlorella?sp.）PF2,具有抗污染能力强,可以在不灭菌的一般城市污水中利用其碳、氮、磷等污染物为营养物质生长繁殖并能积累油脂的优点。
【专利说明】一株同步处理市政污水和实现油脂积累的小球藻
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种小球藻。
【背景技术】
[0002]面对日益严峻的化石能源和环境污染的挑战，利用微藻生产生物柴油越来越受到重视，这是因为微藻生物柴油是可再生能源，具有能量转化效率高，微藻油脂含量高且增殖速度快的优势。另外，微藻生物柴油生产过程不增加温室气体排放，有利于环境保护。但是，微藻生物柴油高昂的生产成本限制了其规模化生产和广泛使用，其中微藻生长需要的碳氮磷源等营养物质是微藻生物柴油生产成本的重要组成部分。市政污水中含有丰富的碳氮磷污染物，这些物质的大量排放给环境造成了沉重的负担。因此，若能将微藻生物柴油生产系统与市政污水处理系统耦合，将污水中的碳氮磷等污染物变为微藻生物柴油生产的营养物，既能降低微藻生物柴油的生产成本，又能实现废水资源化，减少环境污染。在污水处理和微藻生物柴油生产系统耦合过程中遇到了藻种抗逆性较差、脂含量低、去污染能力差、底物利用能力差的问题。因此，获得环境适应能力强、可以在污水中稳定高速生长、脂含量较高、去污染效果好的藻种对于实现污水处理资源化和微藻生物柴油生产商业化具有重要意义。
【发明内容】
[0003]本发明是要解决微藻生物柴油生产系统与市政污水处理系统耦合过程中遇到的藻种抗逆性较差、藻细胞脂含量低、去污染能力差、难以降解污水中的碳源物质并且在污水中生长需添加外源营养物质的问题，提供了一株同步处理市政污水和实现油脂积累的小球藻。
[0004]本发明一株同步处 理市政污水和实现油脂积累的小球藻，它为小球藻(Chlorellasp.) PF2，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期为2013年7月30日，保藏号为CGMCC N0.8014。
[0005]本发明的小球藻(Chlorella sp.)PF2，单细胞，球形，幼时常为椭球形，细胞壁薄。细胞长直径4-12μπι。细胞绿色，色素体杯状，占细胞大部分，具一个蛋白核。
[0006]本发明从中国黑龙江省哈尔滨太阳岛西区外滩湿地公园湖泊中分离筛选出一株同步处理市政污水和实现油脂积累的小球藻，基于细胞核编码的核糖体小亚基基因序列18S rDNA构建的系统发育树，藻种PF-2与小球藻属(Chlorella)亲缘关系密切，位于同一进化分支上。经测序，待鉴定的样品18S rDNA片段大小为1121bp。将此序列与NCBIGenebank数据库中的数据进行序列同源性比对,发现该藻株与小球藻属(Chlorella)和微芒藻(Micratinium)的亲缘关系最近。根据显微观察和18srRNA分子序列综合分析，判定微藻PF2是一种小球藻(Chlorella sp.),隶属于绿藻门(Chlorophyta)、绿藻纲(Chlorophyceae)> 绿球藻目(Chlorococcales)、小球藻科(Chlorellaceae)、小球藻属(Chlorella),最终判定 PF2 是一种小球藻(Chlorella sp.)。[0007]本发明的小球藻(Chlorella sp.) PF2，具有抗污染能力强，可以在不灭菌的一般城市污水中利用其碳、氮、磷等污染物为营养物质生长繁殖并能积累油脂的优点。市政污水经Chlorella sp.PF-2处理后，C0D、氮、磷等污染物去除率分别可达80%、65%、97%以上，C0D、氮、磷去除率最高分别可达90%、90%、100%,达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB8978-2002)。同时，该株小球藻能将污水中的碳源污染物转化成生物油脂，藻细胞的油脂含量达到20%以上，实现了市政污水的资源化处理。
[0008]本发明涉及小球藻(Chlorella sp.) PF2,它隶属于绿藻门(Chlorophyta)、绿藻纲(Chlorophyceae)、绿球藻目(Chlorococcales)、小球藻科(Chlorellaceae)、小球藻属(Chlorella)。保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期为2013年7月30日，保藏号为CGMCC N0.8014。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1为本发明的小球藻PF2细胞形态放大400倍的显微照片；
[0010]图2为本发明的小球藻PF2细胞形态放大400倍的显微照片；
[0011]图3为基于本发明的小球藻PF218S rDNA基因构建的最大简约树 。
【具体实施方式】
[0012]【具体实施方式】一:本实施方式一株同步处理市政污水和实现油脂积累的小球藻，它为小球藻(Chlorella sp.) PF2,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期为2013年7月30日，保藏号为 CGMCC N0.8014。
[0013]本实施方式的小球藻(Chlorella sp.) PF2,单细胞,球形,幼时常为椭球形,细胞壁薄。细胞长直径4-12μπι。细胞绿色，色素体杯状，占细胞大部分，具有一个蛋白核(如图1和图2所示)。
[0014]本实施方式的小球藻(Chlorella sp.) PF2，具有抗污染能力强，可以在不灭菌的一般城市污水中利用其碳、氮、磷等污染物为营养物质生长繁殖并能积累油脂的优点。市政污水经Chlorella sp.PF2处理后，C0D、氮、磷等污染物去除率分别可达80%、65%、97%以上，C0D、氮、磷去除率最高分别可达90%、90%、100%,达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB8978-2002)。同时，该株小球藻能将污水中的碳源污染物转化成生物油脂，藻细胞的油脂含量达到20%以上，实现了市政污水的资源化处理。
[0015]本实施方式涉及小球藻(Chlorella sp) PF2,它隶属于绿藻门(Chlorophyta)、绿藻纲(Chlorophyceae)、绿球藻目(Chlorococcales)、小球藻科(Chlorellaceae)、小球藻属(Chlorella)。保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期为2013年8月7日，保藏号为CGMCC N0.8014。
[0016]【具体实施方式】二:本实施方式的小球藻(Chlorella sp.) PF2从黑龙江哈尔滨太阳岛西区外滩湿地公园湖泊中筛选得到。筛选按以下步骤进行:
[0017](I)用无菌烧杯小心采集水中的浮游微藻，采集的水样用装有无菌培养基的透明玻璃瓶保存，玻璃瓶放入装有冰块的保温瓶中，然后带入实验室24小时内进行分离纯化。
[0018](2)取适量藻源加入盛有灭菌BGll培养基的三角瓶中，同时加入少量玻璃珠，置于摇床上震荡24h左右，取出后静止30min左右，吸取中层液体50mL，加入盛有150mL左右无菌BGll培养基的三角瓶中，置于恒温光照培养箱中培养,每4h摇晃一次,一次摇2min。
[0019](3)取ImL的富集藻液，用无菌水依次稀释ΙΟ4、105、IO6倍，而后吸取0.5ml，滴入无菌的含有固体BGll培养基的平板中进行涂布,置于恒温光照培养箱中培养。待长出明显的可见的藻落后，用接种环挑取单藻落，接入无菌平板进行三区划线，置于光照恒温培养箱中培养，待长出明显可见的藻落，接入无菌定向富集培养的三角瓶中，置于光照培养箱中培养。重复上述三区划线一液体培养基一三区划线步骤3—6次，直到平板上的藻落和显微镜下的细胞形态一致认为是纯藻种，进一步用18S rDNA确认后，便可获得单一的纯藻种。对获得的藻种，将其在污水中培养，测定其油脂产率、藻密度和污染物去除情况，反复测定直到稳定，选择油脂产率最好的藻种作为目的藻种。
[0020]对筛选得到的小球藻PF-2进行分子鉴定，按以下步骤进行:[0021]一、采用 CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide)方法提取藻类基因组,并参考《Molecular systematics》，具体方法如下:
[0022]取IOml藻液,8000rpm离心IOmin,加入100 μ L TE,振荡悬浮细胞,再加入800 μ L裂解液和0.8 μ L β -巯基乙醇，迅速充分振荡混匀，置于65°C温浴30min，其间来回颠倒数次，，再加入700 μ L氯仿,充分混匀，12000rpm离心5min,离心后将上清转移到新的离心管中，加入700uL结合缓冲液，充分混合均匀，再加入到离心吸附柱中去，放置lmin，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液，再加入700 μ L洗涤缓冲液，12000rpm离心lmin，重复洗涤3次，最后一次12000rpm离心2min，充分除去洗涤缓冲液，取出离心吸附柱，将其套入一个干净的1.5mL离心管,并加入50 μ L洗脱缓冲液,放置Imin后，于12000rpm离心lmin,取出离心吸附柱，取10 μ L电泳。
[0023]二、序列扩增和测定
[0024]用于PCR扩增的弓丨物序列:
[0025]18SF::5/ -GTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTA-3'
[0026]18SR:5/ -AGGGCAGGGACGTAATCAACG-3'
[0027]50μ L18S rDNA PCR 反应体系包括:10 XPCR buffer, 0.2mM dNTP，2.5mM Mg2 +，IU Taq酶，模板DNA，正反向引物，ddH20。反应程序为:95°C变性5min，然后按95°C 30s，55°C 30s, 72°C lmin程序34个循环，最后72°C延伸lOmin。PCR产物在1.5%的琼脂糖胶中电泳。PCR产物经纯化后由华大基因公司进行测序，经测序，待鉴定的样品18S rDNA片段大小为1118bp (如序列表Seq ID No:3所示)。将此序列与NCBI Genebank数据库中的数据进行序列同源性比对，发现该藻株与小球藻属(Chlorella)和微芒藻(Micratinium)的亲缘关系最近。
[0028]三、发育树构建
[0029]利用Blast功能,将所得到的样品18S rDNA序列与GenBank数据库进行比较。下载GenBank上相似藻类的序列，利用Clustal X对基因序列进行比对，辅以SEAVIEW手工校正，采用MEGA5构建形态发育树(如图3所示)，分析样品的系统发育位置，藻种PF-2与小球藻属(Chlorella)亲缘关系密切,位于同一进化分支上。
[0030]对本实施方式的小球藻(Chlorella sp.) PF2进行处理市政污水和油脂积累的功能性验证:[0031]试验1、将小球藻(Chlorella sp.) PF2 接种到 pH 为 7.5、COD 含量为 351mg/L、TN含量33mg/L、TP含量4.0mg/L的未经灭菌的市政污水中，初始接种量为5*105个/ml，在人工光源照射下使藻种利用污水中的养分生长，培养条件为:光暗比12h:12h，光强20001UX，搅拌速率150r/min，曝气速率200ml/min，温度25°C。培养8天后，采用离心的方法收集微藻，排出处理后水。处理后污水的COD、TN、TP的去除率分别为76.1%、65.2%,98.0%，达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB8978-2002) 二级排放标准。收集的微藻油脂含量为20.0%。
[0032]试验2、将小球藻(Chlorella sp.)PF2 接种到 pH 为 7.5,COD 含量为 1100mg/L、TN含量35mg/L、TP含量4.0mg/L的污水中，初始接种量为I*IO6个/ml，在人工光源照射下使藻种利用污水中的养分生长，培养条件为:光暗比12h:12h，光强18001ux，搅拌速率150r/min,曝气速率200ml/min,温度25°C。培养10天后,采用离心的方法收集微藻,排出处理后水。处理后污水的COD、TN、TP的去除率分别为85.2%,88.2%,99.5%，收集的微藻的油脂含量为22.1%。
[0033]试验3、小球藻(Chlorella sp.) PF2对未灭菌的市政污水的C0D、氮、磷去除效果要好于对灭菌污水的处理，但是油脂含量略低于灭菌污水。【具体实施方式】如:将小球藻Chlorella sp.PF2分别接种到灭菌和不灭菌的、pH为7.5、COD含量为310mg/L、TN含量33mg/L、TP含量4.0mg/L的污水中，初始接种量为1*106个/ml，在人工光源照射下使藻种利用污水中的养分生长，培养条件为:光暗比12h:12h，光强18001ux，搅拌速率150r/min，曝气速率200ml/min，温度25°C。培养8天后，采用离心的方法收集微藻，排出处理后水。未灭菌的污水经处理后，COD, TN, TP的去除率分别为75.0%、61.6%,96.4%，收集的微藻的油脂含量为20% ;灭菌的污水经处理后，C0D、TN、TP的去除率分别为65.6%,47.4%,94.6%，收集的微藻的油脂含量为22%。
【权利要求】
1.一株同步处理市政污水和实现油脂积累的小球藻，其特征在于它为小球藻(Chlorella sp.) PF2, 保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址是北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期为2013年7月30日，保藏号为CGMCCN0.8014。
【文档编号】C12P7/64GK103468578SQ201310475780
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年10月14日 优先权日:2013年10月14日
【发明者】于艳玲, 冯玉杰, 李姗姗, 张大伟 申请人:哈尔滨工业大学